Name: Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin, sabit hücrelerde MST1/MST2 heterodimerizasyonunu görselleştirmek için in situ yakınlık ligasyonu (PLA) yöntemini. Bu hassas teknik, protein etkileşimlerini transgenik ifade olmadan tespit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

En iyi duruma getirme ve bu protokol, belirli Maria Radu ve Galina Semenova, doğrulanması için katkıda bulunmak için tüm Chernoff laboratuvar teşekkür ediyoruz. Andrey Efimov hücre Imaging tesisin Fox Chase Kanser Merkezi ayrıca teşekkür ederiz. Bu eser NIH (R01 CA148805) bir hibe için Dizayn Merkezi tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması çözümleri
<ol><li>Sabitleştirici çözüm hazırlamak: %4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS. 10 mL için 2.5 mL % 16 almak PFA ve 7,5 mL 1 x PBS ekleyin. Tehlikeler: İngiltere'de yılın düşük dozlarda kanserojen. Duman ve Ciltle temas tehlikeli. -20 ° C'de mağaza</li>
	<li>Permeabilization çözüm hazırlamak: %0,1 1 x PBS Triton X-100. 100 mL için çözeltisi, Triton X-100 100 µL 100 mL 1 x PBS ekleyin. (RT) Oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Yıkama arabellek hazırlayın: 1 x TBST. 1 L için 10 x TBS 100 mL, dH2O 890 mL ve 10 mL Tween 20 (% 10) alın.</li>
	<li>Engelleme çözüm paketi tarafından sağlanan gibi hazırlayın. Alternatif olarak, % 2 BSA içeren 1 x PBS çözüm kullanın.</li>
	<li>Antikor seyreltici kit tarafından sağlanan gibi hazırlayın. Alternatif olarak, % 1 BSA içeren 1 x PBS çözüm kullanın.</li>
</ol>2. kaplama hücre
Not: Bu çalışmada, kullandığımız ölümsüzleştirdi insan Schwann hücreleri (iHSC) ve insan embriyonik böbrek 293 hücreleri (HEK 293); Ancak, bu yöntem yapışık hücreleri birçok türü için kullanılabilir.
<ol><li>Kültür HEK 293 yılında % 10 ile desteklenmiş DMEM FBS, %0.2 glikoz, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin doku kültürü tedavi plakaları 37 ° c % 5 CO2. İHSC kalem/Strep ve 2 µM forskolin FBS/DMEM takıma % 10 sürdürmek. Rutin test hücreleri Mikoplazma için. Hiçbir hücre satır kimlik doğrulaması gerçekleştirildi.</li>
	<li>16-iyi odası slayt 10 µg/mL doğal fare laminin veya % 0,01 poli-L-lizin çözüm 50 µL ile ceket ve % 5 CO237 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. %0,04 tripsin-EDTA kullanarak hücreleri bölün.</li>
	<li>Plaka iHSC ve HEK-293 yılında 100 µL % 80 izdiham (15.000-25.000 hücreler/de), orta.</li>
	<li>Kuluçkaya hücreler için 12-24 saat içinde oksijen, 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka makinesi.</li>
</ol>3. fiksasyon ve Permeabilization
<ol><li>Orta kuyulardan kaldırmak ve 1 x PBS 100 µL ile yıkayın. Örnek çıkarma riskini en aza indirmek için micropipette ile Aspire edin.</li>
	<li>Hücreleri 4 PFA ücret iyi ve ajitasyon olmadan, RT, 10 min için kuluçkaya % 50 µL ekleyerek düzeltmek. Hücreleri dekolmanı duyarlıdır, yani doğrudan hücreleri üzerine çözümleri pipetting önlemek.</li>
	<li>% 0.05 hücrelerle yıkama 5 min için üç kez TBST. Örnek çıkarma riskini en aza indirmek için micropipette ile Aspire edin.</li>
	<li>Ajitasyon, RT. olmadan 10 dk permeabilization çözüm (% 0,1 Triton x-100 1 x PBS içinde) hücrelerle tedavi</li>
	<li>TBST hücrelerle ajitasyon ile her 5 min için üç kez yıkayın.</li>
</ol>4. engelleme
<ol><li>TBST (micropipette) ile çok nazikçe kapalı dokunun. Hücreleri bağlı kalır eğer görmek için mikroskop slayt görselleştirin.</li>
	<li>Bir damla (50-60 µL) 1 x engelleme çözüm her örnek için ekleyin.</li>
	<li>37 ° c nem odası (su ile boş ipucu kutusunu) ön ısı ve bu slaytları 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
</ol>5. birincil antikorlar
<ol><li>Birincil antikor (1: 100) antikor Dilüent seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek). İyi başına 40 µL antikor çözüm hazırlamak.</li>
	<li>Engelleme çözüm sıvı kapalı dokunarak slaytlardan kaldırmak. Hücreleri kuru izin vermez.</li>
	<li>Girdap ve her şey için antikor çözümleri 40 µL ekleyin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.</li>
</ol>6. yakınlık ligasyonu tahlil probları
Not: PLA probları bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme). Seçtiğiniz probları bir birincil antikorlar faiz proteinlerin algılamak için kullanılan türler üzerinde bağlıdır.
<ol><li>İki PLA problar (Anti-fare eksi ve anti-tavşan artı) seyreltik 1: 5'te antikor seyreltici. Her örnek için 40 µL PLA inceleyebilirsek hazırlayın. Karışım RT., 20 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Slaytları birincil antikor çözümden kapatmak dokunun. 5 min her arabellek yıkama ile iki kez slaytlarını RT. yıkama</li>
	<li>Yavaşça slaytlardan yıkama tamponunun dokunun ve seyreltici PLA sonda çözüm wells (40 µL/de) ekleyin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 1 h için slaytları kuluçkaya</li>
</ol>7. tüp ligasyonu
Not: in situ algılama reaktifler kırmızı, ligaz ve ligasyonu çözüm bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme).
<ol><li>Situ algılama reaktifler kırmızı kullanın.</li>
	<li>Hemen önce kullanmak, girdap ve 5 x 1:5 içinde yüksek saflıkta su tüp ligasyonu stok gerekli miktarda oranında seyreltin. Not: seyreltilmiş reaktifler depolamayın.</li>
	<li>Slaytları PLA sonda çözümden uzak dokunun. 1 x 5 dk her RT. az için iki kez yıkama arabellek slaytları yıkayın</li>
	<li>Hemen önce ek örnekleri, girdap ve ligaz ligasyonu 1:40 ekleyin seyreltme ve tekrar girdap.</li>
	<li>Slaytları yıkama arabelleğinden kapalı dokunun ve her şey (40 µL/de) tüp ligasyonu/ligaz çözüm ekleyin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 30 dk için slaytları kuluçkaya</li>
</ol>8. güçlendirme
Not: Amplifikasyon hisse senedi bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme). Reaktifler ışığa duyarlı vardır; Böylece ışık slaytlara kullanılmasını önlemek.
<ol><li>Girdap ve 5 x amplifikasyon hisse senedi 1:5 yüksek saflıkta su gerekli miktarda sulandırmak ve karıştırın.</li>
	<li>Slaytları ligasyonu/ligaz çözümden uzak dokunun. 1 x 2 dk her RT. az için iki kez yıkama arabellek slaytları yıkayın</li>
	<li>Girdap ve polimeraz 1:80 seyreltme ve girdap güçlendirme çözüm yeniden ekleyin.</li>
	<li>Yıkama tampon slaytlardan dokunun ve her şey (40 µL/de) güçlendirme/polimeraz çözüm ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 100 min için slaytları kuluçkaya</li>
</ol>9. görüntüleme için hazırlık
Not: Bu ışık duyarlı reaktifler vardır. Işıktan korunan slaytlar tutun.
<ol><li>Slaytları amplifikasyon-polimeraz çözümden uzak dokunun ve iki kez 10 dk içinde her 1 x yıkama arabellek RT., yıkama</li>
	<li>Odalar ve silikon wells etrafında slayttan tamamen kaldırın. Silikon kalan parçaları bir ustura ile kazı. Her ayıran slayt üzerinde bir tablo çizmek de.</li>
	<li>~ 40 µL DAPI ile montaj ortamının ekleyin. Kapak notu altında hava kabarcıkları yakalama önlemek dikkatli olun. Kapak notu kenarlarını oje ile kapalı gibi.</li>
	<li>Confocal bir mikroskop kullanarak görüntü analizi yapmadan önce en az 20 dakika bekleyin. Not: Protokol burada duraklatılmış.</li>
	<li>Görüntüleme sonra karanlıkta slaytlar-20 ° C'de depolayın.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Cam odası slaytlar gibi çok çeşitli (14-16) hücre hatları ile deneme gerçekleştirmek uygundur ve örnek mikroskobu analizi sırasında her zaman değiştirmek için gerek yoktur bu deneme için kullanmak yararlı bulduk. Bir antikor ile çapraz bulaşma riski gibi bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Bu nedenle, biz her şey yıkama öneririz deneme artan süre rağmen bir Coplin kavanoz kullanmak yerine tek tek. Buna ek olarak, silikon Ekle kaldırılması hassas bir meseledir ve özen ve sabır ile yapılmalıdır. Bile titiz tekniği ile b...

MST1/Hippo sinyal kesintileri gelişimsel bozuklukları ve karsinojenezis1bağlı olmuştur. Memelilerde, MST1 ve MST2 kinaz etkinleştirin (fazdan) MOB1 ve LATS1/2, ikincisi olan daha sonra phosphorylates ve transkripsiyon ortak harekete geçirmek Evet ilişkili protein (YAP)2inaktive. Etkin (unphosphorylated) haliyle YAP oncogenic etkinlik, hücre proliferasyonu genlerin transkripsiyon artırılması vardır; Bunun tersi olarak, YAP Hippo yolu tarafından inaktive, hücre çoğalması bastırılır ve Apoptozis3terfi. Dokularda, esas olarak active homodimers, MST1 ve MST2 var ama oncogenic uyaranlara MST1/MST2 heterodimers düzeyleri artırabilir ve böyle heterodimers etkin olmayan4vardır. Ancak, MST1/MST2 heterodimerization nasıl düzenlenir kötü anlaşılır kalır. Homo - hem heterodimers aracılı ile C-terminal dolandı-coil MST1 bölgelerinde ve SARAH etki alanları5olarak bilinen MST2 arasındaki etkileşimler vardır. Bir in situ kullanarak PLA Bu makalede, biz insan Schwann hücreleri (HSC) ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK-293) MST1/MST2 heterodimers varlığını göstermek gösterdi. Tespit ve transgene ifade ihtiyacı veya epitope Etiketler kullanımı sayısal endojen protein-protein etkileşimleri algılanmasını sağlar çünkü PLA diğer protein/protein etkileşim algılama yöntemleri üzerinde bir avantaj vardır 6.
Sinyal iletim yollarının büyük ölçüde bileşen proteinler koşullu Derneği tarafından kontrol edilir. Örneğin, çoğu reseptör Tirozin kinaz uyarılması kendi homo veya heteroseksüel dimerization ve ek hücre içi sinyal proteinleri, kendilerini izleyen ilişkilendirmesiyle formu daha fazla kompleksleri yol açar. Proteinler daha az 30-40 nm parçalara olması koşuluyla PLA yöntemin amacı hücrelerdeki proteinler arasında yakınlık görselleştirmek etmektir. Protein yakınlık genellikle ilk hücre içinde farklı tür kaldırdı uygun birincil antikorlar ile kuluçka tarafından tespit (Örn., tavşan ve fare) karşı etkileşen her protein, sonra species-specific ikincil antikorlar, ekleme önceden birleştiğinde kısa DNA sondalar. DNA probları yakın iseniz, belirli bir bağlantı DNA oligonükleotid aynı anda hem in situ PCR veya daire mekanizması haddeleme tarafından amplifikasyon için bir platform oluşturan Bu sondalar bağlayabilirsiniz. Floresan Etiketler amplifikasyon tepki eklendi görselleştirme kolayca sayılabilir ve hücre7,8, belirli bölgelere lokalize floresan noktalar olarak görünür etkileşen proteinlerin izin 9 , 10.

<table><tbody><tr><td>Oda slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>178599 16 kuyulu, cam slaytlı</td></tr><tr><td>PLA probu Anti-Fare Eksi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>1x Engelleme solüsyonu, 1x antikor Seyreltici</td></tr><tr><td>PLA Probu Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>1x Bloke Edici Solüsyon, 1x Antikor</td></tr><tr><td>Seyreltici Yıkama Tamponları, Flurescence</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>içerirDUO82049</td><td>Yıkama Tamponu A ve Yıkama Tamponu B</td></tr> içerir <tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Tespit Reaktifleri</td> ile Montaj Ortamı Kırmızı <td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td>5x Ligasyon, 1x Ligaz, 5x Amlifikasyon Kırmızısı, 1x Polimeraz</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) Antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td><td>Hücre Sinyal</td><td>5726s</td><td>pERK antikoru</td></tr><tr><td>MST2 antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>MST1 antikoru</td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>15710</td><td>Çözeltiyi sabitlemek için PBS'de% 4 PFA'ya seyreltin</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 151-500</td><td>Geçirgenlik çözümü için 1xPBS'de %0,1 Triton x-100 hazırlamak için</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskopi</td><td>Leica TCS SP8, 63x</td><td></td><td>ImageJ yazılımı ile görüntü analizi</td></tr></tbody></table>

heterodimerization in situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak protein izoformlarının tespiti

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Düzenlenmiş protein-protein etkileşimleri çok sayıda sinyal olayı için temel bir ilke vardır ve bu tür olayların tespiti böyle yolları nasıl düzenlendiğini ve şekilleriyle anlamada önemli bir unsurdur. Protein-protein etkileşimleri hücrelerde algılamak için pek çok yöntem vardır, ancak nispeten az endojen proteinler arasındaki etkileşimler algılamak için kullanılabilir. Böyle bir yöntem, yakınlık ligasyonu tahlil (PLA), kullanımı tavsiye bir çok avantajı vardır. Protein-protein etkileşimi analiz ortak diğer yöntemlerine göre PLA nispeten yüksek duyarlılık ve özgüllük vardır, çok az hücre düzenleme ile burada açıklanan protokol yapılabilir, sadece iki hedef özgü gerektirir antikorlar farklı türlerden elde edilen (e.g., fare ve tavşan) ve bir özel reaktif: bir dizi belirli kovalent bağlı oligonucleotides olan ikincil antikorlar, birbirine yakın getirdiğimde, oluşturmak bir situ PCR veya çalışırken daire amplifikasyon amplifiable platformu. Bu sunum, biz MST1 ve MST2 yakınlık sabit hücrelerdeki değişiklikler görselleştirmek için PLA tekniği uygulamak gösterilmiştir. Bu el yazması açıklanan tekniği, özellikle hücre çalışmaları sinyal analizi için geçerlidir.

PLA tahlil HEK-293 ve iHSC MST1 ve MST2 arasındaki etkileşimi sınamak için kullanılır. Hücreleri sabit, permeabilized ve in situ amplifikasyon PLA Protokolü (Şekil 1) göre ardından çeşitli antikorlar ile lekeli. MST1/MST2 heterodimerization düzeyini belgelemek için hücreleri MST1 ve MST2 antikorlar ile (Şekil 1A, 1 C ve 1 G) lekeli. Pozitif kontrol olarak biz de ERK kullanılır ve hücrelerle birbirine yak...

İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

In situ Yakınlık Ligasyon Asaveya PLA, proteinler arasındaki etkileşimleri tespit yeteneğine sahip bir teknolojidir, yapıştırılmış doku, ve hücreler. Proteinler arasındaki ilişki transgenik ekspresyon veya ek teknolojiye gerek kalmadan tanımlanabilir ve ölçülebilir. Tek gereklilik, DNA oligonükleotidleri ile modifiye edilebilen spesifik yüksek verimli antikorların bulunmasıdır.Dokularda MST1 ve MST2 esas olarak aktif homodimerolarak bulunur, ancak onkojenik uyaranlar MST1 MST2 heterodimer seviyesini artırabilir ve bu tür heterodimerler inaktiftir. İlgi proteinleri karşı özel astar antikorları ile inkübasyon, özel spesifik ikincil antikorlar, her biri ona bağlı benzersiz, kısa, ücretsiz DNA iplikçik bağlı, birincil antikorlara bağlamak için yuvaya eklenir. Sorulardaki proteinler heterodimerize edilirse, hem primer antikorlar hem de onlara bağlı sekonder antikorlar yakın olacaktır.Bu durumda, ikinci antikorlar üzerinde bağlı DNA iplikçikleri diğer iki daire oluşturan DNA oligonükleotidbir sonraki eklenmesi ile etkileşime olabilir. DNA çemberinin birkaç yüz kat replikasyonu bir amplifikasyon reaksiyonu ve bir floresan sinyali tesviye ücretsiz oligonükleotid probları tarafından oluşturulan sonra oluşabilir. Bu nedenle, algılanan her sinyal, mikroskop görüntülerine dayalı olarak belirli bir hücre altı konumuna atanabilen tek bir floresan nokta olarak görselleştirilir.Deneyden bir gün önce, 37 santigrat derecede 50 ila 100 mikrolitre fare laminin veya poli-L-l-lizin ve kuluçka ekleyerek 16 iyi odalı slaytkat edin. 30 dakika sonra soğuk çözeltiyi çıkarın, Trypsin ve plaka 15, 000 ila 25, 000 hücreleri iyi başına kullanarak hücreleri bölün 16 iyi odalı slayt içine. 37 derecedeki hücreleri nemlendirilmiş %5 karbondioksit inkübatörde 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.24 saat sonra, kuyulardan orta çıkarın ve yavaşça PBS ile hücreleri yıkayın. Numunenin risk almasını en aza indirmek için bir mikropipet kullanın, ardından PBS'yi aspire edin ve hücreleri kuyu başına %4 PFA'dan 50 mikrolitre ekleyerek düzeltin ve ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bu da hücrelerin ayrılmasına neden olabileceğinden, çözeltiyi doğrudan hücrelere sıkıştırmayın.Fiksasyondan sonra hücreleri TBST ile üç kez beş er dakika boyunca hafif ajitasyonla yıkayın. Sonraki hücreleri permeabilize ve ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Permeabilizasyon tamamlandıktan sonra, ajitasyon ile yıkama başına beş dakika tbst ile üç kez hücreleri yıkayın.TBST çıkardıktan sonra her kuyuya bir damla engelleme çözeltisi ekleyin ve slaytları önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Birincil antikorları seyreltin. Bir mikropipet kullanarak engelleme çözeltisini çıkarın, ancak slaytların kurumasını izin vermeyin.Girdap ve uygun kuyulara seyreltilmiş antikor çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derece örnekleri inküb. Kuluçka sırasında, antikor seyreltici iki PLA probları seyreltin. Her numune için 40 mikrolitre PLA probu hazırlayın.Kuluçka bir saat sonra, antikor çözeltisi aspire ve oda sıcaklığında TBST ile beş dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın. TBST'yi slaytlardan hafifçe çıkarın ve her kuyuya 40 mikrolitre PLA prob çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derece bir saat için önceden ısıtılmış nem odasında slaytlar kuluçka.Vortex ve yüksek saflıkta su hemen önce ligasyon stok 1 ila 5 gerekli hacimleri seyreltin. Her kuyu için 40 mikrolitre ligasyon çözeltisi gereklidir. Kuluçkadan sonra, slaytlardan PLA çözeltisini çıkarın ve ajitasyon la oda sıcaklığında beş dakika tbst iki kez yıkayın.Dondurucudan ligaz çıkarırken ve hücrelere eklemeden hemen önce bir dondurucu blok kullanın, girdap ve ligasyon çözeltisi ile seyreltin. Slaytlardan TBST çıkarın ve her kuyuya ligasyon ligaz çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat.Kuluçkadan sonra çözeltiyi aspire edin ve tbst ile iki kez çalkalama ile oda sıcaklığında beş dakika yıkayın. Reaktifler ışığa duyarlı olduğundan kuyuyu parlak ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Son yıkama sırasında, girdap ve kullanmadan hemen önce yüksek saflıkta su amplifikasyon çözeltisi gereksinimi hacimleri seyreltin.Polimerazı buzüzerinde veya bir soğutma bloğunda tutun ve hücre girdabına eklemeden hemen önce ve amplifikasyon çözeltisi ile seyreltin. TBST'yi kuyulardan aspire edin ve her kuyuya 40 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi ekleyin. Karanlık önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede 100 dakika kuluçkaya yat.Kuluçkadan sonra, slaytlardan amplifikasyon polimeraz çözeltisini aspire edin ve oda sıcaklığında TBST'de her biri iki kez on dakika yıkayın. Tamamen slayt kuyuların etrafında odacıkları ve silikon çıkarın. Kalan silikon boncuklarını jiletle kazıyın.Her iyi ayıran slayt üzerinde bir ızgara çizin. DAPI ile montaj ortamının yaklaşık 40 mikrolitresini ekleyerek, kapak altında hava kabarcıklarının yakalanmamasını sağlar. Kapak camı düzeltmek için oje kullanın.Mikroskobik analiz fiksasyondan sonra 20 dakika içinde yapılabilir, ancak pratikte ertesi gün görüntü analizi yapmayı en uygun şekilde buluyoruz. Örnekleri analiz etmek için Leica SP8 lazer tarama mikroskobu kullanıyoruz. Burada gösterilen yerinde yakınlık ligasyon testi örnekleri paneller A ile D arasında insan embriyonik böbrek hücrelerinde MST 1 ve MST2 proteinleri arasındaki yakın yakınlık görselleştirme, ve paneller E ile Tüm paneller hücre çekirdekleri H.IN ile İnsan Schwann hücreleri DAPI ve kırmızı noktalar tarafından mavi boyanmış olduğunu gösteren pozitif yakınlık ligasyon tahlil sinyalleri belirtilen proteinler arasında yakın yakınlık kaynaklanan gösterir.Panel A, MST1 ve MST2'nin yakınlığını gösterir ken, Panel B ise ERK ve fosfoerk'e yakınlığı gösterir, çünkü bu epitoplar aynı proteindedir. MST1 ve MST2 ve Panel D gibi bu hücrelerin mst1 ve ERK için antikorlarla boyanmış ikinci bir negatif kontrolü temsil ettiği ve birbirlerine yakın olması beklenmez. E ve F panelleri MST1'in Schwann hücrelerinde fosfoERK ile MST2 ve ERK ile yakınlığını gösterir.Panel G ve H, sadece MST1 antikorları veya MST1 ve ERK antikorları ile boyanmış negatif kontrollerdir. Heterodimer'in sadece bir üyesini tanıması gereken çapraz reaktif olmayan primer antikorların kullanılması zorunludur. Ayrıca, primer antikorların ve PLA problarının çapraz kontaminasyonunu önlemek, kuyunun dibine dokunmaktan kaçınmak ve numuneler üzerinde doğrudan borulamayı önlemek için farklı ipuçları kullanmayı unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra sabit hücrelerde protein dimerization çalışma yerinde PLA nasıl kullanılacağını iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.

detection-heterodimerization-protein-isoforms-using-an-situ-proximity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada kemik morfogenetik protein (BMP) sabit hücreler sinyal görselleştirmek için antikor kombinasyonu ile yakınlık ligasyon Assay (PLA), nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu teknik bize BMP4 uyarımı altında efektör-kompleksleri aktif endojen BMP nükleer birikimi takip etmek ve zaman içinde bunların seviyelerini ölçmek için izin verdi.

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Protein-protein etkileşimleri bir hücrenin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında meydana gelebilir. Bu etkileşimleri araştırmak için geleneksel ko-immünopresipitasyon ve modern yakınlık ligasyon testi uygulanır. Bu çalışmada, NF90-RBM3 etkileşimlerinin çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımını görselleştirmek için bu iki yöntemi karşılaştırıyoruz.

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Bu iletişim kuralı için ticari ışık mikroskobu tarama kullanarak floresans dalgalanma spektroskopisi üzerinde temel protein homo-Oligomerizasyonda vitro miktarının kalibrasyon-Alerjik bir yaklaşım açıklar. Doğru satın alma ayarları ve analiz yöntemleri gösterilir.

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

D-döngü yakalama (DLC) ve D-döngü uzatma (DLE) testleri, Saccharomyces cerevisiae'de indüklenebilir çift sarmallı bir kırılma yerinde D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve ürün oluşumunu ölçmek için kantitatif PCR ile birlikte yakınlık ligasyonu prensibini kullanır.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Öğrenin, sabit hücrelerde MST1/MST2 heterodimerizasyonunu görselleştirmek için in situ yakınlık ligasyonu (PLA) yöntemini. Bu hassas teknik, protein etkileşimlerini transgenik ifade olmadan tespit eder.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Daha fazla video keşfet