Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan In Situ ile hibridizasyon (FISH) Caenorhabditis elegans

Bu floresan in situ hibridizasyon tekniğinin genel amacı, C.Elegans'taki telomer sayısını ve uzunluğunu kısaca analiz etmektir. Bu yöntem, tümör regenezi, telomerlerin alternatif uzaması ve hücresel yaşlanma ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, prosedürlerin kısa olması ve telomerlerin 24 saatten daha kısa sürede görselleştirilebilmesi ve ölçülebilmesidir.

Yerçekimi yetişkin solucanlarını 15 mililitrelik bir tüpte döküntü içermeyen küçük bir sıvı ortamla toplayın. Şimdi solucanları aşağıdaki gibi üç kez yıkayın. Toplam 15 mililitre hacim için M9 tamponu ekleyin.

Daha sonra tüpü üç dakika boyunca 300 G'de döndürün ve çözeltiyi solucan peletinin üzerine atın. Ardından işlemi tekrarlayın. Santrifüjlemeden sonra solucanlar yüzüyorsa, santrifüj üzerindeki freni hafifletin.

Üçüncü yıkamadan sonra solucanları 5 mililitre M9 ile bırakın. Daha sonra 6.5 mililitre damıtılmış su, iki mililitre hiperklorit ve bir mililitre beş molar potasyum-hidroksit ekleyin. Solucanların bu ağartma solüsyonunda 50 RPM çalkalama ile üç dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Daha sonra solucanları kırmak ve yumurtalarını serbest bırakmak için girdaplayın.

Diseksiyon mikroskobu altında, serbest bırakılan yumurtaları arayın. Henüz serbest bırakılmamışlarsa, inkübasyona veya sekiz dakikaya kadar devam edin. Solucanlar çoğunlukla çözülürse ve yumurtalar serbest kalırsa, tüpü M9 ile 15 mililitreye kadar doldurun ve yumurtaları solucanların daha önce yıkandığı gibi üç kez yıkayın.

Yıkanmış yumurtalara, M9'un çoğu çıkarılmış olarak, hacmi PBST ile 500 mikrolitreye doldurun ve ardından 500 mikrolitre% 4 PFA ekleyin. Şimdi, polilisin kaplı slaytların kuyucuklarına% 2 PFA'da 40 mikrolitre yumurta alikotu yükleyin. Daha sonra slaytları nemlendirilmiş bir odaya aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe etmelerine izin verin.

Bu protokol için, 80 santigrat derecede saklanan kuru buz üzerinde bir alüminyum blok bulundurun. Ayrıca, 20 santigrat derecede saklanan metanol ve aseton bulundurun. Sabitleme adımı tamamlandıktan sonra, PFA çözeltisinin çoğunu slaytlardan çıkarın ve yaklaşık beş mikrolitre bırakın.

Daha sonra, her bir numune slaytının üzerine ikinci polilisin kaplı slaytları yerleştirin, böylece iki kaplanmış yüzey birbirine yapışır ve dokuları kuyucuğun içinde hapseder. Aşırı fiksatif varsa, bir mendille silin. Şimdi slaytları en az 15 dakika boyunca soğuk alüminyum bloğun üzerine yerleştirerek dondurun.

Bu arada slaytlar için buz üzerinde metanol ve aseton banyoları hazırlayın. Slaytlar donduktan sonra, numuneyi dondurmak için birini çevirin. Üst sürgüyü atın ve alt sürgüyü beş dakika buz gibi metanolde bekletin.

Bunu tüm örnekler için yapın. Donarak parçalama, probların ve antikorun sert yumurta kabuğundan nüfuz etmesine izin verir. Yumurtalar başarılı bir şekilde dondurulursa, yumurtaları her iki slaytta da görebilirsiniz.

Metanolde en az beş dakika bekledikten sonra, slaytları beş dakika boyunca soğuk asetona getirin. Beş dakika daha, numuneleri banyo başına beş dakika boyunca üç kez PBST'de bekletin. PBST yıkandıktan sonra, slaytlar birkaç gün boyunca dört santigrat derecede% 100 etanol içinde saklanabilir.

Devam etmek için, numune kuyucuklarına 20 mikrolitre RNase çözeltisi ekleyin ve bunları bir saat boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Daha sonra, slaytları yıkama başına 15 dakika boyunca iki kez 2x SSCT'de yıkayın. İki yıkamadan sonra, numunelere 20 mikrolitre hibridizasyon çözeltisi ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bu arada, probu çift sarmallı bir DNA probu için hazırlayın. Beş dakika boyunca 95 santigrat derecede denatüre edin ve ardından kısa bir süre buz üzerinde soğutun. Bir saat sonra hibridizasyon çözeltisini aspire edin ve prob çözeltisini ekleyin.

Bu adımdan itibaren numuneyi ışıktan koruyun. Probu ekledikten sonra numuneleri cam kapak fişleri ile örtün. Ardından 80 santigrat derece ısı bloğu üzerinde nemlendirilmiş bir oda yapın.

Isı bloğu tekrar 80 santigrat dereceye sabitlendiğinde, numune slaytlarını ısıtılmış odaya yerleştirin ve ardından üç dakika denatüre olmasına izin verin. Daha sonra işlenmiş tüm slaytları gece boyunca 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, numuneleri PBST'de oda sıcaklığında beş dakika yıkayın.

Hazırlık olarak, hibridizasyon çözeltisini yıkamadan bir saat önce 37 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra slaytları bir kavanoz hibridizasyon yıkama solüsyonuna yükleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Hibridizasyon çözeltisini çıkarmak için, numuneleri PBST ile oda sıcaklığında 15 dakika yıkayın.

Bunu üç kez yapın. Son PBST yıkamasını aspire ettikten sonra, her numuneye 20 mikrolitre bloke edici solüsyon ekleyin ve bunları karanlıkta bir saat boyunca oda sıcaklığında nemlendirilmiş odalarda inkübe edin. Daha sonra bloke edici çözeltiyi aspire edin ve bunu bir ila 200 arasında FITC konjuge anti-digoksigenin antikor çözeltisi ile değiştirin.

Slaytları örtün ve karanlıkta üç saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Antikor lekesinden sonra, numuneleri karanlıkta yıkama başına 15 dakika boyunca PBST ile iki kez yıkayın. Daha sonra PBST'yi aspire edin ve DAPI içeren 10 mikrolitre montaj solüsyonu ile değiştirin.

Bir kapak camı uygulayın ve fazla solüsyonu emdirin. Son olarak, kapak camının kenarlarını oje ile kapatın ve numuneleri floresan mikroskop altında gözlemlemeye devam edin. PNA probu kullanılarak, telomer açısından yeterli bir mutasyondan kurtulan hayvanların telomerleri gözlendi.

Gonadlarda, çekirdek başına düşen telomer sayısı ölçülebilir. Telomer sinyali, bir TALT1 sinyali ile birlikte lokalize edildi ve TALT1'in telomerler olmadan hayatta kalmaktan sorumlu olduğu fikrini destekledi. Telomer sinyalinin yoğunluğu yazılım kullanılarak karşılaştırıldı.

Sinyal, ALT'den kurtulanlarda, telomer eksikliği olan mutantları üretmek için kullanılan ebeveyn suşlarından daha güçlüydü. Paraformaldehit ve formamid ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.