Etanol Fiksasyonu ve DAPI Boyama: C. elegans'ta DNA'yı Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

- Bir mikroskop lamı üzerinde bir damla tampon çözeltisi ile başlayın ve sağlam solucanları damlacığa aktarın. Solucanlar yerleştirildikten sonra, tamponu emmek ve çıkarmak için tüy bırakmayan bir doku kullanın. Numuneleri birkaç kez %90 etanol ile yıkayarak numuneyi sabitleyin ve her uygulamadan sonra buharlaşmasına izin verin.

Son durulamadan sonra etanol buharlaştıktan sonra, numuneye nükleik asit boyası DAPI içeren bir çözelti ekleyin. DAPI, tercihen DNA'nın küçük oluğundaki adenin ve timin bazlarına bağlanır. Bağlandığında, DAPI-DNA kompleksi UV ışığını emer ve görünür mavi ışık yayar.

Ardından, numunenin raf ömrünü uzatmak için solmaya karşı koruyucu bir koruyucu ekleyin. Bir kapak fişi uygulayın ve slayta kapatın. Ardından, hücreye ve döngü durumuna bağlı olarak tek kromozomları, kardeş kromatid çiftlerini veya tüm çekirdekleri temsil edebilen DAPI cisimlerini görselleştirmek için mavi filtreli bir floresan mikroskobu kullanın. Bu deneyde, Caenorhabditis elegans'ın tetraploid suşlarını tanımlamak için oositlerde DAPI lekeli kardeş kromatid çiftlerini sayacağız.

- Tetraploid suşlar, döllenmemiş oositlerdeki DAPI lekeli cisimlerin sayılmasıyla doğrulanabilen 12 kromozom çiftine sahiptir. Bunu yapmak için, bir slayt üzerine beş ila on mikrolitre M9 tamponu bırakın ve damlaya altı ila 10 varsayılan tetraploid aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, M9'un çoğunu dikkatlice tüy bırakmayan bir temizleme dokusuna batırın.

Daha sonra solucanların üzerine 10 mikrolitre% 90 etanol damlatın ve etanolün tamamen buharlaşmasını izleyin. Buharlaşma biter bitmez, etanol ekleme işlemini tekrarlayın ve buharlaşmasını izleyin. Toplamda, dört uygulamada 10 mikrolitre ekleyin. Son damla buharlaştıktan sonra, mikrolitre başına iki nanogramda altı mikrolitre DAPI veya benzer bir leke ekleyin.

Slaytların uzun süreli saklanması için, solucanları piyasada bulunan veya ev yapımı bir solma önleyici içine monte edin. Sonra bir lamel ekleyin ve kenarları oje ile kapatın. Oje kuruduktan sonra slaytlar çentiklenebilir. Floresan mikroskop ve 100 x büyütme kullanın.

İlk olarak, spermatheca'nın hemen bitişiğinde olan ve henüz spermatheca'ya veya uterusa girmemiş olan en olgun döllenmemiş oositi bulun. Buradaki DAPI cisimleri muhtemelen tek kromozom çiftleridir. Daha sonra, oositin çekirdeğine odaklanın ve DAPI cisimlerini sayarken yukarıdan aşağıya yavaşça taramak için mikroskobun ince odağını kullanın. Ardından, odağı aşağıdan yukarıya doğru hareket ettirerek aynı çekirdekteki DAPI cisimlerini sayın.

Yabani tip oositlerin ortalama altı DAPI cisimciği vardır. 12 DAPI gövdesinin varlığı, bu suştaki hayvanların ya kısmi ya da tam tetraploid olduğunu gösterir. Suş başına en az 10 hayvanı analiz edin. Genellikle kromozom çiftleri çok yakın veya birbirine değecektir, bu nedenle DAPI cisimlerinin sayısı genellikle gerçek kromozom çiftlerinin sayısından daha küçüktür.