Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Bu protokolün genel amacı, biyofiziksel çalışmalar için uygun kalitede doğal bir makromoleküler kompleksi saflaştırmaktır. Bu protokol sadece bir kompleksi saflaştırma yolu olarak değil, aynı zamanda saflaştırma sırasında numunenin yapısal kalitesini değerlendirmek için ayrıntılı bir kılavuz olarak hizmet eder. Bu protokolün temel avantajı, bileşimsel homojenliği sağlamak amacıyla doğal bir topluluğun fizyolojik koşullara yakın tampon koşullar altında basit ve hızlı bir şekilde saflaştırılmasına olanak tanımasıdır.

S.cerevisiae hücrelerinin santrifüj edilmesinin ve üst fazın metin protokolüne uygun olarak dökülmesinin ardından, iki mililitre soğutulmuş lizis tamponu ekleyin ve peleti süspande etmek için çözelterek karıştırın ve/veya 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutulan boş bir 50 mililitrelik konik polipropilen santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, her bir santrifüj şişesini yıkamak için ek iki mililitre soğutulmuş lizis tamponu kullanın ve bu çözeltiyi 50 mililitrelik tüpe ekleyin.

Hücre peletinin ıslak ağırlığı belirlendikten sonra, 50 mililitrelik konik polipropilen santrifüj tüpünün içine ve çevresine sıvı azot banyosu hazırlayın. Ardından, süspansiyondaki hücreleri beş mililitrelik bir şırıngaya çekin ve şırıngaya 16 gauge bir iğne takın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu şırınga ve iğne aracılığıyla damlacıklar oluşturacak şekilde, yaklaşık olarak dakikada bir mililitre hızla banyoya aktararak dondurun.

Maya hücrelerini liz etmek için, önce bir kahve öğütücüsünü sıvı azot kullanarak ön soğutma işlemine tabi tutun. Ardından 40 grama kadar maya hücresi ekleyin ve öğütme işlemini sekiz veya dokuz kez tekrarlayarak her seferinde 25 saniye boyunca öğütün. Tek seferde 10 litreden fazla hücre kültürünün saflaştırılmaması önerilir.

Bu işlem saflaştırma süresini minimize eder ve kompleksin yapısal bütünlüğünün korunduğunu sağlar. Her iki öğütme turundan sonra, öğütücüye sığ bir sıvı azot tabakası ekleyin ve buharlaşmasını bekleyin. Hücrelerin topaklanmasını önlemek için, hücreleri karıştırmak amacıyla sıvı azotla soğutulmuş bir spatula kullanarak hücrelerin çözünmesini engelleyin.

Liz sonrası hücreler ince beyaz bir toz şeklinde görünmelidir. Hücre lizini kontrol edip metin protokolüne göre PMSF, DTT ve proteaz inhibitörleri içeren liz tamponu hazırladıktan sonra, donmuş liz edilmiş hücre tozunu sıvı azotla soğutulmuş bir spatula ile hazırlanan 50 mililitrelik tampon tüplerine azar azar aktarın. Eklenen her porsiyondan sonra, hücrelerin çözünmesini ve erimesini sağlamak ve kabarcık oluşumunu önlemek için 50 mililitrelik tüpleri oda sıcaklığında nazikçe döndürün.

Hücreler çözündükçe, daha fazla hücre tozu ekleyin. Tüm hücreler eklendikten sonra, tüplerde donmuş hücre kümeleri gözlemlenmeyene kadar hücreleri çözdürme ve eritme işlemine devam edin. Bu işlem yaklaşık 50 dakika sürmelidir.

Ardından, hücre lizatını 25.000 ×g'de ve dört °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreler lize edildikten ve santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, çözünmeyen pelet içerisinde küçük, koyu renkli bir tabaka gözlemleyebilirsiniz. Süpernatantı polikarbonat ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve her bir dolu tüpe 10 µL 200 mM PMSF ekleyin.

Numuneleri 100, 000 ×g'de ve dört °C'de bir saat boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme sonunda dört katman görünür olmalıdır: çoğunlukla ribozomal kompleksler içeren sert, berrak bir pelet; yumuşak, lipidce zengin bir pelet; hücrenin çözünür proteinlerinin ve komplekslerinin çoğunu içeren geniş, berrak, sarımsı bir katman ve lipidlerden oluşan pullu bir üst katman.

Dört °C sıcaklıktaki soğuk odada, üstteki pullu lipid tabakasının mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırmak ve atmak için bir mL'lik pipet kullanın. Berrak sarı tabakanın çoğunu geri kazanmak için 10 mL'lik serolojik pipet kullanın. Ardından, alttaki iki tabakayı rahatsız etmemek için bir mL'lik pipet kullanarak bu tabakanın son birkaç mililitresini geri kazanın.

40 gram ıslak hücre pelletinden, tipik olarak orta katmandan yaklaşık 48 mililitre geri kazanılır. IgG sepharose'u metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, IgG reçinesini orta faz süpernatantı ve 40 gram hücre başına iki mini proteaz inhibitör tableti ile birleştirin. Ardından, iki saat boyunca dört santigrat derecede bir rotatöre yerleştirin.

Bu, IgG grup çözeltisidir. Kolonların uçlarını keserek düz bir açıklık oluşturup iki adet 10 mililitrelik polyprep kolonu hazırlayın. Her bir kolona 24 mililitre süspande IgG reçine bulamacı veya grup çözeltisi dökün ve yerçekimi ile çökelmesini bekleyin.

Bu, 200 µL paketlenmiş IgG reçinesine karşılık gelir. Çökelme 30 dakikadan daha uzun sürerse, orta faz lipidler tarafından kontamine olmuş olabilir. Çökelme tamamlandığında, paketlenmiş kolonu yıkamak için ardışık dört kez 10 mL IgG D150 tamponu kullanın.

Kolon üzerinde tütün oyma virüsü veya TEV proteaz kesimi gerçekleştirmek için kolonun alt kısmını kapatın ve bir mililitre IgG D150 tamponu ile 100 µL TEV proteaz ekleyin. Kolonun üst kısmını kapatın ve 750 RPM ile 18 °C'de bir termal karıştırıcı kullanarak 20 dakika boyunca karıştırın. Reçineyi yeniden süspande edin ve tekrar 20 dakika boyunca karıştırın.

Ardından tekrar süspansiyon haline getirin ve 20 dakikalık karıştırma işlemini üçüncü kez tekrarlayın. Kolonu dört derece Celsius'a geri getirin ve protein kompleksini elüye etmek için yerçekimini kullanın. Daha sonra, ölü hacmi elüye etmek için 200 microliters IgG D150 ekleyin.

Metin protokolüne uygun olarak kalmodulin afinite reçinesi hazırlandıktan sonra, kalmodulin bağlama tamponu ve örnek reçineye eklenir ve bir tüp rotatörü kullanılarak dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat boyunca inkübe edilir. Kolonun ucunu kesip düz bir açıklık oluşturarak her 100 mikrolitre kalmodulin süspansiyonu başına iki mililitrelik bir polyprep kolonu hazırlayın. Protokol, kompleksi konsantre tutmak ve reçinedeki kalış süresini en aza indirmek amacıyla seçilmiş spesifik tampon ve kalış hacimlerini detaylandırmaktadır.

Kültür hacmi değiştirilirse, bu değişikliği hesaba katmak için yer çekimi kolonlarının reçine ve tampon hacimlerinin de değiştirilmesi önerilir. Kolonu 100 µL'den fazla olmayan kalmodulin süspansiyonu ile doldurun ve yer çekimi yardımıyla, reçineyi üç kez yıkamak için 5 mL kalmodulin bağlama tamponu kullanın. Proteini üç kez elüye etmek için 200 µL kalmodulin elüsyon tamponu kullanın.

Ardından, kolonun altını kapatın, 20 µL elüsyon tamponu ekleyin ve mühürü açıp proteinin yerçekimi ile elüye olmasına izin vermeden önce 2,5 dakika inkübe edin. Kolonun altını tekrar kapatın ve beş dakika inkübe etmeden önce 200 µL elüsyon tamponu ekleyin. Daha sonra, kolonun altındaki mühürü açın ve çözeltiyi elüye edin.

Altıncı ve son elüsyon için kolonun altını kapatın ve 10 dakika boyunca elüsyon tamponu ile inkübe edin. Ardından, kapatmayı kaldırın ve elüsyonu gerçekleştirin. Saflaştırma sonrası analizi yapın ve numuneleri metin protokolüne uygun olarak saklayın.

Burada gösterildiği üzere, yayınlanmış bir protokol izlenerek gerçekleştirilen kompleksin başlangıç TAP saflaştırması, gümüş boyama yapılmış jelde üç bant şeklinde göç eden bir kompleks sağlamıştır. TAP yönteminin defalarca optimize edilmesi, yerli (native) jelde tek bir bant şeklinde göç eden ve daha homojen bir birleşime işaret eden bir kompleks elde etmemizi sağlamıştır. Yerli jel sonucuyla tutarlı olarak, yayınlanmış protokole göre saflaştırılan kompleks üzerinde TAP antikoru kullanılarak yapılan western blotting, TAP etiketli SNU-71 proteininin proteoliz olduğunu saptamıştır.

TAP yönteminde yapılan modifikasyonlar proteoliz miktarını önemli ölçüde azaltmıştır; nitekim U1 snRNP kompleksindeki 17 proteinin neredeyse tamamı SDS-PAGE ile çözümlenmiş ve multi kütle spektrometrisi ile pozitif olarak tanımlanmıştır. Negatif boyama elektron mikroskopisi, TAP'ın birinci ve ikinci adımlarından sonra başarılı bir saflaştırma sonucunda monodispers partiküller göstermektedir. Buna karşın, saflaştırma başarısız olduğunda doğru boyutta herhangi bir partikül gözlemlenmez.

Final kompleks kalitesi, burada gösterilen ve negatif boyama EM ham görüntüsünde monodisperse görünen saflaştırılmış partikül tabakası üzerinde değerlendirilmiştir. Ayrıca, partiküllerin sınıf ortalamaları, örneğin yapısal çalışma için muhtemelen uygun olduğunu gösteren belirgin özellikler ortaya koymaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu protokol, dondurulmuş lize hücre tozunun çözülmesinden sonra 10 ila 12 saat içinde tamamlanabilir.

Bu protokolü takip ederken, tüm solüsyonların proteaz ve nükleazlardan arındırılmış olduğundan emin olmak ve kompleksin agregasyonunu veya disosiyasyonunu önlemek için hızlı çalışmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, yapısal çalışma için uygun kalitede bir nativ kompleksi nasıl saflaştıracağınızı ve bunun başarıldığını nasıl değerlendireceğinizi anlamış olmalısınız.