Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi Drosophila melanogaster

Bu metodolojinin genel amacı, meyve sineği Drosophila melanogaster'deki abdominal pigmentasyonu hızlı bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, evrimsel biyoloji alanında, güvene özgü varyasyon morfolojisinin altında yatan genetik lokusları tanımlamak ve morfolojik fenotiplerin gelişimini ve evrimini anlamak gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kullanıcıların pigmentasyonun yayılması ve derinliği de dahil olmak üzere abdominal pigmentasyonun çeşitli yönlerini tahribatsız bir şekilde ölçmelerine izin vermesidir.

Bu yöntem Drosophila melanogaster'in abdominal pigmentasyonu hakkında fikir verebilse de, diğer Drosophila türlerine de uygulanabilir ve diğer böcekler ve hayvan taksonlarındaki pigmentasyon modellerini ölçmek için kolayca uyarlanabilir. Görüntülemeden önce, sinekler pigmentasyonlarını korumak için% 70 etanol içinde saklanabilir. Görselleştirme bir montaj pedi gerektirir.

Suya yaklaşık 10 mililitre% 1.25 agar içeren 60 milimetrelik bir Petri kabı yükleyin. Mikroskop altında, jelin içine 20 milimetre uzunluğunda, iki milimetre genişliğinde, bir milimetre derinliğinde bir hendek kazmak için ince forseps kullanın. Bir tabakta birkaç hendek yapılabilir.

Daha sonra, jel yüzeyinin hemen üzerinde oturan analiz için yüzey ile hendeğe sinekleri gömün. Bu durumda, sırt tarafı ilgi çekicidir. Şimdi, sinekler tamamen suya batırılana kadar tabağı% 70 etanol ile doldurun.

Bu, pigmentasyon modelini gizleyebilecek kütikül üzerindeki yansımaları azaltır. Şimdi, mikroskoba bağlı görüntüleme yazılımını ve dijital kamerayı başlatın. Bir ışık kaynağı için, çift deveboynu bir cihazdan gelen soğuk ışık yeterlidir.

Görüntü analizi yazılımında, görüntü türünü 8 bit olarak ayarlayın. Ardından görüntü yakalama yazılımında, kameranın bir görüntüleme penceresini açmak için Canlı ayarını değiştirin. Görüntü türünü Gri Tonlamalı olarak ayarlayın.

Şimdi, ışık kaynağını maksimum yoğunluğuna ayarlayın ve ışıkları sahneden yaklaşık 120 milimetre uzağa yerleştirin. Mikroskobu, görüş alanı üç milimetre genişliğinde olacak şekilde 60 kat büyütmeye ayarlayın. Ardından iki milimetre kademeli mikrometreyi görüş alanına yerleştirin ve üzerine odaklanın.

Yazılıma geri dönerek, pozlama kutusunda bulunan alanı kullanarak mikrometreyi görüntülemek için pozlama süresini ayarlayın. Ardından ölçeği ayarlayın. Düz çizgi aracını açın ve sahne mikrometresi boyunca iki milimetre uzunluğunda çizin.

Ardından bu uzunluğu Ölçeği Ayarla seçeneğinin altına girin. Pencere daha sonra ölçeği mikron başına piksel olarak göstermelidir. Ölçeği not alın ve ayarlamaları tamamlayın.

Şimdi, görüntü yakalama yazılımına geri dönün ve sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalamak için Durdur ve Tutturma komutlarını kullanın. Ardından görüntü analiz yazılımına geri dönün ve görüntüyü bir Tiff dosyası olarak kaydedin. Şimdi, monte edilmiş bir sineğin sırt orta hattına odaklanın.

En iyi görüntüleme sonuçları için orta hat düz bir şekilde konumlandırılmalıdır. Kanatları ve diğer çıkıntılı yapıları bir kenara itin ve kütikülü en iyi şekilde aydınlatmak için aydınlatmayı ayarlayın. Ardından, görüntünün tam piksel aralığını doygunluk olmadan yakalamak için piksel değeri histogramını kılavuz olarak kullanarak görüntü yakalama yazılımında pozlamayı ayarlayın ve böylece kontrastı en üst düzeye çıkarın.

Deney boyunca bu pozlamayı ve aydınlatmayı koruyun. Şimdi, bir görüntü yakalamadan önce, ilgilenilen karın segmentlerinin göründüğünden emin olun. Ardından bir görüntü yakalayın ve görüntüyü dosya adında örnek kimlik numarasıyla kaydedin.

Yazılı protokolde açıklanan formatı kullanın. Bu analiz, yazarlar tarafından sağlanan bir makroyu kullanır. Analiz edilecek görüntü serilerinin tümü aynı dosya klasöründe yer almalıdır.

Şimdi makroyu başlatın ve istenen komutları izleyin. İlk olarak, depolanan dosyaların konumunu belirleyin. Ardından, analiz verilerinin depolanması gereken konumu belirleyin.

Ardından, yazılımın görüntü serisini doğru bir şekilde okuması için dosya adlarında kullanılan karakter sayısını girin. Bir sonraki istem, ilgilenilen bölgenin genişliği içindir. Burada, analiz edilmesi gereken ön-arka şerit boyunca piksel sayısını girin.

Şimdi, istemde, serinin ilk görüntüsünü analiz etmek için bir seçim yapın. Diğer seçenekler, serideki bir sonraki görüntüyü analiz etmek veya analizden çıkmaktır. Çizgi aracı otomatik olarak seçilir.

Görüntüdeki orta çizgiyi, önden arkaya yönde bir çizgi çizerek tanımlamak için kullanın. Ardından, çizgi aracını kullanarak Tergite4'ün arka kenarını belirlemek için makro istemlerini izleyin. Çizgi aracı, çizgiyi arka orta çizgi kenarından sağ yan kenara çizmek için kullanılabilir hale getirilmiştir, böylece çizginin merkezi pigment bandının arka kenarının hemen arkasında olur.

Ardından çizgi aracını kullanarak Tergite4'ün ön kenarını tanımlayın. Ön orta çizgi kenarından sağ yan kenara doğru bir çizgi çizin. Beyaz bir kare ile tanımlanan çizginin ortası, hafif pigmentli kütikülün ön kenarına oturmalıdır.

Bu bilgiyle, makro şimdi bir pigmentasyon profili oluşturur. Bununla birlikte, profilin ölçüldüğü şeridi kıllar veya diğer kusurlar geçerse profil yanlış olabilir. Bunu düzeltmek için, histogram penceresinde Canlı önizleme'yi seçin ve çizgiyi profil düzgün olacak şekilde ayarlayın.

Görüntü analiz şeridinin pigmentasyonun çeşitli yönlerini doğru bir şekilde yakalaması için, görüntü veya numune düzensizliklerinin neden olduğu minimum gürültüye sahip olacak bir analiz bölgesinin belirlenmesi hayati önem taşır. Şimdi aynı görüntüde Tergite3'ü analiz etmeye devam edin ve ardından bir sonraki görüntüye geçin. Açıklanan prosedür, yetiştirme sıcaklığının neden olduğu abdominal pigmentasyonda bilinen bir değişikliği araştırmak için kullanıldı.

Üçüncü ve dördüncü tergitler, çeşitli aydınlatmalar ve pozlamalar altında birkaç kez incelendi. Pigmentasyonun çeşitli yönleri araştırıldı. Ve spesifik olarak, sinekler daha düşük sıcaklıklarda yetiştirildiğinde pigmentasyon bantlarının daha geniş olduğu bulundu.

Hesaplanan değerler daha sonra beş farklı gözlemci tarafından aynı sinekler üzerinde yapılan genel öznel ölçümlerle karşılaştırıldı. 45 dişi sineğin değerlendirilmesinde, dördüncü abdominal pigmentasyon bandının genişliğinin gözlemlenen ortalama sıralaması, makronun otomatik ölçümü ile sıkı bir şekilde ilişkilendirildi. Aynı pigmentasyon bandı, görüntüleme yazılımı kullanılarak manuel olarak da ölçüldü.

Bu sonuçlar, makro kullanılarak oluşturulan ölçümlerle de güçlü bir şekilde ilişkilendirildi. Yazılım daha sonra, üçüncü ve dördüncü pigment bantlarında pigmentasyonun arttığı iyi bilinen dişi abanoz mutantlarında pigmentasyonu ölçmek için test edildi. Yöntem ayrıca vahşi tip dişilerin beşinci ve altıncı karın bantlarını ölçmek için de kullanıldı.

Otomatik teknik, her zaman pigment yoğunluğunun ve bant boyutunun yararlı ölçümlerini sağladı. Bu videoyu izledikten sonra, Drosophila'da abdominal pigmentasyonun nasıl hızlı ve kesin bir şekilde ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Tekniğe hakim olmak çoğunlukla forsepslerin derinlemesine kullanılmasını gerektirir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin görüntüleme kısmı saatte 50 örnek hızında yapılabilir. Bu görüntülerden pigmentasyon önlemlerinin çıkarılması saatte 70 görüntü hızında yapılabilir.