Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan

Bu floresan in situ hibridizasyon tekniğinin genel amacı, C.Elegans'taki telomer sayısını ve uzunluğunu kısa sürede analiz etmektir. Bu yöntem; tümör rejenezi, telomerlerin alternatif uzaması ve hücresel yaşlanma hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, prosedürlerin kısa olması ve telomerlerin 24 saatten kısa bir sürede görselleştirilip miktarının belirlenebilmesidir.

Gravid yetişkin solucanları, kalıntı içermeyen az miktarda sıvı besiyeri ile birlikte 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Şimdi solucanları aşağıdaki şekilde üç kez yıkayın. Toplam hacim 15 mililitre olacak şekilde M9 tamponu ekleyin.

Ardından tüpü 300 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin ve solucan peletinin üzerindeki solüsyonu atın. Sonra işlemi tekrarlayın. Eğer santrifüjasyon sonrası solucanlar yüzüyorsa, santrifüjün frenini hafifletin.

Üçüncü yıkamadan sonra, solucanları 5 mililitre M9 içerisinde bırakın. Ardından 6,5 mililitre distile su, iki mililitre hipoklorit ve bir mililitre beş molar potasyum hidroksit ekleyin. Solucanları bu ağartma solüsyonunda, 50 RPM karıştırma ile üç dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, solucanları parçalayıp yumurtalarını serbest bırakmak için vorteksleyin.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, serbest kalan yumurtaları arayın. Eğer henüz serbest kalmadılarsa, inkübasyona sekiz dakikaya kadar devam edin. Solucanlar çoğunlukla çözünmüşse ve yumurtalar serbest kalmışsa, tüpü M9 ile 15 mililitreye tamamlayın ve yumurtaları, tıpkı solucanların daha önce yıkandığı gibi üç kez yıkayın.

M9'un çoğunluğu uzaklaştırılmış yıkanmış yumurtaların hacmini PBST ile 500 microliter'e tamamlayın ve ardından 500 microliter %4 PFA ekleyin. Şimdi, %2 PFA içindeki 40 microliter'lik yumurta alikotlarını polilizin kaplı lamların kuyucuklarına yükleyin. Ardından lamları nemlendirilmiş bir hazneye aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.

Bu protokol için, kuru buz üzerinde 80 °C'de saklanan bir alüminyum blok hazırlayın. Ayrıca, metanol ve asetonu 20 °C'de saklayın. Fiksasyon adımı tamamlandıktan sonra, lamlar üzerindeki PFA solüsyonunun büyük kısmını uzaklaştırın ve yaklaşık 5 µL bırakın.

Ardından, iki kaplı yüzey birbirine yapışacak ve dokuları kuyucukta hapsedecek şekilde, her örnek lamının üzerine ikinci bir polilizin kaplı lam yerleştirin. Eğer fazla fiksatif varsa, bir mendil yardımıyla temizleyin. Şimdi, lamları en az 15 dakika boyunca soğuk alüminyum blok üzerinde tutarak dondurun.

Bu sırada, lamlar için buz üzerinde metanol ve aseton banyoları hazırlayın. Lamlar donduğunda, örneği dondurarak çatlatmak için lamlardan birini çevirin. Üstteki lamı atın ve alttaki lamı beş dakika boyunca buz soğukluğundaki metanolde bekletin.

Bunu tüm örnekler için uygulayın. Dondurarak çatlatma işlemi, probların ve antikorların sert yumurta kabuğundan içeri sızmasını sağlar. Yumurtalar başarıyla dondurularak çatlatıldıysa, yumurtaları her iki lam üzerinde de görebilirsiniz.

Metanolda en az beş dakika beklettikten sonra, lamları beş dakika boyunca soğuk asetona aktarın. Beş dakika sonra, örnekleri her bir yıkama beş dakika sürecek şekilde üç kez PBST içinde bekletin. PBST yıkamalarının ardından lamlar, dört derece celsius sıcaklıkta %100 etanol içinde birkaç gün boyunca saklanabilir.

Devam etmek için, örnek kuyucuklarına 20 µL RNaz çözeltisi ekleyin ve bunları nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, lamları 2x SSCT içerisinde, her yıkama 15 dakika sürecek şekilde iki kez yıkayın. İki yıkama işleminin ardından, örneklere 20 µL hibridizasyon çözeltisi ekleyin ve bunları nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Bu sırada, çift zincirli bir DNA probu için probu hazırlayın. Probu 95 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin ve ardından kısa bir süre buz üzerinde soğutun. Bir saat sonra, hibridizasyon solüsyonunu aspire edin ve prob solüsyonunu ekleyin.

Bu adımdan itibaren örneği ışıktan koruyun. Probu ekledikten sonra örnekleri lamellerle kapatın. Ardından 80 °C'lik bir ısı bloğu üzerinde nemlendirilmiş bir hazne oluşturun.

Isıtıcı blok tekrar 80 °C'ye sabitlendiğinde, örnek lamlarını ısıtılmış bölmeye yerleştirin ve üç dakika boyunca denatüre olmalarını bekleyin. Ardından, işlenmiş tüm lamları nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, örnekleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBST ile yıkayın.

Hazırlık aşamasında, hibridizasyon çözeltisini yıkama işleminden bir saat önce 37 °C'ye ısıtın. Ardından lamları bir hibridizasyon yıkama çözeltisi kavanozuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. Hibridizasyon çözeltisini uzaklaştırmak için örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBST ile yıkayın.

Bu işlemi üç kez tekrarlayın. Son PBST yıkamasını aspire ettikten sonra, her örneğe 20 µL bloklama çözeltisi ekleyin ve örnekleri nemlendirilmiş odacıklarda, oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Ardından bloklama çözeltisini aspire edin ve yerine 1:200 oranında seyreltilmiş FITC konjugatlı anti-digoksinin antikor çözeltisi ekleyin.

Slaytların üzerini kapatın ve oda sıcaklığında, karanlıkta üç saat boyunca inkübe edin. Antikor boyamasının ardından, örnekleri karanlıkta, her yıkama 15 dakika sürecek şekilde iki kez PBST ile yıkayın. Ardından PBST'yi aspire edin ve yerine DAPI içeren 10 µL montaj solüsyonu ekleyin.

Bir lameli yerleştirin ve fazla solüsyonu emdirin. Son olarak, lamelin kenarlarını oje ile mühürleyin ve örnekleri floresan mikroskobu altında gözlemlemeye geçin. PNA probu kullanılarak, telomer-yeterli bir mutasyondan sağ kurtulan hayvanların telomerleri gözlemlenmiştir.

Gonadlarda, çekirdek başına düşen telomer sayısı ölçülebilirdir. Telomer sinyalinin TALT1 sinyali ile aynı konumda olduğu görülmüş, bu da TALT1'in telomersiz hayatta kalmadan sorumlu olduğu düşüncesini desteklemiştir. Telomer sinyalinin yoğunluğu, yazılım kullanılarak karşılaştırılmıştır.

Sinyal, telomer eksikliği olan mutantları oluşturmak için kullanılan ata suşlara kıyasla ALT sağkalanlarında daha güçlüydü. Paraformaldehit ve formamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken eldiven takmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.