Name: Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi İn Vitro Sistem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin, ortam hava partikül maddesinin RAW264.7 fare makrofajlarında kromozomal hasara yol açtığını in vitro görselleştirme yöntemiyle analiz etmeyi. Bu teknik genetik bütünlük değerlendirmesi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

iş Biyolojik Araştırma Mükemmellik [hibe sayısı 1P20GM109005], Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi [hibe sayısı NNX15AK32A] aracılığıyla Arkansas Uzay Grant Konsorsiyumu Sağlığı Merkezi Ulusal Enstitüsü ve İş Güvenliği Ulusal Enstitüsü tarafından, kısmen, desteklenen Sağlık (NIOSH) [hibe sayısı 2T420H008436]. Yazarlar redaksiyon ve bu taslağın düzenlenmesi için Christopher Fettes teşekkür etmek istiyorum.

1. Parçacık Toplama ve Hazırlama <ol><li> Yüksek hacimli toplam asılı parçacıklar örnekleyici kalibrasyonu <ol><li> Kütle akış kontrol cihazından örnekleyici motoru kesin ve kararlı bir AC güç kaynağına (Şekil 1) motoru bağlayın. NOT: Bir filtre, bu işlem sırasında kullanılmaz. </li><li> örnekleyici kalibratör deliğini ve üstten yüklemeli adaptör plakasını monte edin. Hiçbir hava kaçağı mevcut olduğundan emin olmak için güvenli üstten yüklemeli adaptörü tutma somunlarını sıkın. örnekleyici motoru normal çalışma sıcaklığına (yaklaşık 10-15 dakika) kadar ısınmasını bekleyin. </li><li> elleriyle ağzına ağız ve basınç musluğu üstündeki delikleri kapatarak bir sızıntı testi yapıyoruz. havayı kaçan tarafından yapılan bir tiz squealing sesi dinleyin. Bu ses duyulur bir kaçak söz konusu olduğu gibi, üstten yüklemeli adaptör tutma somunları yeniden sıkın. Ses düşükse, kaçak sys diğer contalar birine yakın olduğutem. </li><li> Bir lastik vakum tüpü ile deliğin tarafındaki basınç musluğa su manometre bir tarafını bağlayın. atmosfere açık manometre karşı tarafını bırakın. doğru okuma sağlamak için dikey bir manometre tutun. sürekli akış kaydedici ters dokunulduğunda kalem ortalamak ve doğru okumalarını sağlamak için yardımcı olacaktır. </li><li> Adımı tekrarlayın / dk (yaklaşık olarak her 5-6 ft 3 / dak) 30 ila 60 ft faaliyet akış hızlarının temsil eden beş akış oranları kullanılarak 1.1.2. Beş farklı pozisyonlarda değişken ağzına düğmeyi ayarlayın ve beş farklı okumalara alır. </li><li> sertifikalı son tarih, tarih, site konumu ve kalibrasyon kağıda operatör baş harfleri ile ortam hava sıcaklığı, ortam barometrik basınç, örnekleyici seri numarası, delik seri numarası, delik eğimi ve kesişme kaydedin. </li></ol></li><li> Toplam askıda partiküller numune toplama ve gravimetrik analiz <ol><li> Wrap birAlüminyum folyo iki kat 8 &quot;x 10&quot; kuvars elyaf filtre. fırında sarılmış filtreyi yerleştirin ve 550 ° C&#39;de sıcaklığını ayarlamak. en az 4 saat süreyle filtreyi pişirin. fırın soğuması ve filtreyi almak. CaCO 3 desikatörde filtre yerleştirin. </li><li> 10 ug hassasiyetle bir mikro filtreyi tartılır. Bir gün boyunca ölçüm üç kez tekrarlayın. Bireysel ölçümler 25 mikrogram içinde olmalıdır. Bu elde değilse, desikatöre sarılmış filtreyi dönmek ve işlemini ertesi gün tekrarlayın. </li><li> Barınak kapağı (Şekil 2) açın. Dört kanat fındık gevşeterek pirinç civatalar ve contalar dışına aşağı salıncak izin vererek filtre tutucu çerçeveyi çıkarın. destekleyen ekranda, kaba yüzü yukarı, alüminyum folyo filtreyi açılmak ve dikkatle ortalamak için temizlenmiş forseps kullanabilir. Düzgün ekranda filtreyi hizalayın. </li><li> Ekranda çerçevesini yerleştirin ve sabitleyinyeterli basınç uygularken pirinç civatalar ve contalar kenarlarında hava sızıntısını önlemek için. temiz bir bezle filtre tutucu etrafında herhangi bir toz birikmesini silin. Yakın barınak kapağı dikkatli ve emniyete alın. </li><li> emin olun tüm kabloları bunların uygun priz yuvalarına takılı ve fan motoru basınç musluğu ve sürekli akış kaydedici arasında boru bağlanır. </li><li> Akış kaydedici hazırlayın. kalem noktasını yükseltmek ve yeni bir grafik eklemek için kalem kol kaldırıcı basınız. kaydedici sürücü göbeğine grafiğin sekmeyi hizalayın ve göbek üzerine grafik merkezini düşürmek için başparmak ile bastırın. grafikte doğru zaman zaman indeksi işaretçisi ile aynı hizaya gelene kadar sürücü hub saat yönünde çevirerek saati ayarlayın. </li><li> El ile örnekleyici açmak ve toplama başlar. doğru mürekkep ve geçen süre göstergesi düzgün çalıştığından emin olmak için emin olmak için kaydedici izleyin. </li><li> Örnekleme döneminin sonunda, örnekleyici, kayıt kapatmakgeçen süre ve grafik almak. Filtreyi ortaya çıkarmak için çerçeveyi çıkarın. forseps ile uçlarında hafifçe tutarak destek ekrandan maruz filtreyi kaldırmak. Bu örnek iki örnek dokunur, böylece uzunlamasına filtreyi katlayın ve orijinal alüminyum folyoya sarın. </li><li> Tartılmadan önce en az 24 saat boyunca CaCO 3 bir kurutucuda filtre saklayın. Adımı tekrarlayın 1.2.2 örnekleme sonra filtrelerin ağırlığını ölçmek için. zip plastik bir torba içinde filtreyi yerleştirin ve analize kadar -80 ° C saklayın. </li></ol></li><li> Toplanan toplam askıda partiküller numunenin analizi <ol><li> Saklanan filtre Al alüminyum folyo açılmak ve temiz bir teflon yüzeyi üzerinde filtre aktarın. forseps ve neşter kullanılarak, filtrenin dış (beyaz) bir bölümünü kesmek ve atınız. <ol><li> Daha sonra, 100 ml&#39;lik bir şişe içinde 0.5 &quot;x 0.5&quot; parçaları ve yeri parçaları filtre kesin. ultra saf su 50 ml ekleyin. Bir ultrason şişeyi koyunbanyo ve 33 ± 3 kHz 60 dakika sonikasyon. </li></ol></li><li> 100 ml&#39;lik bir yuvarlak tabanlı şişe için 0.45 um polipropilen şırınga filtre ile filtre özü. ekstresi, yaklaşık 5 ml kadar 50 ° C&#39;de basınç altında rotavap aleti kullanarak suyu buharlaştırmak şişede kalmaktadır. <ol><li> ağırlığı bilinen bir 15 ml armut şekilli bir şişeyi, kalan su buharlaşır. Kuru ekstre ile balon tartılır ve kuru özüt kütlesini kaydedin. </li></ol></li><li> 15 dakika boyunca sonike ile D 2 O 400 ul kuru örnek çözülür ve 5 mm standart NMR tüpü içine aktarın. çözünmemiş maddeleri uzaklaştırmak üzere oda sıcaklığında 12.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> O. NaN 3% 1.4 10 ul (son kons .:% 0.02 w / v) NMR tüpü içinde ekleme D2 300 ul ile tekrarlayın. NMR tüpü içinde D 2 O (nihai konsantrasyon 0.258 mM) toplam asılı parçacıklar (TSP)-d4 (3.2 mg / ml) 10 ul (32 ug) ekleyin. </li><li>600,17 MHz&#39;de çalışan bir NMR spektrometresi kullanılarak 1H NMR spektrumları elde edin. <ol><li> üçlü rezonans kriyoprob içine NMR tüpü yerleştirin. aşağıdaki sırayla enstrüman kalibre: kilidi, melodi, dolgu, 90 ° darbe uzunluğu kalibrasyon ve alıcı kazanç ayarı. </li><li> Dijital Dört algılama modunda 180 suda seçici pulsları, 8.192 taramaları 4 yapay taramaları, 8012,57 Hz tarama genişliği ile bir 1 D uyarım şekillendirici sekansı ile 25 ° C &#39;de spektrumunu ölçmek, frekans 4.70 ppm&#39;de ayarlanmıştır su sinyal bastırılması, 1.70 için ofset sn kazanım süresi, 32.768 time domain veri noktaları (TD), 1 msn süre gradyan (p16), gradyan (D16) sonra 100 mikro-sn kurtarma gecikme. </li></ol></li><li> Proses 1 2 (65,536 veri noktaları) içindeki bir faktör ile, 1 Hz ve sıfır dolgulu bir hat genişletmesi uygulanarak NMR spektrumları. elle faz ve taban çizgisini düzeltin ve entegre. 0.0 ppm TSP-d4 zirve ayarlayın. </li></ol></li></ol> 2. Parçacık Pozlama<ol><li> Kültür kurmak <ol><li> (37 ° C&#39;de),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin çözeltisi (100 U / ml),% 0.25 tripsin solüsyonu ve kalsiyum, magnezyum içermeyen fosfat tamponu tuz, bir su banyosu içinde (PBS) ihtiva eden sıcak bir tam büyüme ortamı için kültür başlamadan önce en az 30 dakika. </li><li> Kültürlenmiş RAW264.7 hücreleri ihtiva eden bir% 5 CO2 inkübatör T75 şişesi çıkarın ve önceden ısıtılmış PBS ile iki kez 2 ml hücreleri yıkayın. </li><li> kazınarak ardından önceden ısıtılmış tripsin çözeltisi 1 ml kullanılarak doku kültürü kabının altından yapışkan RAW264.7 hücreleri çıkarmak. </li><li> Doku kültürü kabı hücreleri toplamak ve tekrar pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu yapmak. Önceden ısıtılmış tam ortam maddesi ile 100 mm doku kültürü çanağı içinde 8.000 N / cm2 (toplam 500.000 hücre) bir yoğunlukta tripan mavi ve plaka hücre sayısı. 50,000 hücrelik nihai konsantrasyonda 10 ml&#39;lik Ortam ses seviyesini ayarlamaml başına. NOT: DNA metilasyonu analizi de yapılır eğer plakaların sayısını ikiye katlayın. </li><li> 37 ° C de geri CO2 inkübatör% 5 yeni kaplama RAW264.7 hücreleri yerleştirin ve 24 saat boyunca eklemesini sağlar. </li><li> Ayrıca biyogüvenlik kabini, süzülmüş parçacıkların tekrar süspansiyon. Örneğin, bir 5 ug / ml bir tedavi dozu için steril PBS içinde 0.5 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda parçacıkları seyreltilmesi ve 5 mg / 50 ug / ml bir tedavi dozu için ml&#39;de. Dilüsyonlar önceden aya kadar hazırlanır ve -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Parçacık madde ile muamele <ol><li> % 5 CO 2 inkübatör hücreleri almak ve hücre büyümesi, hücre morfolojisi, kültür durumuna ve kirlenme ters bir mikroskop kullanılarak 10x büyütme altında kontrol edin. Bir bu aşamada en az% 30 konfluent hücrelere sahip beklemesin. </li><li> Aseptik, sterilize pipet kullanarak medya aspire ve 2 ml 37 ° C PBS ile kültür damarı yıkayınİki kez tamamen medya ve yüzen veya ölü hücreleri çıkarmak için. </li><li> Kültür damarlarda taze ortam parçacıklı maddenin önceden belirlenmiş doz ekleyin ve CO2 inkübatör% 5 37 ° C&#39;de, istenen bir süre için inkübe edilir. Bu çalışmada, eş zamanlı genotoksik ve epigenotoxic analiz için kullanılan pozlama paralel 72 saat PM ile RAW264.7 hücreleri tedavi. NOT: Sitotoksisite olumsuz sitogenetik analiz kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, sitotoksisite, DNA metilasyonu, Western blotting ya da gen ekspresyon analizi gibi ek deneyler tipik haliyle muamele edilmiş hücreler üzerinde gerçekleştirilmiştir. tarif edildiği gibi hücreler ortaya çıkarmak ve istenen spesifik deney devam edin. Deneyimsiz kullanıcılar, aynı zamanda CA&#39;larını tespit yeteneklerini test etmek için metil metansülfonat gibi bir pozitif kontrol eklemek isteyebilirsiniz. </li></ol></li></ol> 3. Sitogenetik Testi <ol><li> Tedavi metafaz hücrelerin tutuklamak için <ol><li> böylece colcemid ısıtındökülmesinden 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde (10 ug / ml). kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir biyogüvenlik kabini altında% 70 alkol ile silin kapağı </li><li> Tamamen aseptik ortamı çıkarın ve 2 ml önceden ısıtılmış PBS ile iki kez kültür damarları yıkayın. </li><li> Önceden ısıtılmış taze ortam (2 mi ortam / 10 6 hücre), kültür kabı içinde colcemid çözeltisi (5 ul / ml) ihtiva eden ve 2 saat süreyle inkübe edin. </li></ol></li><li> hücre hasat <ol><li> bir su banyosunda ılık bir tripsin çözeltisi ve PBS, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de tutuldu. Bundan böyle aşağıda aşama aseptik durumunu korumak için herhangi bir gerek yoktur. </li><li> Tamamen iki kez 2 ml 37 ° C PBS ile kültür damarları, yıkama ortamı çıkarın önceden ısıtılmış tripsin çözeltisinin gerekli hacim eklemek (genellikle 60 mm kültür çanağı veya T25 şişesi 2 ml ve 100 mm tabak veya T75 şişesinin 4 mi ) ve 1 dakika için 37 ° C &#39;de geri CO2 inkübatör% 5 kültür kabını yerleştirin. </li><li> Take dışarı kültür damarı, bir kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmak ve tripsin eylemi durdurmak için PBS 10 ml ekleyin. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı, en az on kez 15 ml konik alt santrifüj tüpü içinde tek bir hücre süspansiyonu ve transfer hücreleri yapmak. </li><li> Oda sıcaklığında katlanırlar santrifüj içinde 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüje hücre süspansiyonu. </li><li> Süpernatantı nazik dokunarak hücre pelet kırmak, PBS 10 ml ekleyin ve tekrar beş dakika süreyle santrifüj. </li></ol></li><li> Hipotonik tedavi ve sabitleme <ol><li> en az 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak 0.075 M potasyum klorür çözeltisi. </li><li> Hücre pelet bozmadan Süpernatantı ve PBS yaklaşık 0,5 ml bırakın. </li><li> Yavaşça hücre pelet kırmak ve bir P200 pipet kullanarak tek bir hücre süspansiyonu yapmak. </li><li> hafifçe çalkalanarak damla önceden ısıtılmış potasyum klorür solüsyonu damla 4 ml. </li><li> hipotonik p hücreleri inkübe20 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde otassium klorür çözeltisi. </li><li> 1-kısım buzlu asetik asit ile 3 parça metanol ilave taze acetomethanol çözeltisi olun. Oda sıcaklığında, bu yeni hazırlanmış fiksatif tutun. </li><li> hipotonik tedaviden sonra, tüp içinde sabitleyici eşit hacimde (4 mi) ekleme ve tüp hafifçe ters çevirerek çözelti karıştırılır. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ve supernatant çıkarın. Bu aşamada hücre pelet boyutu artar, beyazımsı ve daha görünür hale gelir. </li><li> Süpernatantı, 4 ml taze fiksatif ilave edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında tutulması. </li><li> 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj, süpernatant kaldırmak ve 4 ml fiksatif ile iki yıkar verir. </li></ol></li><li> Slayt temizleme ve metafaz yayılması hazırlığı <ol><li> 30 dakika boyunca tamamen% 10 sıvı deterjan, cam slaytlar daldırın. </li><li> 30 dakika süre ile akan soğuk musluk suyunda iyice slaytlar durulayın. </li><li> rinSE tamamen deterjanı çıkarmak damıtılmış suya batırın ve ileride kullanılmak üzere buzdolabında depolamak için damıtılmış su ile üç kez kaymaktadır. NOT: kullanım yayılma tekdüzelik kolaylaştırır ve metafaz kalitesini artırır önce slaytlar temizlenmesi. </li><li> soğutulmuş, ıslak slayt üzerinde 10 ul hücre süspansiyonu damla ve oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya hava sağlar. </li></ol></li><li> Boyama montaj <ol><li> PBS bir kısım Giemsa boyası çözeltisinin bir bölümü karıştırılarak 50 mi Giemsa boyama çözeltisi hazırlayın ve Coplin kavanoza ilave edin. </li><li> 20 dakika boyunca boyama çözeltisi slaytlar daldırın. </li><li> Bir saç kurutma makinesi kullanarak slaytları fazla leke çıkarmak ve hemen kurumaya distile su slaytlar durulayın. </li><li> gece boyunca, oda sıcaklığında slaytlar bırakın. </li><li> slaytta montaj orta tek bir damla uygulayın, nazikçe, montaj ortamında bir lamel yerleştirin orta yavaş yavaş slayt yayılmış izin ve kaldırmakBir kağıt havlu ile fazla orta. monte slayt önce hareketli veya lamel hareketini önlemek için bir mikroskop altında inceleyen en az 1 saat kurumasını bekleyin. Dikkat: Bu adımda sırasında herhangi bir baloncukları oluşturmadan dikkatle lamel yerleştirilmesi önemlidir. kabarcıklarını çıkarmak için aşırı ısı kullanımı tavsiye edilmez. </li></ol></li><li> Mikroskobik gözlem ve sapmaları türleri <ol><li> metafaz iyi kalitede parlak alan mikroskobu kullanarak 100X büyütmede yayılır yapısal CA&#39;larını inceleyin. </li><li> 100 metafaz CA&#39;larının sayıda neden tedaviler için, her tedavi grubu için yayılır en az 50 puan. Daha küçük etki boyutları için, 300 metafaz yayılır analizi tavsiye edilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+risk+assessment+of+burden+of+disease+and+injury+attributable+to+67+risk+factors+and+risk+factor+clusters+in+21+regions%2C+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2224-2260 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IARC%3A+Outdoor+air+pollution+a+leading+environmental+cause+of+cancer+deaths%22">IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths</a>. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).</li>
<li>Putaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+European+aerosol+phenomenology-2%3A+chemical+characteristics+of+particulate+matter+at+kerbside%2C+urban%2C+rural+and+background+sites+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe.</a> Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).</li>
<li>Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+composition+of+remote+and+urban+fine+particulate+matter+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Geophys+Res-Atmos%22%5BJournal%5D)">Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States.</a> J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).</li>
<li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).</li>
<li>Simoneit, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomarker+compounds+as+source+indicators+and+tracers+for+air+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).</li>
<li>Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+of+organic+primary+and+secondary+aerosol+constituents+in+urban%2C+background+marine%2C+and+forest+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22J+Geophys+Res-Atmos%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere.</a> J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).</li>
<li>Graber, E., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+HULIS%3A+How+humic-like+are+they%3F+A+comprehensive+and+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review.</a> Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).</li>
<li>Pöschl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+aerosols%3A+composition%2C+transformation%2C+climate+and+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int%22%5BJournal%5D)">Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects.</a> Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).</li>
<li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+methylation+in+tandem+repeat+element+and+elemental+component+levels+in+inhalable+air+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).</li>
<li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+induced+by+ambient+particulate+matter+in+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).</li>
<li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Toxicity+and+Epigenotoxicity+of+Different+Types+of+Ambient+Particulate+Matter%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter.</a> Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).</li>
<li>Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEhrlich%2C+M+%22Genome+Instability+in+Cancer+Development%22">Genome Instability in Cancer Development</a>. , Springer. 363-392 (2005).</li>
<li>Michael, S., Montag, M., Dott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+effects+and+oxidative+stress+in+lung+macrophages+and+epithelial+cells+induced+by+ambient+particulate+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter.</a> Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+expression+in+macrophages+by+diesel+exhaust+particle+chemicals+and+quinones+via+the+antioxidant-responsive+element%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element.</a> J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).</li>
<li>Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radio-sensitivities+of+human+chromosomes+1+and+2+in+one+donor+in+interphase-+and+metaphase-spreads+after+60Co+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation.</a> BMC Med. Phys. 9, 6649(2009).</li>
<li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+effects+in+M5+cells+and+Chinese+hamster+V79+cells+after+exposure+to+7+Li-beam+%28LET%3D+60keV%2F%C2%B5m%29+and+correlation+of+their+survival+dynamics+to+nuclear+damages+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).</li>
<li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+killing%2C+nuclear+damage+and+apoptosis+in+Chinese+hamster+V79+cells+after+irradiation+with+heavy-ion+beams+of+16+O%2C+12+C+and+7+Li%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).</li>
<li>Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+for+determining+the+functional+content+of+organic+aerosols%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Pollut%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review.</a> Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Sitogenetik çalışma veya numaraları veya öncelikle metafaz yayılır kromozom, yapılarının mikroskobik analizi, çeşitli hastalıklar için prognoz, risk değerlendirmesi ve tedavisi için önemli bilgiler sağlar. Şimdi sitogenetik anormallikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesi ve gelişimi ile bağlantılı olduğu iyi bilinmektedir. Bugüne kadar, CA tüm ana tümör tiplerinde olduğu bulunmuştur. Sitogenetik değişikler 16 çeşitli uyarabilir önemli dış risk faktörlerinden biri - CA kendiliğinden ...

Partikül madde (PM) maruz kalma öncelikle kardiyopulmoner hastalığı ve akciğer kanseri 1 yılda 3 milyondan fazla aşırı ölümlere neden olması tahmin edilmektedir. PM maruz kalma seviyeleri arttıkça akciğer kanseri riski 2 gösterilmiştir Nitekim, PM, Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (Grup 1) ile insanlarda kansere olarak tanındı. İlginç bir şekilde, hemen hemen tüm kanser hücrelerinin sayısal ve / veya yapısal kromozom anomalileri liman. Partikül organik karbon, terkibi ve boyut dağılımı emisyonları ve fiziksel ve kimyasal dönüşümler bağlı olan bir varyantı, karmaşık ve heterojen karışım vardır. Bu 35-55 (boyutunda PM 2.5 mikron ve daha küçük) kentsel PM 2.5 kütlesinin% kırsal ve kıta arka plan PM 2.5 kütle 3, 4 den fazla% 60 oluşturmaktadır. suda çözünen fraksiyon organik aerosol 30-90% oluşturmaktadır. Organik bileşiklerin büyük bir kısmıalifatik hidrokarbonlar, poliaromatik hidrokarbonlar ve bunların oksijenli nitratlı türevlerini, alifatik aldehitler ve alkoller, serbest yağ asitleri ve bunların tuzları, di-karboksilik asitler, çok fonksiyonlu bileşikler, proteinler, ve hümik benzeri makromoleküller (HULIS) kullanılması dahil olmak üzere tespit edilmiştir kütle spektrometrik teknikleri 5-8 ile birleştiğinde kromatografik yöntemler. Bu nedenle bu bileşikler, organik karbonun çoğu 9 bilinmemektedir, parçacık halinde organik karbon az% 10-20 temsil etmektedir. Deneysel kanıtlar, sitotoksisite, oksidatif stres ve enflamasyon PM ile ilişkili patolojik durumların gelişiminde rol oynadığını düşündürmektedir. Yakın zamanda, bununla birlikte, PM bu maruz kalma da in vitro sistemlerinde, insan konularında 10-12 hem de deneysel olarak, tekrar eden elemanların, DNA metilasyon değişiklikler de dahil olmak üzere epigenetik değişiklikler, bir dizi ile sonuçlanır gösterilmiştir. Özel ilgi konusu olan etkileri vardırMajör ve minör uydular - - kromozomların sentromer etrafında heterokromatik bölgesinde bulunan uydu DNA PM. Onlar maruz 12. sonra en az 72 saat süreyle tespit edilebilir olarak bu etkiler, doğası gereği kalıcı olabileceğini gösterilmiştir. Özellikle sentromer yaklaşık DNA metilasyonu değişiklikler, hücre bölünmesi esnasında, uydu, DNA mRNA transkript, bir uzlaşma kromozom bütünlük birikimine yol açabilir ve daha sonra, patolojik durumların 13 çeşitli oluşmasına da neden olabilir. PM bağlı epigenetik değişiklikler bir son nokta olarak bir CA analizi için sitogenetik yaklaşım adaptasyonu, bu şekilde, yüksek bir öneme sahiptir. Burada, fare makrofaj RAW264.7 modeli sistemini kullanarak CA&#39;ların in vitro maruziyet ve analiz ortam PM toplama ve hazırlama yaklaşımı, rapor. Makrofajlar t nedenle, inhale yabancı nesnelere karşı ilk savunma hattını oluşturan veCep hattı kurulmuş ve partikül toksikoloji 11, 12, 14, 15, en sık kullanılan bir model olarak hizmet vermektedir.

<table><tbody><tr><td>Toplam askıya alınmış partikül örnekleyici</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR spektrometresi&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 yazılımı</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR İşlemci Akademik Sürümü</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 murin makrofajları</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek glikozlu DMEM GlutaMAX ortamı</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>37 °C sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>37 derece sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>37 derece sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (% 0.25)</td> <td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>37 derece sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>37 °C Sıcak; PBS</td></tr><tr><td>ThermoFisher'da</td><td></td><td>KaryoMAX Colcemid Solüsyonunu</td> kullanmadan önce C su banyosu <td>15212012 37 ° C'de Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>KaryoMAX Potasyum Klorür Çözeltisi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>10575090 37 ° C'de Ilık; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Metanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Asetik Asit, Buzul</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Sıvı Deterjan</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright ve Wright-Giemsa Leke</td><td>Çözümleri Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Görüntüleyici 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

bir kullanarak ortam partikül madde kaynaklı kromozomal anormallikler analizi<em&gt; İn vitro</em&gt; sistem

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

partiküler madde (PM) maruz kalma nükleer genetik materyalin dahil olmak üzere çeşitli hücresel bileşenleri, zarar verebilir önemli bir dünya sağlık sorunu vardır. Nükleer genetik bütünlüğü üzerindeki PM etkisini değerlendirmek için, yapısal kromozom bozuklukları fare RAW264.7 makrofaj hücrelerinin metafaz mamulünün puanlanır. PM yüksek hacimli toplam askıda partiküller örnekleyici ile ortam havasından toplanır. Toplanan malzeme çözünebilir ve suda çözünür ince kısmı tutmak için filtre edilir. partiküller, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ile kimyasal bileşim açısından karakterize edilir. Parçacık süspansiyonu farklı konsantrasyonları muamele edilmemiş kontrol hücreleri ile birlikte, 72 saatlik bir toplam maruz kalma süresi için RAW264.7 fare makrofaj bir in vitro kültürü üzerine ilave edilir. Temas süresi sonunda, kültür metafaz hücreleri yakalama colcemid ile işlenir. Daha sonra hücreler toplandı, acetomethanol sabit hipotonik çözelti, D ile muamele edilirCam slaytlar üzerine ropped ve son olarak Giemsa çözeltisi ile boyandı. Slaytlar parlak alan mikroskobu kullanılarak 1,000X büyütmede metafaz yayılır yapısal kromozom sapmaları (CA) değerlendirmek için incelenir. 50 ila 100 metafaz yayılımı, her tedavi grubu için puan verilir. Bu teknik kromatid tipi tatili, chromatid tipi alışverişi, acentric parçaları, disentrik ve halka kromozomlar, çift dakika endoreduplication ve PM maruz kaldıktan sonra in vitro Robertsonian translokasyonları gibi yapısal kromozomal anomaliler (CA), tespiti için uyarlanmıştır. Epigenetik değişikliklere köklü bir sitogenetik uç noktasını ilişkilendirmek için güçlü bir yöntemdir.

Büyük bakım TSP numune yerini yanı sıra koleksiyon yapılır yılın zaman seçiminde dikkatli olunmalıdır. Kimyasal bileşim, aynı zamanda parçacıkların boyutu esas olarak sonuçlarını etkileyebilir. Toplanan malzeme beyaz filtre karşı görünür olmalıdır. Normal bir fare metafaz yayılması 40 acentric kromozom vardır. tekniğin amacı kontrol grubuna göre muamele edilen hücrelerde anormal kromozom oranında bir değişim (ya da bunun olmayan) göstermektir. Bu değişiklik daha sonra (anormal kromozomla...

Bu protokol ortam havası partiküler madde ile tedaviden sonra RAW264.7 fare makrofajlar in vitro ölçümü ve kromozomal anomaliler karakterizasyonu için teknikleri açıklar.

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Sistem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Bu deneyin genel amacı, hücrelerin ortam havasından ekstrakte edilen partikül maddeye maruz kalması sonucu oluşan kromozomal hasarı tespit etmektir. Bu yöntem, partikül madde alanındaki temel bir sorunun, yani partikül madde maruziyetinin kromozomal hasara yol açıp açmadığının yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik materyalde meydana gelen hasarın doğrudan görselleştirilmesine olanak tanımasıdır.Metin protokolüne göre partikülleri toplayıp analiz ettikten sonra, kültür başlangıcından önce tam büyüme ortamını, %0,25 tripsini ve PBS'yi bir su banyosunda 37 °C'de en az 30 dakika boyunca ısıtarak partikül maruziyetini gerçekleştirin. Ham 264.7 hücrelerini yıkadıktan sonra, kaba bir mililitre sıcak tripsin çözeltisi ekleyin ve hücreleri sıyırarak doku kültürü kabının tabanından ayırın. Ardından hücreleri toplayın ve tekrarlayan pipetleme işlemiyle tek hücreli süspansiyon hazırlayın.Trypan mavisi ile hücre sayısını belirleyin, ardından hücreleri 100 milimetrelik bir doku kültürü kabında santimetrekareye 8000 olacak yoğunlukta ekmek için önceden ısıtılmış komple ortam kullanın. Daha sonra, mililitrede 50.000 hücrelik bir nihai konsantrasyon sağlamak için hac

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Karyotipleme genetik değişiklikler tespit etmek için yaygın olarak kullanılan basit ve kullanışlı bir bir tekniktir. Burada bakımı, kültür bu hücrelerin kromozom durum izleme için insan embriyonik kök hücrelerin kromozom yayılmış hazırlık için adım protokol tarafından bir adım açıklanmaktadır.

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Xenopus yumurta özü DNA hasarı kontrol noktasında araştırmak için yararlı bir model sistemidir. Bu protokol, Xenopus yumurta özü ve DNA hasarına neden olan kontrol noktası reaktiflerin hazırlanması içindir. Bu teknikler DNA hasar kontrol noktası sinyalleşmenin çalışmada DNA hasarına yaklaşımların çeşitli uyarlanabilir.

Kullanılarak DNA hasar Checkpoint incelenmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta ayıklar

Bu video, sırasıyla DNA hasarını ve çift sarmallı DNA kırılmalarını gösteren 8-OHdG ve γH2AX seviyelerini ölçerek zebra balığı embriyolarının kalplerinde PM2.5'in neden olduğu oksidatif hasarı tespit etmek için oldukça hassas bir immünofloresan tabanlı testi göstermektedir.

Balık Embriyolarında PM2.5 Aracılı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofloresan Testi

Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir.

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

DNA onarım yolları genomik bütünlüğünü korumak ve mutasyon ve kanser önlenmesi için gereklidir. Bu protokolün amacı, metafaz telomerik DNA tekrarlar in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanılarak fare B hücreleri yayılır içinde kromozom anormallikleri doğrudan gözlem ile genomik istikrarsızlık ölçümüdür.

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Germ hattı toksisitesini değerlendirmek için kullanılan nematod Caenorhabditis elegans'ta yüksek verimli bir kimyasal testin ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Bu tahlilde, kimyasal maruziyeti takiben germ hattı fonksiyonunun bozulması, anöploid embriyolara özgü bir floresan raportör kullanılarak izlenir.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fare dalak lenfositlerinde kronik in vivo düşük doz ışınlamanın neden olabileceği DNA hasar seviyelerindeki ve DNA onarım kapasitesindeki değişiklikleri, DNA çift sarmallı kırılmaların bir belirteci olan fosforile histon H2AX'i ölçerek, akış sitometrisi kullanarak değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır.

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme<em&gt; In Vivo</em&gt; Beta ve gamma-Radyasyonun Çok Düşük Doz Maruz Kalma

Mevcut protokol, toplam vücut ışınlamasına maruz kaldıktan sonra farelerin kemik iliği hücrelerindeki kromozomal stabil anormallikleri tanımlamada çoklu floresan in situ hibridizasyon (mFISH) ve spektral karyotiplemenin (SKY) yararlılığını açıklamaktadır.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Burada 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoknguanozin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) ve 1,n2-lezyonların hassas ve doğru ölçülmesini yöntemleri açıklanmaktadır etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) DNA 'da. Yöntemler, ortam ince partikül maddenin (PM2,5) dokularda (akciğer, karaciğer ve böbrek) maruz kalan A/J fareler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

Zebra balığı embriyolarında 16 PAH'ın iç seviyelerini değerlendirmek için modifiye edilmiş bir QuEChERS-HPLC yöntemi geliştirdik.

İnce Partikül Maddeye Maruz Kalan Zebra Balığı Embriyolarında Polisiklik Aromatik Hidrokarbonların Tespiti için Modifiye Edilmiş Bir QuEChERS-HPLC Yöntemi

Öğrenin, ortam hava partikül maddesinin RAW264.7 fare makrofajlarında kromozomal hasara yol açtığını in vitro görselleştirme yöntemiyle analiz etmeyi. Bu teknik genetik bütünlük değerlendirmesi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi

Daha fazla video keşfet