Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

In situ Yakınlık Ligasyon Asaveya PLA, proteinler arasındaki etkileşimleri tespit yeteneğine sahip bir teknolojidir, yapıştırılmış doku, ve hücreler. Proteinler arasındaki ilişki transgenik ekspresyon veya ek teknolojiye gerek kalmadan tanımlanabilir ve ölçülebilir. Tek gereklilik, DNA oligonükleotidleri ile modifiye edilebilen spesifik yüksek verimli antikorların bulunmasıdır.

Dokularda MST1 ve MST2 esas olarak aktif homodimerolarak bulunur, ancak onkojenik uyaranlar MST1 MST2 heterodimer seviyesini artırabilir ve bu tür heterodimerler inaktiftir. İlgi proteinleri karşı özel astar antikorları ile inkübasyon, özel spesifik ikincil antikorlar, her biri ona bağlı benzersiz, kısa, ücretsiz DNA iplikçik bağlı, birincil antikorlara bağlamak için yuvaya eklenir. Sorulardaki proteinler heterodimerize edilirse, hem primer antikorlar hem de onlara bağlı sekonder antikorlar yakın olacaktır.

Bu durumda, ikinci antikorlar üzerinde bağlı DNA iplikçikleri diğer iki daire oluşturan DNA oligonükleotidbir sonraki eklenmesi ile etkileşime olabilir. DNA çemberinin birkaç yüz kat replikasyonu bir amplifikasyon reaksiyonu ve bir floresan sinyali tesviye ücretsiz oligonükleotid probları tarafından oluşturulan sonra oluşabilir. Bu nedenle, algılanan her sinyal, mikroskop görüntülerine dayalı olarak belirli bir hücre altı konumuna atanabilen tek bir floresan nokta olarak görselleştirilir.

Deneyden bir gün önce, 37 santigrat derecede 50 ila 100 mikrolitre fare laminin veya poli-L-l-lizin ve kuluçka ekleyerek 16 iyi odalı slaytkat edin. 30 dakika sonra soğuk çözeltiyi çıkarın, Trypsin ve plaka 15, 000 ila 25, 000 hücreleri iyi başına kullanarak hücreleri bölün 16 iyi odalı slayt içine. 37 derecedeki hücreleri nemlendirilmiş %5 karbondioksit inkübatörde 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.

24 saat sonra, kuyulardan orta çıkarın ve yavaşça PBS ile hücreleri yıkayın. Numunenin risk almasını en aza indirmek için bir mikropipet kullanın, ardından PBS'yi aspire edin ve hücreleri kuyu başına %4 PFA'dan 50 mikrolitre ekleyerek düzeltin ve ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bu da hücrelerin ayrılmasına neden olabileceğinden, çözeltiyi doğrudan hücrelere sıkıştırmayın.

Fiksasyondan sonra hücreleri TBST ile üç kez beş er dakika boyunca hafif ajitasyonla yıkayın. Sonraki hücreleri permeabilize ve ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Permeabilizasyon tamamlandıktan sonra, ajitasyon ile yıkama başına beş dakika tbst ile üç kez hücreleri yıkayın.

TBST çıkardıktan sonra her kuyuya bir damla engelleme çözeltisi ekleyin ve slaytları önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Birincil antikorları seyreltin. Bir mikropipet kullanarak engelleme çözeltisini çıkarın, ancak slaytların kurumasını izin vermeyin.

Girdap ve uygun kuyulara seyreltilmiş antikor çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derece örnekleri inküb. Kuluçka sırasında, antikor seyreltici iki PLA probları seyreltin. Her numune için 40 mikrolitre PLA probu hazırlayın.

Kuluçka bir saat sonra, antikor çözeltisi aspire ve oda sıcaklığında TBST ile beş dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın. TBST'yi slaytlardan hafifçe çıkarın ve her kuyuya 40 mikrolitre PLA prob çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derece bir saat için önceden ısıtılmış nem odasında slaytlar kuluçka.

Vortex ve yüksek saflıkta su hemen önce ligasyon stok 1 ila 5 gerekli hacimleri seyreltin. Her kuyu için 40 mikrolitre ligasyon çözeltisi gereklidir. Kuluçkadan sonra, slaytlardan PLA çözeltisini çıkarın ve ajitasyon la oda sıcaklığında beş dakika tbst iki kez yıkayın.

Dondurucudan ligaz çıkarırken ve hücrelere eklemeden hemen önce bir dondurucu blok kullanın, girdap ve ligasyon çözeltisi ile seyreltin. Slaytlardan TBST çıkarın ve her kuyuya ligasyon ligaz çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat.

Kuluçkadan sonra çözeltiyi aspire edin ve tbst ile iki kez çalkalama ile oda sıcaklığında beş dakika yıkayın. Reaktifler ışığa duyarlı olduğundan kuyuyu parlak ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Son yıkama sırasında, girdap ve kullanmadan hemen önce yüksek saflıkta su amplifikasyon çözeltisi gereksinimi hacimleri seyreltin.

Polimerazı buzüzerinde veya bir soğutma bloğunda tutun ve hücre girdabına eklemeden hemen önce ve amplifikasyon çözeltisi ile seyreltin. TBST'yi kuyulardan aspire edin ve her kuyuya 40 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi ekleyin. Karanlık önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede 100 dakika kuluçkaya yat.

Kuluçkadan sonra, slaytlardan amplifikasyon polimeraz çözeltisini aspire edin ve oda sıcaklığında TBST'de her biri iki kez on dakika yıkayın. Tamamen slayt kuyuların etrafında odacıkları ve silikon çıkarın. Kalan silikon boncuklarını jiletle kazıyın.

Her iyi ayıran slayt üzerinde bir ızgara çizin. DAPI ile montaj ortamının yaklaşık 40 mikrolitresini ekleyerek, kapak altında hava kabarcıklarının yakalanmamasını sağlar. Kapak camı düzeltmek için oje kullanın.

Mikroskobik analiz fiksasyondan sonra 20 dakika içinde yapılabilir, ancak pratikte ertesi gün görüntü analizi yapmayı en uygun şekilde buluyoruz. Örnekleri analiz etmek için Leica SP8 lazer tarama mikroskobu kullanıyoruz. Burada gösterilen yerinde yakınlık ligasyon testi örnekleri paneller A ile D arasında insan embriyonik böbrek hücrelerinde MST 1 ve MST2 proteinleri arasındaki yakın yakınlık görselleştirme, ve paneller E ile Tüm paneller hücre çekirdekleri H.IN ile İnsan Schwann hücreleri DAPI ve kırmızı noktalar tarafından mavi boyanmış olduğunu gösteren pozitif yakınlık ligasyon tahlil sinyalleri belirtilen proteinler arasında yakın yakınlık kaynaklanan gösterir.

Panel A, MST1 ve MST2'nin yakınlığını gösterir ken, Panel B ise ERK ve fosfoerk'e yakınlığı gösterir, çünkü bu epitoplar aynı proteindedir. MST1 ve MST2 ve Panel D gibi bu hücrelerin mst1 ve ERK için antikorlarla boyanmış ikinci bir negatif kontrolü temsil ettiği ve birbirlerine yakın olması beklenmez. E ve F panelleri MST1'in Schwann hücrelerinde fosfoERK ile MST2 ve ERK ile yakınlığını gösterir.

Panel G ve H, sadece MST1 antikorları veya MST1 ve ERK antikorları ile boyanmış negatif kontrollerdir. Heterodimer'in sadece bir üyesini tanıması gereken çapraz reaktif olmayan primer antikorların kullanılması zorunludur. Ayrıca, primer antikorların ve PLA problarının çapraz kontaminasyonunu önlemek, kuyunun dibine dokunmaktan kaçınmak ve numuneler üzerinde doğrudan borulamayı önlemek için farklı ipuçları kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra sabit hücrelerde protein dimerization çalışma yerinde PLA nasıl kullanılacağını iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.