Name: Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin, S. cerevisiae hücrelerinden Tandem Affinity Purification yöntemiyle yerli makromoleküler kompleksleri saflaştırmayı ve biyofiziksel çalışmalar için yapısal kalite değerlendirmesi yapmayı.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Nikolaus Grigorieff'in desteği ve tavsiyesi için minnettardır. Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu ve Mike Rigney'e yararlı tartışmalar ve EM rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı, Ödül No. 1157892 tarafından finanse edildi. Brandeis EM tesisi, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi P01 GM62580 tarafından desteklenmektedir.

Not: Aşağıdaki protokol hücre kültürünün 4 L, hücrelerin yaklaşık 40 g ıslak ağırlık bir kompleks saflaştırılması için geliştirilmiştir. Hazırlandıktan sonra, bütün tamponlar, 4 ° C&#39;de saklanır ve bunların hazırlanması ve bir ay içinde kullanılmalıdır. İndirgeme maddesi ve proteaz inhibitörleri, sadece kullanımdan hemen önce tampon eklenir. Tandem afinite temizliği için tam hücre özütünün hazırlanması 1. <ol><li> S. Büyüme cerevisiae hücreleri <ol><li> Streak istenen TAP S. etiketli cerevisiae cinsi depolama (-80 ° C) bir maya pepton dekstroz üzerine (YPD) plaka. maya hücreleri ve beyaz kabarık görünene kadar, 5 gün boyunca (30 ° C) - 3 inkübe edin. </li><li> 50 mL.lik bir konik propilen santrifüj tüpü içinde 10 mi YPD ortamı içine plaka taze hücre yaklaşık olarak 2 mm bir 2 çizgi inoküle. dakikada 180 devir (rpm) bir gecede (° C 30m) tüp sallayın. </li><li> over 2 ml aşılamak2 L&#39;lik Erlenmeyer veya konik bir şişe içinde YPD ortamı litre başına gece kültürü. 180 rpm&#39;de (30 ° C) çalkalanır. - 24 saat, eski kütük fazı kadar 2 1.8 OD 600, tipik olarak 20 ile 600 nm (OD 600) bir optik yoğunlukta hücre büyümesini izlemek. </li></ol></li><li> Hasat S. cerevisiae hücreleri <ol><li> santrifüj ile hasat hücreler 15 dakika boyunca (4 ° C) 5,400 xg&#39;de. </li><li> Hızla süpernatant süzün ve 4 ° C&#39;de veya buz üzerinde hücreleri tutun. </li><li> Liziz Tamponu soğutulmuş 2 ml hücre peleti, her litre Askıya (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 300 mM NaCI, 10 mM KCI, 0.2 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM imidazol, pH 8.0;% 10 gliserol;% 0.1 h / h NP-40). dönen ve / veya tekrar pipet 10 ml serolojik pipet kullanarak hücreleri Askıya. Not: NP-40 önemini kompleks kalite ve post-arıtma analizi aşağıda ele alınmıştır ile ilgilidir. </li><li> Boş 50 ml konik polipropilen santrifüj tüpü k içine hücre süspansiyonu aktarınBuz üzerinde EPT&#39;nin. soğutulmuş lizis tamponu ek olarak 2 ml, her bir santrifüj yıkama şişesi ve 50 ml bir tüp içinde hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> tüp tartı ve boş tüpün ağırlığını çıkararak yanı sıra ilave Lizis Tampon ile hücre pelet ıslak ağırlığını belirlemek. Not: OD 1.8 600 olan hücre kültüründen bir litrelik yaklaşık 10 gramdır. </li><li> 50 mL.lik bir konik propilen santrifüj tüpü içinde bir sıvı azot banyosu oluşturur. 5 ml&#39;lik bir şırınga içine süspansiye edilmiş hücreler çizin. şırıngaya 16 G iğne bağlayın. Hücre oluşturmak için şırınga / iğne ile geçirilerek hücre süspansiyonu dondurma &quot;damlacıkları&quot;. dondurma oranı, yaklaşık 1 dakika / ml olmalıdır. </li><li> Donmuş hücre damlacıkları saklayın (-80 ° C) veya lizis geçin. </li></ol></li><li> Hücrelerin eritilmesi ve lizat Açıklama <ol><li> Lyse bir kahve değirmeni kullanarak maya hücreleri. c çalkalanırken 25 sn, patlamaları taşlama ile lyse hücreleri sekiz dokuz kereoffee değirmeni. Kullanımdan önce, sıvı azot ile birlikte kahve değirmeni önceden soğuk. öğütme Her iki tur, öğütücü sıvı azot sığ bir katman ekleyin ve buharlaşması için izin verir. </li><li> topaklanma hücreleri tutmak için gerekli bir sıvı azot soğutulmuş spatula ile karıştırın. Hücre topaklanma neden olabilir hücrelerin çözülme önlemek için dikkatli olun. Hücreler, aşağıdaki ince beyaz bir toz olarak görünmelidir. Maya kültürü (~ 40 g) 4 L bir maksimum hücre peleti aynı anda zemin olabilir. Not: liziz yöntemi ile ilgili gözlemler aşağıda tartışılmaktadır. </li><li> Bir hemasitometre veya alternatif hücre sayım yöntemi kullanılarak hücre parçalama derecesini değerlendirin. Yeterli bir analiz sağlamak için, aşağıdaki örnekleri almak: (1) lizis önce; (2) lizis dört tur sonra; ve (3) lisizini takiben. Bu örnekleri kontrol etmek için, 1.5 ml bir tüp içinde bir sıvı azot soğutulmuş spatula ve yer ile hücrelerin küçük bir miktar alır. </li><li> hücre hücreler çözündürüldü sonra pipet 5 ulve 495 ul su ile karıştırın. 40 - eğer hücrelerin% 60 erimesi görülmektedir, protokolde bir sonraki adıma geçin. Not: lizis uzun süre etkisi ile ilgili gözlemler aşağıda ele alınmıştır. </li><li> Bir kez yeterli lizis görülmektedir, mağaza parçalanmış hücreleri (-80 ° C) veya bir sonraki adıma geçin. </li><li> 1 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), 1 mM ditiotreitol (DTT) ve proteaz inhibitörleri ticari olarak temin edilebilen bir kokteyl içeren 15 mi liziz tamponu ile her biri iki 50 ml konik propilen santrifüj tüpü hazırlayın. Not: önemli proteoliz görülürse, bir proteaz eksik suşu kullanımını düşünün. </li><li> hazırlanan 50 ml tüpler içinde dondurulmuş Parçalanan hücre tozu kepçe için bir sıvı azot soğutulmuş ıspatula ile yapılır. indirgeyici ve proteaz inhibitörü (lar) hem de içeren, Lizis Tamponu kademeli olarak katı hücre tozu / ekleyin. </li><li> Çözülme olarak / şekillendirme kabarcıklarını engellemek için de hücrelerin erimesi, ama çok nazikçe oda sıcaklığında 50 ml tüpler döndürün. birHücre toz / katı erir, ek hücreye katı / tozu ekleyin s. </li><li> Her biri yaklaşık 20 hücre g veya ilave tüm hücreleri sahip olana kadar iki kez 50 ml tüpler her doldurun. 50 ml tüpler gözlenen donmuş hücre kümeleri vardır kadar çözülme / çözülmesini devam edin. Bu yaklaşık 50 dakika sürer. </li><li> 25,000 xg (4 ° C) &#39;de 20 dakika süre ile süspansiyon haline hücre lizat santrifüj. İyi lize hücreler, siyah bir çökelti az miktarda sergileyebilir. </li><li> ultra santrifüj tüpleri (kullanılan 26.3 mi tüpler) polikarbonat ve her tam bir tüpe 10 ul 200 mM PMSF ilave süpernatant 50 ml aktarın. </li><li> 100,000 x g&#39;de (4 ° C) 1 saat süre ile santrifüj. Dört katmanları üst alttan, görünür olmalıdır: (1) sert açık pelet, ribozomal kompleksleri içeren; (2) Yumuşak lipid bakımından zengin pelet; (3) hücre çözünür proteinler ve komplekslerinin en ihtiva eden bir büyük, açık san bir hafif boyanmış tabakası; ve (4) bir &#39;pullu&#39; üst tabaka lipidlerin oluşturduğu. </li><li> Tüm s gerçekleştirinSoğuk oda (4 ° C) ubsequent adım. 1 ml pipet kullanarak mümkün olduğunca üst &#39;pullu&#39; lipit tabakasının kadar çıkarın ve atın. sarı, berrak tabakanın en kurtarmak için 10 ml serolojik pipet kullanın. </li><li> Alt iki tabaka rahatsız etmemek için 1 ml bir pipet kullanarak bu katmanın son birkaç ml kurtarma. 40 g ıslak hücre topağından, orta tabakanın, yaklaşık 48 mi, tipik olarak geri kazanılır ve lipid tabakasının 8 mi atılır / çıkarıldı. Not: Sütun arıtma akışı büyük ölçüde aşağıda ele, aynı zamanda karmaşık kalitesini düşürebilir lipidlerin, varlığı ile engellenmektedir. </li></ol></li></ol> 2. Sütun Arıtma adım 1: IgG Kromatografi <ol><li> Reçine Dengeleme ve Bağlama <ol><li> Hücre topağı 40 g için 300 ul IgG Sepharose bulamaç hazırlanır. bulamaç pipetleme kolaylaştırmak için 1 ml pipet ucu sonu kesin. Yıkama / 5 mi IgGD150 Buffe IgG, reçineyi üç defa, her seferinde dengeR (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 150 mM NaCI; 150 mM KCI, 1 mM MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8;% 0.1 h / h NP-40, 1 mM DTT, 50 her bir proteaz inhibitörü tablet ml hacim). <ol><li> Spin yıkar arasında 160 xg (4 ° C) pelet ve süpernatant kaldırmak için. </li></ol></li><li> 2 saat (4 ° C), uygun bir rotator kullanılarak orta safha süpernatan ve hücrelerin 40 gramı başına iki mini proteaz inhibitör tabletleri ile IgG reçine döndürün. Bu, IgG toplu bir çözümdür. </li><li> Düz kesilmiş üretilmesi için kolonun son kesim tarafından kullanılmak üzere iki adet 10 ml poli-preparatif sütun hazırlayın. yerçekimi akışı ile sütunun paketleme ve yıkama hızlandırmak için, ~ 10 mi kolon başına IgG parti çözeltisine 25 mL, 200 paketlenmiş IgG reçine ul veya daha düşük bir maksimum yük. </li><li> sütuna IgG toplu çözüm dökün ve yerçekimi ile tortu izin verin. sedimantasyon 30 dakika daha uzun sürerse santrifüj t orta faz kurtarırken, büyük olasılıkla lipit kontaminasyonu olduUBE. </li><li> IgGD150 Tamponu dört ardışık 10 ml&#39;lik hacim ile kaplanmış kolon yıkayın. </li></ol></li><li> Sütun TEV bölünmesine <ol><li> Sütunun alt conta ve IgGD150 1 ml tampon TEV proteaz, 100 ul (0.6 mg / ml stok, TEV mutant varyantı S219V içi üretilen). Sütunun üst kapatılır ve 20 dakika boyunca (18 ° C) 750 rpm&#39;de çalkalanarak, termal bir mikser kullanılarak karıştırılır. Yeniden süspanse Reçine 1 saat inkübasyon olmak üzere toplam tekrar 20 dakika boyunca bir kez daha fazla karıştırıp. Not: en az fırınlama süresi kalması açısından çok önemlidir. </li><li> 4 ° C&#39;ye sütun dönün ve yerçekimi ile protein / kompleksi Zehir. IgGD150 Tamponu ilave 200 ul ölü hacim Zehir. </li></ol></li></ol> 3. Kolonu Saflaştırması Adım 2: Kalmoduline Afinite Kromatografisi <ol><li> Reçine Dengeleme ve Bağlama <ol><li> Hücrenin 40 g başına kalmodülin-afınite reçine 200 ul hazırlanmasıpelet. 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 5 mi Kalmoduline Tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, bağlama ile, reçineyi üç defa, her seferinde yıkayın 1 mM MgCl2, 5 mM imidazol, pH 8; 2 mM CaCl2 0.1 hac / hac% NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol), 160 xg (4 ° C) santrifüje her bir yıkama için pelet. </li><li> her biri 1 mi IgG eluatına, Bağlama Tamponu kalmodulin 3 cilt. Sürekli kalsiyum seviyesini korumak için, CaCl2 ve β-merkaptoetanol IgG elüsyon bu bileşenlerin olmaması için hesap ekleyin. Nihai konsantrasyon 2 mM CaCl2 ve 10 mM β-merkaptoetanol olmalıdır. </li><li> Kalmodulin reçineye örnek ekleyin ve bir tüp rotator ile 1 saat (4 ° C) bağlanır. </li></ol></li><li> Paketleme ve Calmodulin Reçine yıkanan <ol><li> Düz açılış oluşturmak için sütunun sonuna keserek 100 ul Calmodulin bulamaç başına 2 ml poli-hazırlık sütun hazırlayın. co başına en fazla 100 ul Calmodulin bulamaç yükleyinörnek reçine miktarını en aza indirmek için lumn elüsyon sırasında temas. </li><li> yerçekimi tarafından sütunu Paketi ve 5 ml Calmodulin Bağlama Tamponu ile sütunda üç kez reçine yıkayın. </li><li> 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 1 mM MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8.0, 4 mM EGTA, pH 8,0;% 0.08 h 200 ul Kalmoduline, Seyreltme Tampon maddesi (10 mM Tris-HCI, pH 8.0 ilavesi ile proteinini ayrıştırmak / hac NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol). Calmodulin Elüsyon Buffer 200 ul altı kez eklenmesini tekrarlayın. </li><li> elüsyon 1 ila 3 için, sütun hacmi uygulamak ve hemen eluat toplar. elüsyon 4, sütunun alt conta ve 2.5 dakika boyunca yıkama tamponu ile inkübasyon ve daha sonra açmak ve yerçekimi ile elüte sağlar. elüsyon için 5, 5 dakika boyunca inkübe edilir ve akabinde açmak ve elüte. elüsyon 6 için, 10 dakika süre ile inkübe edilir ve daha sonra açmak ve elüte. Not: karmaşık bütünlüğü elüsyon arasında değişebilir / kesirler (temsilcisi sonuçları bölümüne bakınız) &lt;./ Li&gt; <li> elüsyon 2 ayrı gecede uygun bir mikro diyaliz yöntemi kullanarak 6 dialyze. Diyaliz tamponu karşı fraksiyonların Dialyze (10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 150 mM NaCI, 10 mM KCI, 1 mM MgCI2, 5 mM imidazol, pH 8, 10 mM β-merkaptoetanol). Not: NP-40 diyaliz zarı ile, hiç değilse, kayda değer geçmez. </li></ol></li></ol> 4. Post-Arıtma Analizleri Kompleks kalitesini değerlendirmek için <ol><li> Yerli Jel ve Gümüş Boyama <ol><li> üreticinin talimatlarına göre kompleksin analizi için% 16 prekast yerli jel - 4 hazırlayın. jel üzerine diyaliz Kalmoduline elüsyon / parçalardan her biri, uygun bir molekül ağırlığına sahip protein standardı ve yük 15 ul kullanın. </li><li> Yaklaşık 3 saat (4 ° C), 150 V de jel Electrophorese. </li><li> Gümüş, altı elüsyon her kalitesini değerlendirmek için jel leke. Alternatif olarak, eşit hassas ticari kullanımıfloresan leke (ler). Bu aşamada, kompleksin konsantrasyonu Mavi Coomassie lekelemesi için saptama seviyesinin altında en olasıdır. </li></ol></li><li> Ek Jel Analiz Yöntemleri <ol><li> Western blot protein tespit etmek için SDS veya yerel PAGE ile kompleks çözmek ve daha sonra üreticinin talimatlarına uygun olarak TAP etiketi antikor kullanarak Calmodulin Binding Peptide (CBP) epitop için jel prob. </li><li> Belirli bir floresan boya (lar) kullanılarak, TAP saflaştınldı karmaşık varlığı ve protein ve / veya nükleik asit bütünlüğünü onaylamak. Hiçbir spektral örtüşme bu lekeler arasında tespit edildiği dikkat ediniz. </li></ol></li><li> Negatif Leke Elektron Mikroskobu Görselleştirme <ol><li> Karmaşık uygulama 30 dakika içinde, parlayan taburcu 30 saniye boyunca -15 mA sürekli karbon ızgaraları kullanın. </li><li> ızgaraya (tipik olarak 1 nM&#39;lik bir konsantrasyonda) TAP saflaştınldı kompleks 3 ul uygulanır. Bir dakika boyunca inkübe. Leke fFazla tampon kaldırmak için ızgaranın yan rom. </li><li> iyonu giderilmiş su, 20 ul damlalar ile iki kez yıkanır. yıkar arasında yan leke. </li><li> 50 ul negatif leke damlasına kadar ızgara uygulayın ve bir dakika inkübe edilir. uranil asetat (% 2) ya da uranil format (% 0.75) ile boyama önerilir. Dikkat: Uranil tuzları ve çözümleri zayıf radyoaktif ve ağır metal içermez. Bu bakım ve kurumsal önerilen atık yönergeleri izleyerek atılmalıdır bu çözümler ile temas tüm malzeme ile ele alınmalıdır. </li><li> blot olmadan taze bir 50 ul negatif leke damlasına kadar ızgara uygulayın. Bir dakika sonra yan blot inkübe ve nihayet kuru hava ve görselleştirmek. </li></ol></li><li> Cryo Elektron Mikroskobu (cryo-EM) Görselleştirme <ol><li> optimizasyon gerekli olabilir ama üreticinin protokolüne göre, TAP saflaştınldı kompleksi ile kriyo-EM gerçekleştirin. Not: deterjan Durum yüksek konsantrasyonlarda ma aty ilerlemeyi engelleyen ve aşağıda ele alınmıştır. </li></ol></li></ol> 5. Karmaşık depolama <ol><li> Depolama Kompleks hazırlanıyor <ol><li> Gerekirse kompleks için uygun bir molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre kullanılarak, karmaşık konsantre edilir. İstenilen konsantrasyon ulaşana kadar 1 dk artışlarla 14,000 xg&#39;de Spin. Not: Filtre, ne de diyaliz zarından geçmez olarak NP-40 konsantrasyonu, konsantre sırasında konsantrasyon artacak. </li><li> Sıvı nitrojen ya da kuru buz içinde 30 ul alikotları kompleksi etanol banyosu soğutulur dondurma ve daha sonra -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Deterjan İsteğe Sonrası Arıtma Kaldırma </li></ol> Not: NP-40 gibi engelleyebilir veya bazı uygulamalar için ilerleme inhibe kritik misel konsantrasyonu yukarıda bir konsantrasyonda bir deterjanın varlığında. proto onun kaldırılması sonuçlarıDiğer Katkı maddeleri veya ortak-çözücü ile sütun hem de yerine aşağıda ele alınmaktadır. Resim NP-40 isteniyorsa, bir seçenek, örneğin Bio-boncuk, kaldırılması için, ticari bir uygulama kullanmaktır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Diyaliz tampon maddesi içinde önceden dengelenir ticari olarak temin edilebilen bir deterjan emici boncuklar. (Genellikle 10 nM konsantrasyonda) kompleksinin 30 ul başına beş boncuk karıştırın. </li><li> Buz üzerinde 15 dakika musluk saflaştınldı kompleksi ile Aşama 5.2.1 arasında dengelenmiş boncuk inkübe edin. deterjan çıkarılmasını takiben bir kaç saat içinde karmaşık kullanın. </li></ol>

<ol><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li>
<li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+A+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+recombinant+proteins+fused+to+calmodulin+or+to+calmodulin-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides.</a> Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).</li>
<li>Braisted, A. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+a+binding+domain+from+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Minimizing a binding domain from protein A.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Nallamsetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+site-specific+processing+of+fusion+proteins+by+tobacco+vein+mottling+virus+protease+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro.</a> Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Howson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction%2C+verification+and+experimental+use+of+two+epitope-tagged+collections+of+budding+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains.</a> Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).</li>
<li>Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells.</a> Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).</li>
<li>Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+partners+of+acyl+carrier+protein+detected+in+Escherichia+coli+by+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification.</a> FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).</li>
<li>Tharun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+analysis+of+the+decapping+activator+Lsm1p-7p-Pat1p+complex+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast.</a> Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).</li>
<li>Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+method%3A+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Gottschalk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+U1+snRNP+reveals+five+novel+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins.</a> RNA. 4 (4), 374-393 (1998).</li>
<li>Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteins+of+the+yeast+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).</li>
<li>Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+a+stable+form+of+recombinant+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease.</a> Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

TAP yöntemi sıkı ve seçici fizyolojik çözelti Koşullar korumak için bir arzu bir afinite reçineye bağlanmak için bir dengelemeye iki etiket kullanılmaktadır. Bu denge sonrası arıtma karakterizasyonu için faktör (ler) etkileşime ile etiketli protein istikrarlı etkileşimi (ler) korumak için hizmet vermektedir. Buna ek olarak, bireysel TAP biri herhangi bir maya kompleksi için etiketli protein ile herhangi bir maya suşu elde edebilirsiniz, böylece Orfs, ticari bir kaynaktan temin edilebilen etiketledi. Bir kompleks bütünlü...

Birçok önemli hücresel süreçler büyük protein ve protein-RNA kompleksleri 1 tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu tür komplekslerin biyo-fiziksel ve yapısal çalışmaları yapmak için önemli bir engel, uygun bir kalite (yani, homojen) ve uygun bir konsantrasyonda onları elde edilir. doğal bir kaynağından, bir kompleks izole alt birimlerin ilgili transkripsiyon sonrası ve / veya translasyonel modifikasyonlar tutma ve uygun karmaşık bir düzenlemesini sigortalanması dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Ancak, büyük hücre kompleksleri düşük kopya sayısında sık sık, bir hücrede mevcut olan ve arıtma için yüksek verimli olması ve karmaşık bütünlüğü korunmasını sağlamak için, yaklaşık olarak fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilmelidir. bir ökaryotik kaynaktan bir kompleks Arındırıcı özellikle zor ve mali engelleyici olabilir. Bu nedenle, verimli ve homojen bir kompleks elde stratejileri veya yöntemleri çok arzu edilir. olmuştur bir stratejionların ilk karakterizasyonu için ökaryotik hücrelerden yerli kompleksleri arındırıcı başarılı Tandem Affinity Arıtma (TAP) yöntemi 2,3 olduğunu. TAP yöntemde, faktör (ler) 2 etkileşim ile kompleks olarak çiçek mayası (S. cerevisiae) bir yerli proteini saflaştırmak için geliştirilmiştir. TAP yöntem iki etiket, aynı protein kodlayıcı gen sekansına tandem kaynaşık her etiket kullanılmaktadır. Sıkı ve seçici fizyolojik çözelti Koşullar korumak için bir arzu bir afinite reçineye bağlanmak için bir ihtiyaç dengelemek üzere etiketler seçilmiştir. Bu denge sonrası arıtma karakterizasyonu için faktör (ler) etkileşime ile etiketli protein istikrarlı etkileşimi (ler) korumak için hizmet vermektedir. etiketli biraz üzerinde 20 kDa&#39;lık bir ek - genomik dahil TAP etiketi sonunda yerleştirildi ve protein kodlama geninin (-terminal, C) Protein A ve ardından peptit (CBP) bağlanması bir kalmodülin kodlayan bir sekans oluşuyordu protein. CBP 2, kısa6 amino asit ve tanıdığı ~ 17 kDa proteini Kalmoduline 10 -9 sırasına M 4 bir KD ile kalsiyum mevcudiyetinde (CAM). Protein bir etiket tekrarlar arasında kısa bir bağlayıcı ile 58 kalıntıları arasında, iki tekrarlardan meydana gelen daha büyüktür. Her 58 amino asit tekrar K D ~ 10 -8 M 5 ile immünoglobulin G (IgG) tarafından kabul edilmektedir. Bu iki etiketin arasında TEV proteaz, Tütün Etch Virüsü 6,7 arasında bir endopeptidaz için bir tanıma sitesi dahil edilmiştir. TAP protein etiketli yöntemin birinci afinite aşamasında Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, etiketli protein TEV proteaz, özellikle de site arasındaki yaran ilave üzerinde kolon bölünmesine elüe edilir Protein A ile bir IgG reçineye bağlı iki etiketleri. Bu IgG etkileşimi olarak gerekli bir adımdır ve Protein Çok güçlü ve sadece yeterli denatüre çözüm koşullarında tedirgin olabilir. Bir Pr eksikBir etiket otein protein kalsiyumun varlığında cam reçinesine bağlanır ve metal iyonu kenetleyici, EGTA (etilen glikol tetraasetik asit) (Şekil 1) ek olarak, bu reçineden yıkandı. TAP yönteminin tanıtılması, bu üretmek için büyük çaplı bir çalışmada kullanılan kısa bir süre sonra bir S. karmaşık etkileşimlerin &#39;harita&#39; cerevisiae 8. Daha da önemlisi, bir bu çabanın tüm maya-TAP Etiketli Açık Okuma Çerçevesi (ORF) kütüphane sonucu yanı sıra bireysel TAP olarak 9 ticari bir kaynaktan temin edilebilir ORF etiketledi. Bu nedenle, tek bir herhangi bir maya kompleksi için etiketli bir protein ile bir maya suşu elde edebilir. TAP yöntemi de dahil olmak üzere, tadilatları ya da TAP etiketinin varyasyonları, teşvik: diğer ökaryotik hem de bakteri hücreleri 10,11 komplekslerin saflaştırılması için kullanımı; Protein A ve CBP farklı proteinler 12 üzerine yerleştirildiği bir &quot;bölünmüş&quot; etiketine, tasarımı; ve taBöyle Ca 2+ veya EGTA 13 kompleksin duyarlılık olarak, araştırmacının ihtiyacı karşılamak amacıyla gs değişti. Her iki enstrümantasyon ve metodoloji son gelişmeler makromoleküler kompleksleri 14 atom çözünürlüklü görüntülerden yakın, yüksek yol açmıştır yapı tayini için elektron mikroskobu (EM) uygulamasında önemli ilerlemelere yol açmıştır. EM bir kompleks elde çözünürlük, ancak, çalışma kapsamında kompleksinin kalitesi üzerine şarta kalır. Bu çalışma S&#39;den arındırmak için TAP etiketi yaklaşımını kullanmaktadır cerevisiae U1 snRNP, spliceosom 15,16 bir parçası olan bir 18-alt-birimi (-0.8 MDA), düşük kopya sayısı ribonükleoprotein kompleksi. bir dizi adım bu homojen ve yeterli bir konsantrasyon olacak şekilde bu karmaşık saflaştırmak için alınmıştır. arıtma için çeşitli aşamalarında karşılaşılan potansiyel problemler açıklanmıştır ve stratejiler Chall aşmak için alınanEnges vurguladı. dikkatle değerlendirilmesi ve saflaştırma adımları optimize ederek, U1 snRNP saflaştırılmış bir kalite ve olumsuz leke için uygun ve elektron mikroskopisi cryo (cryo-EM) çalışmaları bir miktarda yer almaktadır. Yapısal çalışmalar için yerel komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü, burada tarif edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>S. cerevisiae TAP etiketli suşu</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>Bu, TAP protokolünü geliştirmek için kullanılan birincil maya türüdür. Arka planı S288C: ATCC 201388: MATa, his3 & Delta; 1, leu2 ve Delta; 0, met15 ve Delta; 0, ura3 ve Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Kahve değirmeni</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Hücre lizisi için kullanılır</td></tr><tr><td>Hemositometre, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Hücre lizisini değerlendirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>JA 9.100 santrifüj rotoru&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Maya hücrelerini hasat etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>JA 20 sabit açılı santrifüj rotoru</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td> Çözünmeyen hücresel materyal Ti 60 sabit açılı santrifüj rotoru Beckman Coulter, Inc.<td>'in hücre ekstraktını temizlemek için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td></td><td>Çözünür hücre ekstraktını daha da temizlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Sıcaklık kontrollü çalkalayıcı</td></tr><tr><td>Novex jel sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG reçinesi</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 hızlı akışlı</td></tr><tr><td>Calmodulin reçinesi</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Afinite reçinesi</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli, mini tabletler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra EDTA içermeyen tabletler</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli, büyük tabletler</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA içermeyen tabletler</td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür (PMSF)</td><td></td><td></td><td>İzopropanol 2 ml içinde çözünmüş</td></tr><tr><td>Bio-spin sütunu</td><td>Bio-Rad Laboratuvarlar A.Ş.</td><td>7326008</td><td>Calmodulin reçinesi</td></tr><tr><td>10 ml çoklu hazırlık kolonunu</td> paketlemek ve yıkamak için kullanılır <td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>IgG reçinesini paketlemek ve yıkamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Prekast yerli PAGE Bis-Tris jelleri</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - %16 prekast poliakrilamid jeller</td></tr><tr><td>NativeMark protein standardı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Doğal PAGE için kullanılan boyanmamış protein standardı. Yük 7.5 &mu; gümüş lekeli bir jel için l ve 5 & mu; l SYPRO Yakut lekeli jel için</td></tr><tr><td>Prekast SDS PAGE Bis-Tris jeller</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - %12 prekast poliakrilamid jeller&nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler protein standardı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Western blotting için kullanılan boyanmamış protein standardı</td></tr><tr><td>SDS koşu tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS Tampon</td></tr><tr><td>TAP antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>CBP etiketine karşı birincil antikor</td></tr><tr><td>İkincil antikor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Keçi anti-tavşan alkalin fosfataz konjuge</td></tr><tr><td>BCIP / NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat / nitro mavi tetrazolyum ve nbsp;</td></tr><tr><td>Dialaysis üniteleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer mini diyaliz üniteleri</td></tr><tr><td>Santrifüj filtre üniteleri, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Ultracel-100 membranlı Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre Ünitesi</td></tr><tr><td>Deterjan emici boncuklar</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Biyo-boncuk SM-2 emiciler</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Nükleik asit boyama için floresan boya, SYPRO Ruby ile tespit edildiğinde, 488 nm'lik uyarma dalga boyu ve 532 nm'lik emisyon dalga boyunu kullanın</td></tr><tr><td>SYPRO</td><td>Yakut Moleküler Problar</td><td>S-12000</td><td>Protein boyama için floresan boya, SYBR Green II mevcut olduğunda tespit ederken, 457 nm'lik uyarma dalga boyu ve 670 nm'lik emisyon dalga boyunu kullanın</td></tr><tr><td>Bakır ızgaralar</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

bir tandem affinity etiket yöntemiyle yapısal Çalışmaları yerli komplekslerinin saflaştırılması

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity arıtma yaklaşımları proteomik karakterizasyonu için yerli kompleksleri izole başarılı olmuştur. Yapısal heterojenite ve bir kompleksin kompozisyon heterojen bir derecesi genellikle bu tür çalışmalar yürüten ilerleme engel olmaz. Bunun aksine, yapısal karakterizasyon için amaçlanan bir kompleksi hem de içerik olarak ve yapısal olarak homojen olarak proteomik için gerekli olandan daha yüksek bir konsantrasyonda bir halde arındırılmalıdır. Son zamanlarda, büyük makromoleküler kompleksler yapı tayini için elektron mikroskobu uygulamasında önemli ilerlemeler olmuştur. Bu elektron mikroskobu ile yapısal tespiti için yeterli nicelik ve nitelikte yerli kompleksleri arındırmak için yaklaşımlar ilgi artırmıştır. Tandem Affinity Arıtma (TAP) yöntemi 18-altbirim ayıklamak ve arındırmak için optimize edilmiştir, ~ tomurcuklanan maya 0.8 MDa ribonükleoprotein montaj (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; negatif leke ve elektron cryo mikroskopi için uygun. Burada TAP yöntemiyle, bu değişiklikleri yapmak için gerekçesi yapılan değişiklikleri detaylı ve yaklaşımlar bir kompozisyon yönünden ve yapısal homojen kompleks için tahlil alınır.

Değiştirilmiş bir TAP yöntemi S&#39;den saflaştırmak için kullanıldı U1 snRNP, 18 alt birim ribonükleoprotein kompleksi cerevisiae&#39;de. Yayınlanmış bir protokol 2,3 takiben kompleksin bir başlangıç ​​TAP saflaştırma gümüş üç grup ana poliakrilamid jel (Şekil 2A) boyanmış şekilde göç heterojen çıktı bir kompleks elde edilmiştir. TAP yönteminin optimizasyonu birden fazla tur, daha homojen bir montaj (Şekil 2A) gösteren bir y...

Tandem Afinite Saflaştırma (TAP) yöntemi, proteomik için başta ökaryotik olmak üzere hücresel ekstrakttan doğal kompleksleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, yapısal çalışmalar için doğal komplekslerin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü sunuyoruz.

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Bu protokolün genel amacı, biyofiziksel çalışmalar için uygun kalitede doğal bir makromoleküler kompleksi saflaştırmaktır. Bu protokol sadece bir kompleksi saflaştırma yolu olarak değil, aynı zamanda saflaştırma sırasında numunenin yapısal kalitesini değerlendirmek için ayrıntılı bir kılavuz olarak hizmet eder. Bu protokolün temel avantajı, bileşimsel homojenliği sağlamak amacıyla doğal bir topluluğun fizyolojik koşullara yakın tampon koşullar altında basit ve hızlı bir şekilde saflaştırılmasına olanak tanımasıdır.S.cerevisiae hücrelerinin santrifüj edilmesinin ve üst fazın metin protokolüne uygun olarak dökülmesinin ardından, iki mililitre soğutulmuş lizis tamponu ekleyin ve peleti süspande etmek için çözelterek karıştırın ve/veya 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutulan boş bir 50 mililitrelik konik polipropilen santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, her bir santrifüj şişesini yıkamak için ek iki mililitre soğutulmuş lizis tamponu kullanın ve bu çözeltiyi 50 mililitrelik tüpe ekleyin.Hücre peletinin ıslak ağırlığı belirlendikten sonra, 50 mililitrelik konik polipropilen santrifüj tüpünün içine ve çevresine sıvı azot banyosu hazırlayın.

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Burada, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin ekspresyonu, izolasyonu ve karakterizasyonu için yeni, sağlam ve verimli bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, ayrık komplekslerin biyokimyasal karakterizasyonunun yanı sıra yeni interaktörlerin ve işlevlerini düzenleyen translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması için kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Burada protein alma kompleksleri (TOC-TIC kompleksi) dokunun etiketini kullanarak kloroplast arıtma için kanıtlanmış ve test iletişim kuralı mevcut. Tek benzeşimi yalıtım Protokolü potansiyel olarak herhangi bir protein için uygulanabilir ve kütle spektrometresi ile yeni etkileşim ortaklar tanımlamak için kullanılan.

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Öğrenin, S. cerevisiae hücrelerinden Tandem Affinity Purification yöntemiyle yerli makromoleküler kompleksleri saflaştırmayı ve biyofiziksel çalışmalar için yapısal kalite değerlendirmesi yapmayı.

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Daha fazla video keşfet