Name: Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster karın pigmentasyonunu dijital görüntü analiziyle hızlı ve hassas bir şekilde nicelleştirme yöntemini. Bu teknik evrimsel biyolojide genetik lokusları ve morfolojik varyasyonları çalışmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma National Science Foundation tarafından IOS-1256565 ve AWS için IOS-1557638 tarafından finanse edildi. Patricia Wittkopp&#39;a ve bu yazının daha önceki bir sürümüne ilişkin yararlı yorumları için üç anonim gözden geçirenimize teşekkür ediyoruz.

1. Numune Montajı NOT: Görüntülemeden önce ölü sinekleri% 70 etanol içinde suda saklayın. <ol><li> 60 mm x 15 mm Petri kabında kaynar suda çözünen% 1.25 agara 10 mL koyun ve ayarlanmasına izin verin. </li><li> Bir diseksiyon mikroskopu altında, jelin yüzeyinde ~ 20 mm, 2 mm genişliğinde, 1 mm derin oluk yapmak için bir çift ince noktalı forseps kullanın. İnce forseps kullanarak, sinekin dorsal yüzü jelin üzerine çıkıntı yapacak şekilde yetişkin bir sinekin ventral yüzünü oyuğa gömer. NOT: Jelin gevşemesi, numuneye zarar vermeden kolayca yeniden konumlandırılmasını sağlar. Aynı oluk birden çok numune için kullanılabilir, ancak kirli, parçalanmış ve zamanla kullanılamaz hale gelecektir. Kullanıcı daha sonra aynı jöle içinde bir başka oluk daha yapabilir. Her plaka, ~ 200 sinek çekmek için kullanılabilir. </li><li> Mumu kütikülündeki herhangi bir ışık yansımasını azaltmak ve kanat hasarını önlemek için sudaki% 70 etanol içindeki numuneyi tamamen örtünÖrnek muamelesi. </li></ol> 2. Mikroskop Kurulumu NOT: Görüntüler, diseksiyon kapsamı, aktarılan ışık tabanı, dijital kamera ve gooseneck soğuk ışık kaynağı bilgisayar çalıştıran bir görüntü yakalama kontrol yazılımı kullanılarak eklenir. Yazılım talimatları, ImageJ 45&#39;i içeren açık kaynaklı bir yazılım olan Micro-Manager v1.4.20 44&#39;e özeldir. <ol><li> Mikroskopu, dijital kamerayı, çift gooseneck soğuk ışık kaynağını ve bilgisayarı açın. </li><li> Bir Micro-Manager penceresi ve bir ImageJ penceresi açmak için görüntü yakalama yazılımını çalıştırın. ImageJ penceresinde, tüm görüntüleri 8 bit olarak ayarlamak için &quot;Görüntü&quot;&gt; &quot;Tür&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot; seçeneğini tıklayın. Kameradan gerçek zamanlı bir önizleme gösteren bir &quot;Snap / Live&quot; penceresi açmak için Micro-Manager penceresinde &quot;canlı&quot; seçeneğini tıklayın. <ol><li> Ne olursa, &quot;Snap / Live&quot; penceresinin boyutunu en üst düzeye çıkarınyapanlara. Micro-Manager penceresinin &quot;Contrast&quot; sekmesindeki açılan &quot;Display mode&quot; menüsünde &quot;Grayscale&quot; seçin. </li></ol></li><li> Soğuk ışık kaynağını maksimum yoğunluğuna getirin ve her gooseneck ipuçlarını sahneden yaklaşık 120 mm (bir tanesi solda ve bir tanesi sağda) konumlandırın. NOT: Kullanıcılar dairesel bir aydınlatıcı kullanabilir, ancak bu sinek karın çevresinde bir yansıma ışığı halkası oluşturabilir. </li><li> Manuel olarak mikroskop büyütme değerini 60X yapın, böylece sahne alanı sahnede yaklaşık 3 mm çapında bir alan yakalar. </li><li> Sahneye 2 mm&#39;lik bir mikrometre yerleştirin (gerekirse arka planı beyaza çevirin). Canlı önizlemeye bakarken, sahne mikrometresine odaklanın ve &quot;Pozlama&quot; kutusundaki ms cinsinden pozlama süresini girerek Mikro-Yönetici penceresindeki pozlamayı ayarlayın. </li><li> Kamerayı mekansal olarak kalibre etmek için, &quot;düz çizgi&quot; aracını seçin.O ImageJ pencere ve sahne mikrometresi uzunluğu bir çizgi çizin. &quot;Ölçeği Ayarla&quot; penceresini açmak için ImageJ penceresinde &quot;Analiz et&quot;&gt; &quot;Ölçek Yap&quot; ı tıklayın, &quot;Bilinen mesafe&quot; kutusuna mikrometrenin uzunluğunu μm olarak girin ve &quot;Birim uzunluğu&quot; bölümüne &quot;μm&quot; girin. kutu. <ol><li> Bakınız &quot;Ölçeği Ayarla&quot; penceresinde ölçeği &quot;piksel / μm&quot; olarak görüntüler. Ölçeği not edin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li></ol></li><li> Sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalamak için &quot;Snap / Live&quot; penceresinde &quot;Stop&quot; (Durdur) ve ardından &quot;Snap&quot; (Sabitleme) düğmesini tıklayın. </li><li> Gerekirse görüntüleri tekrar mekansal olarak kalibre etme yeteneğinden emin olmak için görüntüyü 8 bitlik gri tonlamalı bir TIFF olarak kaydedin. ImageJ penceresinde &quot;Dosya&quot;&gt; &quot;Farklı Kaydet&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; seçeneğini tıklayın. Dosyayı tarayıcıda nereye kaydedeceğinizi belirtin, dosyayı adlandırın ve &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> Sahneyi siyaha çevir ve yerini değiştirSahnede agar içine monte edilmiş bir sinek tutan bir Petri tablası (adım 1.1-1.2). </li><li> Mikroskopta bakınız ve pıgmenti modelini en iyi görmek için dorsal orta hattın düz olduğunu doğrulamak için sinekleri konumlandırın. Karın görünümünün engellenmemesi için herhangi bir kanat ve uzantıları hareket ettirin. Pigmentli kütikül (a2-a5) görünmüyorsa, karnın yanal olarak sıkıştırın (buna rağmen, genellikle sinirlenmek için sineklerin% 70 etanol içinde depolanan sinekler). NOT: Sineği konumlandırırken kullanıcının daha düşük bir büyütme (20X) kullanması gerekebilir. Devam etmeden önce büyütme 60X değerine geri getirilmelidir. </li><li> Sinek karnına elle odaklanın. Dorsal abdomen üzerindeki gölgeleri ve yansımayı en aza indirgemek için ışık kaynağının ipuçlarını elle ayarlayın. </li><li> Bilgisayar ekranındaki canlı önizlemeye bakarken ve Micro-Manager penceresinin &quot;Contrast&quot; sekmesindeki piksel değer histogramını kullanırken,Önizleme görüntüsünün piksel değerlerinin aralığını en yükseğe çıkarmak için adım 2.4&#39;te açıklandığı gibi pozlamayı ayarlayın. </li><li> Sinek ve Petri kabını çıkarın ve sinek gibi aynı pozisyonda görüş alanına ortalanmış bir voltaj ölçerine bağlı bir LED (430-660 nm spektral çıktısı) ile değiştirin. LED ve voltaj ölçeri, ışık ölçer 46 olarak kullanın ve LED&#39;i vuran ışık (~ 125 mV) tarafından üretilen voltajı kaydedin. NOT: LED ve gerilim ölçer, ışık düzeylerinin tek bir denemedeki çoklu görüntüleme oturumlarında sabit kalmasını sağlamak için kullanılır. </li><li> Deney süresince, ışık kaynağının konumunu veya yoğunluğunu, mikroskopun büyütülmesini veya kameranın maruz kalmasını daha fazla değiştirmeyin. </li></ol> 3. Numune Görüntüleme <ol><li> Bir karın (adımları 1.1-1.3) monte edilmiş bir sinek tutan bir Petri kabı siyah mikroskop stage.Adjust konumda böylece sinek üçüncü ve fourt2.9. Adımda tarif edildiği gibi abdominal segmentler görülebilir ve dorsal orta çizgi düzdür. Devam etmeden önce büyütmede 60x olduğundan emin olun. </li><li> Mikroskopu, üçüncü ve dördüncü dorsal abdominal tergitlerin odaklanacağı şekilde elle odaklama. Adım 2.6&#39;da anlatıldığı gibi bir görüntüyü 8-bit gri tonlamalı bir TIFF olarak elde etmek için görüntü yakalama yazılımını kullanın. NOT: Görüntü renkle alınabilir ve daha sonra analiz için gri skala dönüştürülebilir. </li><li> 2. adımda açıklandığı gibi resmi &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot; olarak kaydedin. NOT: Burada [SESH] sabittir, oturum numarası [000] ve değişkentir, ancak üç basamaklı olmalı ve [sampleID] kullanıcının isteği ne olursa olsun, ek bir alt çizgi (_) karakteri içermemeli ve Sabit uzunlukta olmalı. [SampleID], pigmentasyon verilerinin ( örn. Sıcaklık veya soy) analizinde kullanılan faktörlerin ayrıntılarını içermelidir; ayırt edici olmayan alfabeCal karakteri, örneğin kısa çizgi (-). Bu, bu faktörlerin standart istatistik yazılımını kullanarak [sampleID] dışında kolayca ayrıştırılmasını sağlar. </li><li> Petri kabını sahneden çıkarın ve sineği bir sonraki numune ile değiştirin. Aydınlatma seviyelerini, büyütme veya pozlamayı daha fazla ayarlamadan tüm numuneler görüntülene kadar adım 3.1-3.3&#39;ü tekrarlayın. </li></ol> 4. Birden Fazla Oturum Arasında Görüntüleme <ol><li> Görüntülerin birden fazla oturumda ele alınması gerekiyorsa, oturum yoğunluğunu, pozlamayı ve büyütmeyi oturumlar boyunca koruyun. Her oturumun başında kameranın mekansal kalibrasyonunu (adım 2.4) ve sahnedeki ışık yoğunluğunu (LED / voltaj ölçeri, adım 2.12 ile ölçülen şekilde) kontrol edin. </li><li> Gerekirse, görüntüleri tekrar mekansal olarak kalibre etme yeteneğinden emin olmak için sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalayın ve kaydedin (adım 2.5-2.7). </li><li> En az 15 kontrol numunesi kullanın ve her seansda rasgele yeniden görüntü oluşturun.W oturum etkilerinin tespiti ve ortadan kaldırılması için. Oturumlar arasındaki yinelenen kontrol numunelerinin aynı [örnek kimlik] olduğundan farklı [SESH000] olduğundan emin olun. NOT: Kontrol numuneleri, deney numuneleri ile aynı şekilde toplanan, depolanan ve monte edilen sineklerdir, ancak seanslar boyunca yeniden imgelenmektedir. Kontrol numunelerinin kesin sayısı, kullanıcının deney düzeneğine bağlı olacaktır. Daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın. </li></ol> 5. Görüntü Analizi NOT: Görüntü analizi ImageJ 45&#39;te yapılır ve ek bir dosya olarak verilen &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; makrosunu kullanır. <ol><li> Analiz edilecek tüm görüntüleri aynı klasöre yerleştirin. </li><li> ImageJ&#39;yi başlatın ve dosya tarayıcısında &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; nü seçerek &quot;Eklentiler&quot;&gt; &quot;Makro&quot;&gt; &quot;Çalıştır&quot; ı tıklayarak &quot;Pigmentation.ijm Ölçümü&quot; makrosunu çalıştırın ve &quot;açık.&quot; NOT: Sonraki tüm adımlar makro içinde bulunur. Her adım, ayrı bir makro komuttur. </li><li> &quot;İşlemlerin Zorunlu Oldu&quot; iletişim kutusu açılır ve &quot;Görüntülerin depolandığı klasörü seç&quot; yazısı görüntülenir. &quot;Tamam&quot; a tıklayın ve resimleri içeren klasörü seçmek için dosya tarayıcıyı kullanın ve ardından &quot;seç&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Verilerin saklanmasını istediğiniz klasörü seçin&quot; şeklindeki bir &quot;İşlem Gerekli&quot; iletişim kutusu açılır. &quot;Tamam&quot; a tıklayın ve pigmentasyon profillerini kaydetmek için istediğiniz klasörü seçmek için dosya tarayıcısını kullanın. &quot;Seç&quot; i tıklayın. </li><li> &quot;Örnek kimliğinizde kaç tane karakter var?&quot; Sorusuyla ilgili bir iletişim kutusu açılır. Veri girişi kutusuna, adım 3.3&#39;te belirtildiği gibi [SampleID] içindeki karakter sayısını girin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> &quot;Yatırım Getiriniz ne kadar geniş?&quot; Sorusu ile bir iletişim kutusu açılır. Veri girişi kutusuna, anterior-(Yeşil dikdörtgen, Şekil 1G , Şekil 2A ve 2A &#39;). &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Varsayılan 20 pikseldir. NOT: Tüy ve kılların neden olduğu gürültüyü azaltmak için pigmentasyon profili, çizgi yerine kütikül şeridinde okunur. Bu şeridin genişliği resmin çözünürlüğüne bağlı olacaktır, ancak karnın genişliğinin ~ 1 / 20&#39;si piksel olarak olmalıdır. </li><li> Makronun ilk sinek görüntüsünü açacağına ve bir sonraki sinekte (&quot;Hayır&quot; ı tıklayın) devam etmek için mevcut sinek miktarını ölçmek (&quot;Evet&quot; tıklayın), yoksa bir sinek Makroyu tıklayın (&quot;İptal&quot; i tıklayın). </li><li> &quot;Dorsal karın orta çizgisini ANTERIOR&#39;dan POSTERIOR&#39;a tanımlayın&quot; şeklinde bir diyalog kutusunun açılacağını unutmayın. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Anteriordan posteriora bir çizgi çizerDorsal karın orta çizgisini tanımlamak için. &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Bakınız Şekil 2A ve 2A &#39;, sarı çizgi. NOT: Bu, resmin yönünü değiştirmek için, dorsal orta çizginin ekranda yatay olarak uzanması, sol ön kısım ise sonraki adımları kolaylaştırmak için kullanılır. </li><li> Not: &quot;Tergite 4&#39;ün POSTERIOR kenarını pigment bandının hemen arkasında tanımlayın&quot; şeklinde bir iletişim kutusu açılır. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Çizginin (beyaz bir kare ile işaretli) merkezinin pigment bandının (kütikül a5) arka kenarına sadece posterior olarak oturacağı şekilde, arka orta çizgiden sağ yanal kenara doğru bir çizgi çizin. &quot;Tamam;&quot; ı tıklayın. Bkz. Şekil 2A ve 2A &#39;, kırmızı çizgi. NOT: R yazısı pigmentleme profilinden pigment bandının arka kenarını otomatik olarak algılar. </li><li> Bir diyalogunKutusu açılır ve &quot;Tergite 4&#39;ün ANTERIOR kenarını pigmentli kütikülün ön kenarında (a2) tanımlayın&quot; şeklinde bir açıklama yapacaktır. &quot;Düz çizgi&quot; aracı zaten seçilmiş olacaktır. Çizginin merkezi (beyaz bir kare ile işaretli), pigmentli kütikülün (kütikül a2) ön kenarına oturacak şekilde, ön orta çizgiden sağ yan kenara bir çizgi çizin. &quot;Tamam;&quot; ı tıklayın. Bakınız Şekil 2A ve 2A &#39; , cam göbeği çizgi. NOT: R yazısı, bu noktayı, tergitin pigmentli manikürinin ön kenarı olarak tanımlayacaktır. Görüntü üzerinde makro, pigmentasyon profilinin okuduğu ilgi bölgesi (ROI) gösterecektir (yeşil dikdörtgen, Şekil 2A ve 2A &#39;, Şekil 2B ve 2B &#39; de büyütülmüştür). Makro, ROI için pigmentasyon profilini gösteren ikinci bir pencere açar (Şekil.<html> E 2C ve 2C &#39;), burada x ekseni, profilin arka kenarından gelen piksel sayısı olarak ifade edilen konumdur ve y ekseni, her konumdaki ortalama piksel değeridir. </li><li> Makro tarafından açılacak pigmentasyon profilinin grafiğini görüntüleyin. Gerektiğinde, pigmentasyon profilini etkileyecek herhangi bir yapı ( örn. Kıllar) içermemesi için ROI&#39;nın konumunu ayarlamak için profil penceresinde &quot;Canlı&quot; yı tıklayın. Profil tatmin edici olduğunda, &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> Tergite 3 için 5.8-5.11 adımlarını tekrarlayın. NOT: Makro, pigmentasyon profillerini her biri &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot; adlı iki CSV dosyası olarak dışa aktarır; burada [SESH000_samplename], resim adıdır ve [TX] üçüncü ve dördüncü tergitler için sırasıyla T3 veya T4&#39;tür. </li><li> Makronun bir sonraki resmi açtığına dikkat edin. Tüm görüntüler analiz edilene kadar 5.7-5.13 adımlarını tekrarlayın. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Veri Önişleme, Analiz ve Oturum Düzeltmesi NOT: Tüm veri analizi R 47&#39;de yapılır ve verilen &quot;Pigmentation.R Analizi&quot; komutunu kullanır. Aşağıda, &quot;L ...&quot;, analizin her bir parçası için komut satırının çalıştırılacağını belirtir. Analizin nasıl yapıldığı ile ilgili ek ayrıntılar için Ek Bilgi bölümüne bakın. <ol><li> Çalışma dizini (L6) ayarlamak için R komut dosyasını düzenleyin ve dosya yolunu .csv profillerini (L11) içeren klasöre tanımlayın. </li><li> Profil klasöründe saklanan pigmentasyon profillerinin bir listesini oluşturmak için L13-15&#39;i çalıştırın. </li><li> Profilleri tek bir veri çerçevesine okumak için &quot;okuyucu&quot; ve &quot;addPrimaryKey&quot; işlevlerini (L17-41) yükleyin ve çalıştırın. </li><li> Adım 2.5&#39;te belirlendiği üzere, resimlerin mekansal kalibrasyonunu μm / piksel cinsinden belirtmek için L43&#39;te komut dosyasını düzenleyin. </li><li> Yükle &quot;adjus&quot; u çalıştır(X ekseni, Şekil 2C ve 2C &#39;), ROI&#39;nin piksellerinden-posterior kenarına-ROI&#39;nin anterior-kenarından μm&#39;ye dönüştürmek için &quot;tents&quot; fonksiyonu (L46-58) ve Piksel değerinden (0 = siyah, 255 = beyaz) pigmentasyon değerine (0 = pigment yok, 255 = maksimum pigment) profil profili değeri (y ekseni, Şekil 2C ve 2C &#39;). </li><li> Pigmentasyon profilleri ve birinci ve ikinci türevlerinin kübik eğrisini oluşturmak için &quot;spline.der.er&quot; fonksiyonunu (L60-71) yükleyin ve çalıştırın ( Şekil 2D -2F ve 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Önce pigment bandının arka (T 3 ) ve anterior (T 2 ) kenarlarının konumunu çıkartmak için &quot;koord&quot; ve &quot;assmbly.coord&quot; fonksiyonlarını (L74-163) yükleyin ve çalıştırın ( Şekil 2D ve 2D &#39;; Ve a2 kütikülün arka kenarı (T1, Şekil 2D ve 2D &#39;) ve daha sonra sırasıyla T3 ve Tl&#39;de alınan maksimum (Pmax) ve minimum (Pmin) pigmentasyon değerlerini çıkarmak için kullanıldı. NOT: a2 manikür kutusunun ön kenarı adım 5.9&#39;da tanımlanmıştır. </li><li> İsteğe bağlı: Rastgele seçilmiş bir pigmentleme profili için &quot;koordinat&quot; fonksiyonunun T 1-3 konumlarını doğru olarak tanımlayıp tanımadığını kontrol etmek için &quot;chek&quot; fonksiyonunu (L165-175) yükleyin ve çalıştırın. </li><li> &quot;Oturum&quot;, &quot;Örnek&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (Numune ve Tergite&#39;nin bir birleşimi) başlıklar içeren bir veri tablosu oluşturmak için dizin ve ölçüm işlevlerini yükleyin ve çalıştırın (L178-193) &quot;P max &quot; &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot; (pigment bandının genişliği , = T3 - T2) ve &quot;W tergite &quot; (pigmentli c genişliğiAletler a2-a5, = T3). </li><li> Oturum etkileri nedeniyle ortaya çıkan sıkıntı faktörleri için P maks ve P min değerlerini düzelten bir veri tablosu oluşturmak için &quot;düzeltme&quot; fonksiyonunu (L196-234) yükleyin ve çalıştırın. Geçici olarak bitişik oturumlar boyunca tekrar görüntülemiş olan kontrol numunelerinden Pmax veya Pmin&#39;deki ortalama artış (veya düşüş) kullanın. </li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu metodoloji, çoklu akışaşağı analizler için uygun niceliksel formda pigmentasyon verilerinin hassas, hızlı ve tekrarlanabilir kazanılmasını sağlar. Yöntem, sineklerin izogenik bir çizgisinde sıcaklığın abdominal pigmentasyon üzerindeki etkileri hakkında veri edinmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, metodoloji bireyler, popülasyonlar veya türler arasındaki pigmentasyon farklılıklarının altında yatan genleri veya belirli genlerin pigmentasyon kalıpları üzerindeki etkilerini keşfetmek için ters genetik çalışmaları ...

Pigmentasyon, türler, popülasyonlar ve bireyler arasında ve hatta ontogeny sırasında bireyler arasında muazzam fenotipik varyasyon gösterir 1,2,3,4,5,6. Çok çeşitli hayvanlarda pigmentasyon üzerine yapılan sayısız araştırmalar olmasına rağmen, pigmentasyon, belki de en iyi Drosophila melanogaster&#39;da incelenmiştir ; burada moleküler genetiğin tam gücünün, pigmentasyonu düzenleyen gelişimsel ve fizyolojik mekanizmaları aydınlattığı ve bu mekanizmaların nasıl geliştiği , 6 . D. melanogaster 7,8&#39;deki pigmentlerin biyokimyasal sentezini düzenleyen genler ve zamansal ve uzamsal di&#39;yi kontrol eden genler hakkında çok şey bilinmektedirBu biyo sentezin mahsulü 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Dahası, genetik haritalama, D. melanogaster&#39;ın pigmentasyonundaki intra-ve spesifik farklılıkların altında yatan genetik lokusları belirledi 14,15,16,17. Pigmentasyon paternleri 15 , 21 , 22&#39;nin uyarlanabilir önemi olduğu gibi, davranış 18 , 19 ve bağışıklık 19 , 20 gibi pigmentasyon ve pleiotropik özellikler arasındaki ilişki de araştırılmıştır. Bu nedenle, D. melanogaster pigmentasyonu güçlü ama basit bir m olarak ortaya çıkmıştırKarmaşık fenotiplerin gelişimi ve evrimi için odel. Yetişkin D. melanogaster pigmentasyon vücudun, özellikle kanat ve dorsal göğüs ve karın üzerinde melanizasyon farklı desenler ile karakterizedir. Bununla birlikte, dorsal karında her kütikül plakasının (tergit) pigmentasyonu en fazla araştırma dikkati çekmiştir. Bu pigmentasyonda ( Şekil 1A -F ) genetik 17 , 23 ve çevresel 24 , 25 faktörlerden dolayı önemli farklılıklar vardır. Karın tergitinin kütikülü, ön ve arka gelişim bölmelerinden oluşur ( Şekil 1G ) ve bunların her biri pigmentasyon ve süsleme temelinde daha da alt bölümlere ayrılabilir 26 . Ön kompartıman altı adet kütikül(A1-a6) ve arka bölüm üç (p1-p3) içerir ( Şekil 1G ). Bunların arasından, p1, p2 ve aluminyum kütikül genellikle gerilmemiş abdomenlerde trolitin altına katlanarak gizli kalırlar. Güvenilir görünür kütikülün özelliği, burada &quot;pigment bandı&quot; olarak adlandırılan ve a4 (kıllı kıllı kıllı) ve beyazlatılmış (büyük kıllı kıllı kütikulak tipleri) grubun arka kenarında Ön kenardan daha yoğun olarak pigmentlenmiştir ( Şekil 1G ). Bu bandın ön kısmı, hafifçe pigmentli kıllı kütikülün, kılların öne arkasında (a2) değil, arka kısmında (a3) ​​bulunduğu bir bölgedir. Sinekler arasındaki pigmentasyon değişikliği hem pigmentasyon yoğunluğunda hem de pigment band genişliğinde gözlemlenir. Genelde varyasyon, en arka segmentlerde (abdominal segment 5, 6 ve 7) en büyük ve daha ön segmentlerde (abdominal seGents 3 ve 4) 24 . Dahası, D. melanogaster pigmentasyonunda cinsel bir dimorfizm vardır, erkekler genellikle tamamen pigmente beşinci ve altıncı karın tergitlerine sahiptir ( Şekil 4C ). D. melanogaster&#39;in karın pigmentasyonunda yapılan birçok çalışmada pigmentasyon kategorik veya sıradan bir nitelik olarak ele alınmıştır; desen kalitatif olarak 27 , 28 , 29 veya yarı kantitatif olarak 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 skalasında ölçülmüştür , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Bu yöntemler kesinlikle kaçınılmaz olarak eksiklik çekmektedir ve pigmentasyonun subjektif değerlendirmesine dayanıyorlar çünkü çalışmalardaki verileri karşılaştırmak zordur. Birkaç yazar, pigmentasyonun mekansal boyutlarını, 38 , 39 belirli bir kütikül tipinin pigmentasyon yoğunluğunu, 23 , 25 , 39 , 40&#39;u veya karın tergiti boyunca pigmentasyonun ortalama yoğunluğunu 41 , 42 , 43 olarak nicelendirdi. Bununla birlikte, bu niceleme yöntemleri abdominal pigmentasyonun yoğunluğunu ve mekansal dağılımını aynı anda ölçmez ve bu nedenle pigmentasyonun abd&#39;de nasıl değiştiği nüanslarını yakalamazOminal tergite. Ayrıca, bu 38 , 41 , 42 , 43 sayım yöntemlerinin birçoğu abdominal kütikülün diseksiyonu ve montajını gerektirir. Bu, hem zaman alıcıdır hem de örnekleri yok eder ve ek morfolojik analizler için kullanılamaz hale getirir. Karın pigmentasyonunun gelişimi ve gelişiminin anlaşılması derinleştikçe, hem mekansal dağılımı hem de pigmentasyon yoğunluğunu hızlı ve titizlikle ölçmek için daha karmaşık araçlar gerekecektir. Bu yöntemin genel amacı, D. melanogaster&#39;ın karın pigmentasyonunun tekrarlanabilir ve daha kesin bir ölçümünü elde etmek için dijital görüntü analizini kullanmaktır . Metodoloji üç aşamayı içermektedir. İlk olarak, yetişkin sineği yıkıcı olmayan bir şekilde monte edilir ve sırt karnının dijital bir görüntüsü alınır. İkinci olarak, bir ImageJ makrosunu kullanarak, kullanıcıA2 kütikülün önünden a5 kütikülün posterioruna (yeşil kutu, Şekil 1G ) uzanan, hem üçüncü hem de dördüncü abdominal segmentler üzerinde uzanan bir ön-arka piksel şeridi tanımlar. Bu şeridin genişliğindeki ortalama piksel değeri daha sonra uzun ekseni boyunca çıkarılarak, tergitin önünden posteriora değiştiği için pigmentasyonun mekansal dağılımını ve yoğunluğunu yakalayan bir profil oluşturur. Üçüncüsü, bir kübik mürekkep püskürtme metodu kullanılarak matematiksel olarak pigmentasyon profilini tarif etmek için bir R yazısı kullanılır. R betiği daha sonra, a2-a5 kütikül genişliğini, pigment bandının genişliğini ve pigmentasyonun maksimum ve minimum seviyelerini çıkarmak için spline&#39;ı ve birinci ve ikinci türevlerini kullanır. Metod, bu nedenle hem mekansal özellikleri hem de abdominal pigmentasyonun derinliğini nicelleştirir. Bu metodoloji, üçüncü ve dördüncü abdominal tergitlerin pigmentasyonunu,1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 numaralı çok sayıda önceki çalışmaların odağı haline geldi. Bu çalışmalar daha özel olarak ya da daha posterior tergitlerle birlikte yapıldı. Beşinci ve altıncı karın tergastan daha az değişken olmasına rağmen, üçüncü ve dördüncü tergitler erkeklerde tamamen pigmente değildir, bu nedenle bu protokol hem erkek hem de kadınlara uygulanabilir. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, protokol kadınlarda beşinci ve altıncı karın tergitlerinde pigmentasyon ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, pigmentasyon profilinin özelliklerini çıkarmak için kullanılan küçük değişiklikler, metodun pigmentasyondaki değişikliği niceliksel olarak belirlemek için kullanılmasına izin vermelidirorganizmalar.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Biyoloji Forseps</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Kapsamı</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Tabanı</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>Deveboynu Soğuk Işık Kaynağı</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Edinme Kontrol Yazılımı</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>Görüntü Analiz Yazılımı</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Veri</td><td>Analiz Yazılımı R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>Multimetre</td><td></td><td>Fluke Fluke 75 Serisi II</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri kabı Celltreat</td><td>Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Stage mikrometre</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

karın pigmentasyonunun karaciğer miktarında nicelleştirilmesi<em&gt; drosophila melanogaster</em

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentasyon, morfolojik olarak basit ancak oldukça uyarlanabilir nitelikte olan bir özelliktir. Morfolojik fenotiplerin gelişimini ve gelişimini anlamak için kapsamlı bir model olarak hizmet etmiştir. Drosophila melanogaster&#39;teki abdominal pigmentasyon, araştırmacıların morfolojideki inter-ve intraspecifik varyasyonların altında yatan lokusları tanımlamasına imkan tanımak için özellikle yararlı olmuştur. Ancak, D. melanogaster karın pigmentasyonu, niceliksel olarak değil, skorlama yoluyla, pıgmentasyon verilerine uygulanabilen istatistiksel analiz biçimlerini sınırlayan, büyük ölçüde tahlil edilmiştir. Bu çalışma, yetişkin D. melanogaster&#39;in karın pigmentasyon örneğinin çeşitli yönlerinin nicelleştirilmesini sağlayan yeni bir metodoloji tanımlamaktadır . Protokol örnek montaj, görüntü yakalama, veri çıkarma ve analiz içerir. Görüntü yakalama ve analiz özelliği makroları için kullanılan tüm yazılımlarAçık kaynaklı görüntü analizi için yazılmıştır. Bu yaklaşımın avantajı, farklı görüntüleme sistemleri arasında yüksek oranda tekrarlanabilir bir metodoloji kullanarak pigmentasyon özelliklerini tam olarak ölçebilmesidir. Teknik, yetişkin D. melanogaster&#39;in tergal pigmentasyon modellerindeki değişimi ölçmek için kullanılmış olmakla birlikte, metodoloji sayısız farklı organizmalardaki pigmentasyon kalıplarına esnek ve geniş ölçüde uygulanabilir.

Protokol, yetiştirme sıcaklığının abdominal pigmentasyon üzerine etkisini araştırmak için kullanılmıştır. Önceki çalışmalar , D. melanogaster 30 , 32 dahil olmak üzere, gelişim sıcaklığında bir artışın Drosophila&#39;nın çeşitli türlerinde abdominal pigmentasyon yayılımında bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir . Özellikle abdominal tergitler 3 ve 4&#39;te pigmentasyonun boyutu (pigment bandının geni...

Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster&#39;in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir.

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Bu metodolojinin genel amacı, meyve sineği Drosophila melanogaster'in abdominal pigmentasyonunu hızla nicelleştirmektir. Bu yöntem, evrimsel biyoloji alanındaki; türlere özgü morfolojik varyasyonların temelini oluşturan genetik lokusların belirlenmesi ve morfolojik fenotiplerin gelişimi ile evriminin anlaşılması gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kullanıcıların pigmentasyonun yayılımı ve derinliği dahil olmak üzere abdominal pigmentasyonun çeşitli yönlerini tahribatsız bir şekilde ölçmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntem, Drosophila melanogaster'in abdominal pigmentasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer Drosophila türlerine de uygulanabilir ve diğer böcekler ile hayvan taksonlarındaki pigmentasyon modellerini ölçmek için kolayca uyarlanabilir. Görüntüleme öncesinde, sineklerin pigmentasyonunu korumak için %70 ethanol içinde saklanabilirler. Görselleştirme işlemi için bir montaj pedi gereklidir.60 mm'lik bir Petri kabına, suda hazırlanmış %1,25'lik agar çözeltisinden yaklaşık 10 mL ekleyin. Mikroskop altında, ince uçlu bir pens yardımıyla jel içerisine 20 mm uzunluğunda, 2 mm genişliğinde ve 1 mm derinliğinde bir kanal açın. Tek bi

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Özellikler için Fenotipik varyasyon cis-düzenleyici element (CRE) dizileri kontrol eden gen ekspresyonu mutasyonlar sonucu. Drosophila melanogaster kullanmak için türetilmiş yöntemler kantitatif değişiklikte ya da doğal olarak meydana gelen CRE türevleri aracılı gen ekspresyonu mekansal ve zamansal kalıplarının seviyelerini karşılaştırmak.

Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis</emTransgenik>-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster</em

Pupa dönemi ve kanat pigmentasyon Drosophila guttifera ölçümü evreleme için protokol açıklanmıştır. Evreleme ve pigmentasyon miktar yetişkin özellikleri ile gelişimsel mekanizmaları eğitim için sağlam bir temel sağlamak ve özellik geliştirme interspecific karşılaştırma etkinleştirin.

Evreleme pupa dönemi ve ölçüm kanat pigmentasyon Drosophila guttifera yöntemleri

Drosophila kanser tedavisi için potansiyel uygulamaları ile tarama ilaçları için uygun yaygın olarak kullanılan deneysel bir modeldir. Burada, Heterokromatin oluşumunu teşvik küçük moleküllü bileşiklertarama için bir yöntem olarak Drosophila alacalı göz rengi fenotiplerin kullanımını açıklar.

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Yara kaynaklı poliploidizasyon, hücrelerin hücre kaybını telafi etmek için bölmek yerine boyut olarak büyüdüğü korunmuş bir doku onarım stratejisidir. Burada epitel yara onarım ploidy ve genetik düzenleme ölçmek için bir model olarak meyve sinek nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı bir protokoldür.

Yara kaynaklı Poliploidizasyonu Incelemek için Bir Drosophila Modeli

Melanosit fonksiyonlarının düzenleyicileri, pigmentasyon sonucundaki gözle görülür farklılıkları yönetir. Aday pigmentasyon geninin moleküler fonksiyonunu deşifre etmek bir zorluk teşkil eder. Burada, adayları tanımlamak ve bunları melanin içeriği ve melanosit sayısının düzenleyicileri olarak sınıflandırmak için bir zebra balığı model sisteminin kullanımını gösteriyoruz.

Zebra Balığı Kullanarak Pigmentasyon Düzenleyicilerini Tanımlamak için Ters Genetik Yaklaşım

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Drosophila göz sistemi, özellikle insan nörodejeneratif hastalıkları olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir araçtır. Bununla birlikte, kaba göz fenotiplerinin manuel olarak ölçülmesi önyargılı ve güvenilmez olabilir. Burada, göz fenotipini tarafsız bir şekilde ölçmek için ilastik ve Flynotyper'ın kullanıldığı bir yöntemi açıklıyoruz.

Drosophila melanogaster Göz Fenotiplerinin Ölçülmesi: ilastik ve Flynotyper'ı Entegre Eden Hesaplamalı Bir Yaklaşım

Burada, desenlenme ve büyüme kusurlarını ölçmek için yetişkin Drosophila gözlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için hızlı, düşük maliyetli bir iş akışı sunuyoruz. Nokta montajı, yüksek çözünürlüklü görüntü elde etme ve görüntü analizi ile numune hazırlama protokolümüzü açıklıyoruz.

Harici yetişkin Drosophila yapılarının miktarının belirlenmesi için hızlı ve basit bir iş akışı

Öğrenin Drosophila melanogaster karın pigmentasyonunu dijital görüntü analiziyle hızlı ve hassas bir şekilde nicelleştirme yöntemini. Bu teknik evrimsel biyolojide genetik lokusları ve morfolojik varyasyonları çalışmak için kullanılır.

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi

Daha fazla video keşfet