Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Bu protokolün genel amacı, biyofiziksel çalışmalar için uygun kalitede doğal bir makromoleküler kompleksi saflaştırmaktır. Bu protokol sadece bir kompleksi saflaştırmanın bir yolu olarak değil, aynı zamanda saflaştırma sırasında numunenin yapısal kalitesini değerlendirmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu protokolün ana avantajı, bileşim homojenliğini sağlamak için doğal bir düzeneğin neredeyse fizyolojik tampon koşulları altında basit ve hızlı bir şekilde saflaştırılmasına izin vermesidir.

S.cerevisiae hücrelerinin santrifüjlenmesinden ve süpernatantın metin protokolüne göre boşaltılmasından sonra, iki mililitre soğutulmuş lizis tamponu ekleyin ve peleti askıya almak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın ve / veya döndürün. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutulan 50 mililitrelik boş bir konik polipropilen santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, her bir santrifüj şişesini yıkamak için iki mililitre soğutulmuş lizis tamponu kullanın ve çözeltiyi 50 mililitrelik tüpe ekleyin.

Hücre peletinin ıslak ağırlığını belirledikten sonra, 50 mililitrelik konik polipropilen santrifüj tüpünün içinde ve çevresinde bir sıvı nitrojen banyosu oluşturun. Daha sonra, asılı hücreleri beş mililitrelik bir şırıngaya çekin ve şırıngaya 16 gauge bir iğne bağlayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu şırıngadan geçirerek dondurun ve damlacıklar oluşturmak için dakikada yaklaşık bir mililitre hızında banyoya iğne yapın.

Maya hücrelerini parçalamak için, bir kahve değirmenini önceden soğutmak için sıvı nitrojen kullanarak başlayın. Daha sonra 40 grama kadar maya hücresi ekleyin ve 25 saniye boyunca öğütün, öğütme işlemini sekiz veya dokuz kez tekrarlayın. Bir seferde 10 litreden fazla hücre kültürü için saflaştırma yapılmaması önerilir.

Bu, saflaştırma süresini en aza indirir ve kompleksin yapısal bütünlüğünün korunmasını sağlar. Her iki öğütme turundan sonra, öğütücüye sığ bir sıvı nitrojen tabakası ekleyin ve buharlaşmasına izin verin. Hücrelerin topaklanmasını önlemek için, hücreleri karıştırmak için sıvı nitrojenle soğutulmuş bir spatula kullanarak hücrelerin çözülmesini önleyin.

Lizizi takiben, hücreler ince beyaz bir toz olarak görünmelidir. Hücre lizizini kontrol ettikten ve metin protokolüne göre PMSF, DTT ve proteaz inhibitörleri ile lizis tamponu hazırladıktan sonra, donmuş parçalanmış hücre tozunu tamponun hazırlanan 50 mililitrelik tüplerine aşamalı olarak almak için sıvı nitrojenle soğutulmuş bir spatula kullanın. Eklenen her artışla, hücreleri çözmek ve çözmek ve kabarcıkların oluşmasını önlemek için 50 mililitrelik tüpleri oda sıcaklığında hafifçe döndürün.

Hücreler çözündükçe, daha fazla hücre tozu ekleyin. Tüm hücreler eklendikten sonra, tüplerde donmuş hücre kümeleri gözlenmeyene kadar hücreleri çözmeye ve çözmeye devam edin. Bu işlem yaklaşık 50 dakika sürmelidir.

Daha sonra, hücre lizatını 20 dakika boyunca 25.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Hücreler parçalandıktan ve santrifüjlemeyi takiben, çözünmeyen topakta küçük bir koyu tabaka gözlemleyebilirsiniz. Süpernatanı polikarbonat ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve her dolu tüpe 10 mikrolitre 200 milimolar PMSF ekleyin.

Numuneleri bir saat boyunca 100.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Dönüşün sonunda dört katman görünür olmalıdır. Çoğunlukla ribozomal kompleksler içeren sert berrak bir topak; yumuşak, lipit açısından zengin bir topak; hücrenin çözünür proteinlerinin ve komplekslerinin çoğunu içeren büyük, berrak, sarıya çalan bir tabaka; ve lipitlerden oluşan pullu bir üst tabaka.

Dört santigrat derecede soğuk bir odada, üst pullu lipit tabakasının mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın ve atın. Berrak sarı tabakanın çoğunu geri kazanmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Ardından, alttaki iki katmanı rahatsız etmemek için bir mililitrelik bir pipet kullanarak, bu katmanın son birkaç mililitresini geri kazanın.

40 gram ıslak hücre peletinden tipik olarak orta tabakanın yaklaşık 48 mililitresi geri kazanılır. Metin protokolüne göre IgG sefarozu hazırladıktan sonra, IGG reçinesini 40 gram hücre başına orta faz süpernatan ve iki mini proteaz inhibitör tableti ile birleştirin. Daha sonra iki saat boyunca dört santigrat derecede bir döndürücüye yerleştirin.

Bu, IgG toplu çözümüdür. Düz bir açıklık elde etmek için sütunların uçlarını keserek iki adet 10 mililitrelik poliprep sütunu hazırlayın. Her bir sütuna 24 mililitre askıda IgG reçine bulamacını veya toplu çözeltiyi dökün ve yerçekimi ile tortulaşmaya bırakın.

Bu, 200 mikrolitre paketlenmiş IgG reçinesine karşılık gelir. Sedimantasyon 30 dakikadan uzun sürerse, orta faz lipitlerle kontamine olmuş olabilir. Sedimantasyon tamamlandığında, paketlenmiş sütunu yıkamak için dört ardışık 10 mililitre hacimde IgG D150 tamponu kullanın.

Sütun üzerinde tütün aşındırma virüsü veya TEV proteaz bölünmesi yapmak için, sütunun altını kapatın ve bir mililitre IgG D150 tamponu ve 100 mikrolitre TEV proteaz ekleyin. Kolonun üstünü kapatın ve 750 RPM ve 18 santigrat derecede bir termal karıştırıcı kullanarak 20 dakika karıştırın. Reçineyi tekrar askıya alın ve 20 dakika boyunca tekrar karıştırın.

Ardından 20 dakikalık karıştırmayı yeniden askıya alın ve üçüncü kez tekrarlayın. Sütunu dört santigrat dereceye getirin ve protein kompleksini çıkarmak için yerçekimini kullanın. Ardından, ölü hacmi gidermek için 200 mikrolitre IgG D150 ekleyin.

Kalyolin afinite reçinesini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, kalmodulin bağlama tamponunu ve numuneyi reçineye ekleyin ve bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe etmek için bir tüp döndürücü kullanın. Düz bir açıklık oluşturmak için kolonun ucunu keserek 100 mikrolitre kalmodulin bulamacı başına iki mililitrelik bir poliprep sütunu hazırlayın. Protokol, kompleksi konsantre tutmak ve reçine kalma süresini en aza indirmek için seçilen belirli tampon ve kalma hacimlerini detaylandırır.

Kültürel hacim değiştirilirse, değişikliği hesaba katmak için yerçekimi kolonlarının reçine ve tampon hacimlerinin değiştirilmesi önerilir. Sütunu 100 mikrolitreden fazla kalmodulin bulamacı ile paketleyin ve yerçekimi ile reçineyi üç kez yıkamak için 5 mililitre kalmodulin bağlama tamponu kullanın. 200 mikrolitre kalmodulin elüsyon tamponu kullanarak, proteini üç kez elüte edin.

Daha sonra, kolonun altını kapatın ve 20 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve contayı serbest bırakmadan ve proteinin yerçekimi ile elüsyon yapmasına izin vermeden önce 2,5 dakika inkübe edin. Kolonun altını tekrar kapatın ve beş dakika inkübe etmeden önce 200 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Ardından, sütunun altını açın ve çözeltiyi çıkarın.

Altıncı ve son elüsyon için, kolonun altını kapatın ve 10 dakika boyunca elüsyon tamponu ile inkübe edin. Ardından, mührü açın ve kaldırın. Saflaştırma sonrası analiz yapın ve numuneleri metin protokolüne göre saklayın.

Burada gösterildiği gibi, yayınlanmış bir protokolü takiben kompleksin ilk TAP saflaştırılması, gümüş lekeli bir jel üzerinde üç bant olarak göç eden bir kompleks verdi. TAP yönteminin birden fazla optimizasyon turu, bize daha homojen bir montajın göstergesi olan doğal bir jel üzerinde tek bir bant olarak göç eden bir kompleks verir. Doğal jel sonucu ile tutarlı olarak, yayınlanan protokole göre saflaştırılan komplekse karşı bir TAP antikoru kullanılarak yapılan western blotlama, TAP etiketli protein SNU-71'in proteolizini tespit etti.

U1 snRNP kompleksindeki 17 proteinin neredeyse tamamı SDS-PAGE ile çözüldüğünden ve çoklu kütle spektrometresi ile pozitif olarak tanımlandığından, TAP yönteminin modifikasyonları proteoliz miktarını önemli ölçüde azaltmıştır. Negatif leke elektron mikroskobu, TAP'ın birinci ve ikinci adımlarından sonra başarılı bir saflaştırmadan elde edilen monodispers parçacıkları gösterir. Buna karşılık, saflaştırma başarısız olduğunda doğru boyutta hiçbir parçacık gözlenmez.

Nihai kompleks kalitesi, burada gösterilen, negatif leke EM ham görüntüsünde monodispers görünen saflaştırılmış parçacıklardan oluşan bir çim üzerinde değerlendirildi. Ek olarak, parçacıkların sınıf ortalamaları, numunenin muhtemelen yapısal çalışma için uygun olduğunu gösteren farklı özellikler ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol donmuş parçalanmış hücre tozunun çözülmesinden sonraki 10 ila 12 saat içinde tamamlanabilir.

Bu protokolü takip ederken, tüm çözeltilerin proteaz ve nükleaz içermediğinden emin olmak ve kompleksin toplanmasını veya ayrışmasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, yapısal çalışma için uygun kalitede yerel bir kompleksin nasıl saflaştırılacağını ve bunun başarıldığını nasıl değerlendireceğinizi anlamalısınız.