Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi İn Vitro Sistem

Bu deneyin genel amacı, hücrelerin ortam havasından çıkarılan partikül maddeye maruz kalmasıyla indüklenen kromozomal hasarı tespit etmektir. Bu yöntem, partikül madde alanındaki önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir ve bu, partikül maddeye maruz kalmanın kromozomal hasara neden olup olmadığıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, genetik materyalde meydana gelen hasarın doğrudan görselleştirilmesine olanak sağlamasıdır.

Partikülleri metin protokolüne göre topladıktan ve analiz ettikten sonra, kültür başlamadan en az 30 dakika önce 37 santigrat derecede bir su banyosunda tam büyüme ortamını,% 0.25 tripsin ve PBS'yi ısıtarak partikül maruziyetini gerçekleştirin. Ham 264.7 hücreyi yıkadıktan sonra, tabağa bir mililitre ılık tripsin çözeltisi ekleyin ve hücreleri doku kültürü kabının dibinden kazıyarak çıkarın. Daha sonra hücreleri toplayın ve tekrarlanan pipetleme ile tek hücreli bir süspansiyon yapın.

Tripan mavisi ile, hücre sayısını sayın, ardından 100 milimetrelik bir doku kültürü kabında santimetre kare başına 8000 yoğunlukta kaplamak için önceden ısıtılmış tam ortam kullanın. Ardından, mililitre başına 50.000 hücrelik bir nihai konsantrasyon için hacmi 10 mililitreye ayarlamak için tam ortam kullanın. Hücreleri 37 santigrat derecede ve yapışmalarına izin vermek için 24 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.

Bir biyo-güvenlik kabininde, filtrelenmiş partikülleri mililitre başına 0.5 miligram konsantrasyonda, mililitre tedavi dozu başına 5 mikrogram ve mililitre tedavi dozu başına 50 mikrogram için mililitre başına 5 miligram konsantrasyonda seyreltmek için steril PBS kullanın. Partikül madde içeren hücreleri tedavi etmek için, kültürlenmiş hücreleri hücre büyümesi, hücre morfolojisi, kültür durumu ve kontaminasyon açısından 10x büyütmeli bir mikroskop altında kontrol edin. Bu aşamada hücreler en az %30 birleşik olmalıdır.

Steril bir pipet kullanarak, ortamı aseptik olarak aspire edin ve kültür kabını iki kez yıkamak için iki mililitre 37 santigrat derece PBS kullanın. Taze ortam ile önceden belirlenmiş bir partikül madde dozu ekleyin ve eşzamanlı genotoksik ve epigenotoksik analiz için kullanılan maruziyete paralel olarak kültürleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Hücreleri metafazda durdurmak için, hücreleri yıkadıktan sonra, kültüre mililitre colcemid çözeltisi başına beş mikrolitre ile iki mililitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, ortamı tamamen çıkarın ve hücreleri iki kez yıkamak için ılık PBS kullanın. Daha sonra tripsin çözeltisi ekleyin ve kültürleri bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri ayırın ve tripsini etkisiz hale getirmek için 10 mililitre PBS ekleyin.

Daha sonra, tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için hücreleri en az on kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri 15 mililitrelik, konik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri açılır bir santrifüje yerleştirin ve hücre süspansiyonunu 400 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika döndürün. Hipotonik tedavi yapmak için, hücre peletini rahatsız etmeden süpernatanı tüplerden çıkarın ve yaklaşık 0,5 mililitre PBS bırakın.

Hücre peletini nazikçe kırın ve tek hücreli bir süspansiyon yapmak için bir P200 pipeti kullanın. Daha sonra dört mililitre önceden ısıtılmış potasyum klorür çözeltisi ekleyin, hafifçe çalkalayarak damla damla. Hücre süspansiyonunu 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika inkübe edin.

Hipotonik tedaviden sonra, tüpe eşit hacimde fiksatif ekleyerek hücreleri sabitleyin ve tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Tüpleri oda sıcaklığında 400 kez g'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Bu aşamada, hücre peletinin boyutu artacak ve beyazımsı renkte ve daha görünür hale gelecektir.

Süpernatanı çıkarın. Dört mililitre taze fiksatif ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra tüpleri santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri iki kez daha yıkamak için dört mililitre fiksatif kullanın.

Cam slaytları 30 dakika boyunca tamamen %10'luk sıvı deterjana batırın. Ardından slaytları 30 dakika boyunca soğuk akan musluk suyunda iyice durulayın. Deterjanı tamamen çıkarmak için slaytları üç kez durulamak için damıtılmış su kullanın.

Daha sonra damıtılmış suya batırın ve slaytları bir gece buzdolabında saklayın. Soğutulmuş ıslak bir slayta on mikrolitre hücre süspansiyonu bırakın ve gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Numuneleri boyamak ve monte etmek için, bir kısım giemsa boyama solüsyonunu bir kısım PBS ile karıştırarak 50 militer giemsa boyama solüsyonu hazırlayın ve bir coplin kavanozuna dökün.

Slaytları 20 dakika boyunca boyama solüsyonuna batırın, ardından fazla lekeyi çıkarmak için slaytları damıtılmış suda durulayın ve slaytları kurutmak için hemen bir saç kurutma makinesi kullanın. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Ertesi sabah, kızağa tek bir damla montaj ortamı uygulayın.

Yavaşça üstüne bir kapak sürgüsü yerleştirin ve montaj ortamının sürgünün üzerine yavaşça yayılmasına izin verin. Ardından fazla ortamı çıkarmak için bir kağıt havlu kullanın. Son olarak, metafaz yayılımlarındaki yapısal kromozomal sapmaları incelemek için 100x büyütmede parlak bir alan mikroskobu kullanın.

Bu görüntü, normal bir fare metafaz yayılımının 40 asentrik kromozoma sahip olacağını göstermektedir. Partikül madde ile tedavi, bir kromatit kırılması, bir asentrik fragman, bir halka kromozomu, bir disentrik kromozom, çift dakika, bir Robertsonian translokasyonu ve bir endoredupulasyon gibi çeşitli kromozomal anormalliklere neden olur. Bu prosedürü denerken, sadece çoğalan hücrelerin kullanılması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, ek soruları yanıtlamak için M-FISH ve SKY gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Kromozomallar arası, stabil sapmaların mevcut olup olmadığı gibi. Bu işlemi yaparken dikkat edilmesi gereken dikkat ve kanserojen maddeleri, eldiven giymek gibi önlemleri her zaman aklınızda bulundurmanız gerektiğini unutmayın.