Name: Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren Trichoderma reesei Tütün Bitkilerinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Öğrenin, Trichoderma reesei kaynaklı rekombinant selüloz enzimi TrCel5A'nın tütün bitkilerinde geçici ifadesini ve enzimatik aktivite analizini. Bu yöntem, bitki biyoteknolojisi ve biyokütle dönüşümü çalışmaları için uygulanabilirlik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Bmbf Forschungsinitiative tarafından desteklenen &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für nutzung von BIOMASSE ölmek&quot; ve bilimi teşvik etmek için Alman federal ve eyalet hükümetleri tarafından Mükemmellik Girişimi aracılığıyla finanse edilmektedir Mükemmellik &quot;Biyokütle den Tailor-made Yakıtlar&quot;, bir küme ve Alman üniversitelerinde araştırma.

Vahşi tipli N. tabacum Bitkiler 1. Büyüme <ol><li> N. büyümek tabacum&#39;un L. cv. Toprak Petit Havana SR1 bitkiler, çimlenme için, normal saksı toprağı ile doldurulmuş uygun saksılara tütün tohumları yerleştirin. 2 hafta sonra, ayrı saksılara fidan aktarın. Sabit 22 ° C (karanlık dönemi) ya da 25 ° C (ışık periyodu) ile bir sera içinde bitkiler ve% 70 nispi hava nemi inkübe edin. 16/8 saat aydınlık / karanlık döngüsü aydınlatma sağlamak (örneğin Philips IP65 400 W lamba, 180 ľmol · sn -1 · m -2; λ = 400-700 nm) günlük ve su. </li></ol> TrCel5A ve TrCel5A mCherry Proteinlerin 2. Geçici İfade <ol><li> , Steril koşullar altında, Agarobacterium tumefaciens&#39;in tek koloniler (GV3101 :: pMP90RK GMR, KMR, RIFR) pTRAkc-ER-ya da TrCel5A pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry ve 10 ml maya özütü ihtiva eden bir Erlenmeyer şişesine transfer birini içeren almakseçimi için suyu (YEB, üretici talimatları uyarınca elde edilmiş) orta ve kanamisin (50 mg / ml), rifampisin (50 mg / ml) ve karbenisilin (100 mg / ml). 26 ° C&#39;de 36-40 saat ve 180 rpm&#39;de inkübe edin. Not: protein ifadesi için uygun yapılarının tasarımı, bu çalışmanın kapsamı dışında olduğu, ama rehberlik için, Maclean ve ark 13 ve Munro ve Pellham 14 yöntemleri yapı tasarımı için takip edilebilir.. </li><li> Yukarıda belirtilen antibiyotik konsantrasyonları ile 20 ml YEB aşılamak ve daha önce olduğu gibi aynı koşullar altında kuluçkalanması, her kültür, 200 ul al. </li><li> 36-40 saat sonra, 2 ul asetosiringon (200 uM son konsantrasyon), 100 ul% 40 (ağ / hac) glikoz çözeltisi ve 1 M MES tamponu, pH 5.6, 200 ul. Ekleyerek kültürleri preinduce Gecede inkübe. </li><li> 2x infiltrasyon tamponu (100 g / L sükroz, 3.6 g / L glukoz, 8,6 g / L Murashige ve Skoog bazal tuzlar, 100 ml hazırlanması,) Potasyum hidroksit kullanılarak pH 5.6 &#39;ya ayarlanır. </li><li> Bir 5-6 OD 600 ulaşıncaya kadar 1:05 seyreltmeleri ile kültürlerin OD 600 ölçün. OD 600 30 ml sızma ortamı için gerekli kültür hacmini hesaplayın. 2x tamponu infiltrasyonu 15 ml ilave edilir, daha sonra 30 ml kadar tampon için deiyonize H2O ekleyin. </li><li> Sera bitkileri alın ve sızma kolaylaştırmak için üstten 5 inci yaprak nick 3 rd abaxial tarafını bir pipet kullanın. </li><li> Sızmasını kolaylaştırmak için nick yaprakların abaxial tarafını bir pipet kullanın. </li><li> Infiltrasyon orta ile bir şırınga doldurun ve önceden yapılmış rumuz birinde (iğne olmadan) koydu. Adaksiyel yaprak tarafında bir parmak ile şırınga destekleyin. Aralarının yaprak bölgelerinin doku içine dikkatle orta basın. Not: infiltrasyonu sonra, yukarıda tarif edildiği gibi aynı koşullar altında bir sera içinde bitkiler yetiştirmek. Ayrıca, untr eşit oranda korumakSüzülmüş bitkilerin ile aynı koşullar altında kontrol olarak eated olmayan geçici ifade bitkileri (NTEPs). </li></ol> Bitki Leaves TrCel5A mCherry İfade 3. Değerlendirilmesi <ol><li> 4-6 gün sonra, A ile infiltre bitkileri almak seradan pTRAkc-ER-TrCel5A-mCherry içeren ve floresan analizi için karanlık bir odaya koyun tumafaciens. </li><li> Kırmızı bir filtre (620-750 nm) ile 515 nm yeşil ışık yayan, taşınabilir bir ışık kaynağı kullanılarak TrCel5A-mCherry, ışık bitkileri ifade yaprak bölümlerinde floresan görselleştirmek için. Not: Derinlemesine bitki yapraklarda protein ifade karakterizasyonu ışık ve floresan mikroskobu altında bir vibratome ve muayene ile ince kesit yaprakları ile elde edilebilir. Bunun için aşağıdaki adımları izleyin: <ol><li> Bir infiltre yapraktan yaklaşık 5 x 5 mm büyüklükteki, küçük bölümler kesin ve agaroz 50 mM fosfat tampon maddesi (pH 5.7) içinde çözülmüş% 4 onları gömmek. </li><li> KesimBir Vibratome kullanarak gömülü yaprakları 80-90 mikron boyutunda bölüm. Geçici bellek ya da bir kapak kayma ile kapatın ve yukarıda belirtilen aynı dalga boyu ve filtre kullanılarak, floresans dedektörü ile 10X büyütmede mikroskop kullanarak incelemek, bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. </li></ol></li></ol> Tütün yapraklarından 4.. TrCel5A Ekstraksiyon <ol><li> A ile enfekte bitkilerden, 1 g yaklaşık bir ağırlık tütün yaprakları parçalar keserek pTRAkc-ER-TrCel5A ve sıvı azot ile soğutulmuş bir havan içinde yer ihtiva tumefaciens. Örnekler, sıvı azot, uygun bir miktarda ekleyin. Taşlama bir soğutulmuş havan tokmağı kullanılarak toz halinde bırakır. </li><li> Zemin yaprak konuyla 1 mM fenilmetilsülfonil florür ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir 2 ml ilave edilir ve yaprak maddenin büyük çoğunluğu süspansiyon haline gelinceye kadar karıştırın. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 15,000 x g ve protein içeren süpernatant alır santrifüj ekstresi. </li><li> Centrifuge 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 15,000 xg&#39;de özü ve pelet bozmak için dikkatli olmak protein içeren süpernatant alır. Pelet atın. </li><li> Kısmen, 10 dakika boyunca 55 ° C&#39;de protein içeren süpernatant ile inkübe TrCel5A arıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 15,000 xg&#39;de santrifüj, sonra ilave bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dinlenmeye bırakın. Kontrol örnekleri elde olmayan infiltre bitkiler için kısmi saflaştırma işlemi tekrarlayın. Tüm deneyler için, bu, aşağıdaki örnekleri kullanarak. Not: Protein çözeltiler 3 aya kadar için en fazla 1 hafta ya da -20 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de muhafaza edilebilir. </li><li> Kontrol örnekleri elde olmayan infiltre bitkiler için kısmi saflaştırma işlemi tekrarlayın. Tüm deneyler için, bu, aşağıdaki örnekleri kullanarak. Not: Protein çözeltiler 3 aya kadar için en fazla 1 hafta ya da -20 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de muhafaza edilebilir. </li></ol> 5. SDS-PAGE, Western Blot ve TrCel5A-mCherry &lt;of Azo-CMC Zymography/ P&gt; <ol><li> Satın alma veya kurulmuş yöntemleri başına 15 (w / v) SDS-PAGE jelleri% 12 hazırlar. </li><li> % 1.5 (ağırlık / hacim) çözelti elde etmek için su içinde CMC çözülür. CMC-SDS-PAGE jelleri yapmak için, (a / h) CMC +% 12 (w / v% 0.1 &#39;de elde edilen, 10 ml SDS-PAGE jel karışım çözeltisi içinde su, 1 ml% 1.5 CMC 1 ml yerine ) SDS-PAGE jeli karışımı. Normalde jel dökün. Not: (doğrudan önce jel çözeltisinin hazırlanması için tekrar) orijinal çözelti içinde CMC tam olarak 40 ° C&#39;ye kadar karıştırma ve ısıtma kombinasyonu ile çözülür emin olun. </li><li> 12 bilinen yöntemlere uygun olarak, SDS varlığında kaynatılarak örnekleri denatüre. Bir pozitif kontrol olarak, T., bir ticari olarak temin edilebilir selülaz karışımı bir 1:500 seyreltme kullanın örneğin T. reesei gibi, reesei ATCC 26921. Negatif kontrol olarak non-infiltre yaprak (NTEPs) için, benzer şekilde hazırlanmış bir protein solüsyonu kullanın. </li><li> Normal protokoller başına 15 olarak elektroforezi yürütmek,boya cephesinin, jel tabanına erişmesine bir kez, örneğin durduruldu elektroforez ile ~ 50 dakika için 200 V kullanır. </li><li> % 0.1 kullanarak bir SDS-PAGE jel leke (ağ / hac) Coomassie parlak mavi ve bir metanol / buzlu asetik asit karışımını kullanarak destain. Not: Rapid boyama ve lekeleme destaining yavaşça ısıtılarak ve 10 dakika sonra çözelti destaining değiştirme, sıcak (ama kaynamaya) ilk olarak boyama ve daha sonra destaining çözeltiler için ~ 15 saniye boyunca bir mikrodalga kullanarak, yani solüsyonlar, lekenin tarafından yapılabilir veya soğutulmuş ve yeni destaining çözeltisi ile tekrar ne zaman. </li><li> Tespit edilmiş protokollerin 16,17 kullanılarak bir SDS-PAGE jel Western blotting yapın. (Ikincil) bir alkalin fosfataz konjuge edilmiş bir His-tag (birincil) ve bir poliklonal keçi anti-tavşan antikoru Fc bölgesine karşı bir poliklonal tavşan antikoru: Aşağıdaki antikorlar kullanın. Not: ikincil antikorlar nitroblue tetrazol kullanarak görselleştirme izin seçilmelidiryum chloride/5-bromo-4-chloro-3 &#39;indolyphosphate-p-toluidin tuzu (NBT / BCIP), 18, ​​tarif edildiği gibi. </li><li> % 0.15 &#39;in üzerinde tekrar katlama jel protein (w / v), oda sıcaklığında, β-siklodekstrin, 20 mM fosfat sitrat tamponu, pH 6.5, 1.5%&#39; si olarak jel inkübe edilerek (w / v) SDS-PAGE CMC jeli gerçekleştirme yumuşak, 15 dakika çalkalanarak 19. </li><li> Β-siklodekstrin çözeltisi ve kısa bir süre atın H2O ile jel yıkayın Ilave bir 15 dakika boyunca 50 mM sodyum asetat tamponu (pH 4.8) içinde oda sıcaklığında inkübe edin. 50 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 30 mM sodyum asetat tamponu pH 4.8 &#39;de inkübe jel ile katlanmış% 0.15 CMC SDS-PAGE jeli kullanılarak CMC zimografi gerçekleştirme </li><li> (W / v) SDS-PAGE CMC jeli, 50 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 30 mM sodyum asetat tampon maddesi (pH 4.8) &#39;de jel inkübe edilerek yeniden katlanmış% 0.15&#39; i kullanılarak CMC zimografi gerçekleştirme </li><li> Bir% 0.1 ile 10 dakika boyunca jel leke w / 30 dakika boyunca Congo kırmızı çözeltisi ve destain v ya da açık bantları 1 M Na kullanılarak gözlenmiştir kadarCl. Net görüntüleme için% 0.3 (v / v) asetik asit ile jel yıkayın. </li></ol> TrCel5A 6. 4-MUC Aktivite Deneyi <ol><li> % 50 içinde 10 mM 4-MUC (v / v) metanol içinde bir stok çözelti hazırlayın, ve oda sıcaklığında karanlıkta depolamak </li><li> Hemen önce tahlil için, bir 4-MUC 2x çalışan 1 mM 4-MUC oluşan solüsyonu ve 60 mM sodyum asetat, pH 4.8 hazırlanır. </li><li> (Endüklenen ifade edilen veya TrCel5A olmadan) yaprak protein 100 ul, T. 100 ul, bir ticari olarak temin edilebilir selüloz karışımı içeren bir numune üzerinde bu testi reesei 1:1,000 ve saf 2 H, O, sırasıyla. Üç nüsha olarak her örnek çalıştırın. </li><li> 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı 4-MUC çalışma çözeltisi Pipet 100 ul, daha sonra her bir numune 100 ul ilave edin. </li><li> 360 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak, flüoresan spektroskopisi 4-MU floresan 0 dakika zaman noktası belirler. </li><li> 20 plakaları inkübe50 ° C&#39;de min, buharlaşmayı önlemek için yapışkan kapak ile kaplıdır. Dondurma (veya ul 0.15 M glisin, pH 10.0, ve ayrı bir tabak içinde, örneğin her 100 ul 100 birleştirerek) ile reaksiyonu durdurun. </li><li> 360 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu kullanılarak, flüoresan spektroskopisi 4-MU floresan uç noktasını belirler. Floresans değerlerindeki değişikliği elde etmek için uç (20 dakika) 0 dakika zaman noktasında çıkarın. </li></ol> TrCel5A 7. Azo-karboksimetil selüloz Aktivite Deneyi <ol><li> % 1,5 &#39;lik bir stok hazırlanması (a / h), oda sıcaklığında muhafaza edilir ve Azo-CMC 18 mM çinko asetat, 0.5 M sodyum asetat, pH 5 ve% 80 etanol (v / v), oda deposu ihtiva eden bir çözelti, çökeltme sıcaklığı. </li><li> Hemen önce tahlil için,% 1 oluşan bir Azo-CMC 2x çalışma çözeltisi (w / v) Azo-CMC (H 2 O) ve 60 mM sodyum asetat, pH 4.8 hazırlanır. </li><li> Örnek 50 ul ve 50 ul çalışma birleştirin1.5 ml tüpler içinde çözelti ing. </li><li> (Geçici olarak ifade veya TrCel5A olmadan) yaprak protein 50 ul içeren test numuneleri; T. bir ticari olarak temin edilebilir selüloz karışımından 100 ul reesei 1:1,000 seyreltilmiş; ve saf 2 H O. Üç kopya halinde çalıştırmak numuneleri ve standartları. </li><li> 50 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe edin Çökeltme çözeltisinin 250 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. Vortex hızlı bir şekilde 10 saniye için her bir örnek çözümler tamamen birleştirildi sağlamak. </li><li> Tekrar 10 dakika ve daha sonra girdaplı oda sıcaklığında inkübe edin. 10 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de Santrifüj örnekleri. Pelet bozmaya dikkat ederek, 96 oyuklu bir plakaya her bir numune 200 ul süpernatan çıkarın. </li><li> 590 nm bir dalga boyunda emme spektroskopisi kullanılarak Deneyi. </li></ol> TrCel5A 8. PAHBAH Assay <ol><li> Filtre kağıdı bir daire (~ 5.5 mm çap) kesmek için bir delik yumruk kullanın. 100 ul 60 mM NaAc, pH 4.8, ve 1 ile eklemeÖrnekler, (endüklenen ifade edilen veya TrCel5A olmadan) yaprak ya da protein ihtiva eden bir ticari T. 00 ul reesei selülaz karışımı, 1:1000 seyreltilmiş ve 300 rpm çalkalanarak 50 ° C&#39;de 20 saat boyunca filtre kağıdı daireler ile inkübe edin. Filtre kağıdı ile kuluçkalanmıştır Her bir örnek için, aynı zamanda ayrı ayrı numune kontrol olarak filtre kağıdı olmadan yinelenen bir çözelti inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 100 mi çözeltisi toplam HCl ml konsantre edildi, ve mağaza ilavesi ile, H2O içinde PahBah çözülmesiyle bir 330 mM p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) çözeltisi A hazırlayın. Not: En iyi sonuçlar, H2O ile 100 ml hacim yapmadan önce çözülmesini için sıcaklık altında karıştırılır PAHBAH bulamacın örneğin, 30 ml, daha küçük bir hacme kadar HCI ekleyerek elde edilir </li><li> Oda sıcaklığında 50 mM sodyum sitrat, 10 mM kalsiyum klorür ve 500 mM NaOH ve mağaza içeren PAHBAH çözelti B hazırlayın. </li><li> Immedgeçirmeden önce tahlile, kullanılana kadar (4 saat içinde kullanılmalıdır) buz üzerinde 9 ml tampon çözelti, saklamak için 1 mi PAHBAH reaktifi bir 1.5x çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Isı ayarlı 0.2 veya 0.5 ml tüpler içinde örnekleri hazırlayın. Filtre kağıdı (adım 8.1), H2O içinde 45 ul ve PAHBAH çalışma çözeltisi 100 ul ile inkübe her bir çözeltinin 5 ul birleştirin. Numune kontrolleri (filtre kağıdı olmadan kuluçkaya örnekleri) aynı konsantrasyonlarda (5 ul örnek, 45 ul H 2 O, 100 ul PAHBAH çalışma çözeltisi) altında çalıştırmak gerekir. Ayrıca, 0 ve glukoz 0.2 g / L ihtiva eden 5 standartlarına (5 ul) ve saf 2 H O. testi Üç kopya halinde çalıştırmak numuneleri ve standartları. </li><li> 100 ° C&#39;de tam olarak 10 dakika süreyle inkübe edin, daha sonra tam olarak 10 dakika için oda sıcaklığında soğumaya. 410 nm bir dalga boyunda, 96 oyuklu bir plaka ve spektroskopik tahlil pipetleyin çözümler. Nihai elde numunelerden (filtre kağıdı olmadan kuluçkaya) bireysel örnek-kontrolleri çıkarmadeğerleri. </li></ol>

<ol><li>Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+for+biomass+degradation%3A+comparing+recombinant+cellulase+expression+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms.</a> Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).</li>
<li>Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inducible+expression+of+a+mesophilic+cellulase+avoids+adverse+effects+on+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development.</a> Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).</li>
<li>Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophilic+endoglucanase+for+in+planta+lignocellulose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion.</a> Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).</li>
<li>Sharma, A. K., Sharma, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plants+as+bioreactors%3A+recent+developments+and+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities.</a> Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).</li>
<li>Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco%2C+a+highly+efficient+green+bioreactor+for+production+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.</a> Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).</li>
<li>Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+study+of+Hypocrea+jecorina+Cel5A%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A.</a> Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).</li>
<li>Saloheimo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGIII%2C+a+new+endoglucanase+from+Trichoderma+reesei%3A+the+characterization+of+both+gene+and+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme.</a> Gene. 63, 11-21 (1988).</li>
<li>Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fluorescent+proteins%3A+innovations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered fluorescent proteins: innovations and applications.</a> Nature Methods. 6, 713-717 (2009).</li>
<li>Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retention+signal+for+soluble+proteins+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum.</a> Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).</li>
<li>Béguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cellulase+activity+in+polyacrylamide+gels+using+Congo+red-stained+agar+replicas%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas.</a> Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).</li>
<li>Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+enzyme+production+by+three+Penicillium+species+on+monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides.</a> Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).</li>
<li>Lever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+reaction+for+colorimetric+determination+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.</a> Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).</li>
<li>Maclean, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+papillomavirus+type+16+%28HPV-16%29+L1+expression+in+plants%3A+comparison+of+the+suitability+of+different+HPV-16+L1+gene+variants+and+different+cell-compartment+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization.</a> Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).</li>
<li>Munro, S., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+signal+prevents+secretion+of+luminal+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins.</a> Cell. 48, 899-907 (1987).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9CWestern+Blotting%E2%80%9D%3A+Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">“Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elelctrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets+-+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive+method+for+detection+of+alkaline+phosphatase-conjugated+anti-antibody+on+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.</a> Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).</li>
<li>Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+%CE%B2-cyclodextrin+on+the+renaturation+of+enzymes+after+sodium+dodecyl+sulfate%E2%80%93polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).</li>
<li>Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+molecular+farming+in+the+future%3A+transient+protein+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).</li>
<li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function%3A+Insights+from+sequence+analysis%2C+biophysical+measurements%2C+and+molecular+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Selülazlann Rekombinant ifadesi nedeniyle daha verimli biyoyakıt üretim sistemleri 1 için arzu, büyük ilgi alanıdır. Bitkiler, ekonomik hasat teknikleri ve büyük ölçekli biyoyakıt üretimi için çok cazip özellikleri olan autohydrolysis yöntemleri gibi özellikleri ile başarılı selülaz üretimi için pek çok olanak sunuyor. Ayrıca, proteinlerin üretilmesi için farklı lokalizasyonu kullanımı, gerekirse, translasyon sonrası modifikasyonlar 20 izin verir. Belirgin avantajlar sunarken, selülazlar esas ifade...

<html> Lignoselülozik biyokütle ve sıvı yakıt dönüştürülmesine Bozulması fosil yakıtlara bağımlılığı azaltmak için bir yöntem olarak tasavvur edilmiştir. Ekonomik açıdan biyokütle işleme sistemleri kurulmasında önemli bir engel selüloz ve hemiselüloz 1 enzimatik bozunma bulunmaktadır. Bitki ekspresyon sistemleri, bir endüstriyel ölçekte enzimlerin üretimi için büyük bir potansiyel göstermektedir. Onlar binlerce yıldır olduğu gibi hasat bitkilerin ekonomik ve hacim için Tarımsal sistemler zaten kurulmuş. Bitkilerdeki selülaz üretimi nedeniyle autohydrolysis 2&#39;nin kolaylığı ve bitki hücre duvarlarının 1 sindirilebilirliğini arttırarak düşük enzim seviyeleri kullanımını maksimize etmek için potansiyeli gibi faktörler arzu edilir. Son olarak, bitki sistemleri, bitki hücrelerinin belirli alanlarda rekombinant proteinlerin hedefleme izin ve posttranslationally gereklidir 3 enzimleri değiştirmek edebiliyoruz. &quot;ve_content&gt; Nicotiana tabacum (tütün), çok yaygın olarak nedeniyle hızlı büyüme ve biyokütle birikiminin özelliklerine 4, bitkilerde heterolog protein ifade araştırmaları için bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Rekombinant proteinlerin geçici ifadesi lokalizasyonuna olarak esnekliği ve böylece seçilen proteinler örneğin, selülazlar posttranslasyonel modifikasyonlar da, kısa zaman dilimleri 5 protein üretimini sağlayan bir tekniktir. Aynı zamanda, bitkilerde de sentezleme stratejileri için zemin ise bu, temel analiz için selülaz (ler) üretilmesini sağlar. Böyle bir strateji kullanarak geçici ifade, ev sahibi fungal Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) türetilen bir glikozil hidrolaz ailesi 5, Cel5A, 6 bir endoglukanaz (bundan sonra TrCel5A olarak anılacaktır) üretilir. TrCel5A doğal glikosile bir 42 kDa proteini olan ve hyd olarak oldukça aktiftirselüloz zincirler 7 roylzing. Burada anlatılan teknik, geçici ifade, bitki Agrobacteria uygun bir ekspresyon vektörü içinde, ilgi konusu geni taşıyan ile yaprakların süzülmesiyle, nispeten yaygın olarak kullanılan sistemine dayanır. Planta ifade başarılı hızlı analizi için izin vermek için, TrCel5A da mCherry, orjinal Discosoma sp türetilmiş bir monomerik floresan proteini ile bir füzyon proteini olarak ifade edilebilir. Protein birleşik bir ek altı Histidin artığı (His-tag) ile, 8, DsRed C-terminali (TrCel5A mCherry). Heterolog füzyon proteini, TrCel5A-mCherry, böylece sentezlenmesi MCherry dağılımı incelemek için yeşil ışık kullanarak büyüyen bitki içinde izlenebilir. Eğer arzu edilirse, bitki malzemesinin ince kesitler proteinin belirli bir yeri oluşturmak için mikroskobik olarak yeşil ışık altında incelenebilir. Bu çalışma, sinyal ve tran içinoturmak peptidler, endoplazmik retikulum 9, heterolog protein ihracat yerleştirmek üzere, yapı içinde yer almıştır. Selülaz aktivite testleri bir dizi çalıştırılabilir TrCel5A içeren bitki ifade selulazlann, etkinliğini analiz etmek. Toplam çözünür bitki proteinlerinin ekstre etmeden sonra, TrCel5A kısmen bir ısıda inkübasyon teknikle saflaştırılabilir. Protein boyutu Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile kurulur. Çözünürlük 10: (CMC karboksimetil selüloz hale getirmek) Zymography alt-tabakalar, karboksi-metile edilmiş, örneğin selüloz karşı aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Selülaz ve glukosidaz aktivitesi (4-MUC birleştirilmiş) β-D-sellobiyosid ilişkili fluorofor 4-metilumbelliferil-(4-MU) kullanılarak izlenebilir. Endoglukanaz etkinliğini değerlendirmek için başka bir yöntem, bir azo-d ile ilişkilendirilmiştir CMC spektrometrik analiz gerektirirye (Remazolbrilliant Mavi R) 11. Buna ek olarak, endoglukanaz ve selülazların bir dizi hem de protein aktivitesi, p-hidroksi benzoik asit hidrazid (PAHBAH) deneyi 12 gibi bir şeker analizi testinin kullanımı ile kontrol edilebilir. Bu teknikler ilgi ifade selülaz aktivitesini aydınlatmak ve ölçmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>4-metilumbelliferil ve beta;-D-selyobiyosid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>Asetosyringon (konsantre)</td><td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik - kanamisin</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik - rifampisin</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik - karbenisilin</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>Antikor - tavşan anti His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>Antikor - keçi anti tavşan AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Azo-karboksimetil selüloz</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-siklodekstrin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Karboksimetil selüloz</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma reesei</em'den selülaz> ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>Kongo kırmızısı</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie parlak mavi G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - glikoz</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı - Rotilabo kurutma kağıdı</td><td>ROTH</td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES tamponu</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesilsülfat</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>Toprak, Einheitserde classic&nbsp;</td><td>PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometresi - Sonsuz M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-Hidroksi benzhidrazid&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu</td><td>su ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>UV ışık kaynağı - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratom - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rekombinant cellulase cel5a İfade itibaren<em&gt; trichoderma reesei</em&gt; tütün bitkilerinde

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Selüloz alçaltıcı enzimler arasında, selülazlar, araştırma ve hem de sanayi ilgi hedeflerdir. Bu tür hifler-yapı mantar ve anaerobik bakteriler gibi zor-organizmaların kültür, bu enzimlerin üstünlüğü, bu alanda yeniden birleştirici teknolojilerin kullanımı hızlandırdı. Bitki ifade yöntemleri enzimler ve diğer endüstriyel olarak kullanışlı proteinlerin büyük ölçekli üretimi için arzu edilen bir sistemi vardır. Burada, Nicotiana tabacum bir mantar endoglukanazın, Trichoderma reesei Cel5A arasında geçici ekspresyonu için yöntemler gösterilmektedir. Başarılı bir protein sentezleme mCherry-enzim füzyon proteini kullanılarak floresan ile gözlenmiş gösterilmiştir. Buna ek olarak, temel testler bir dizi geçici ifade T. aktivitesini incelemek için kullanılır SDS-PAGE, Western blotting, zimografi, hem de ve floresan boya bazlı alt-tabaka bozulması deneyleri de dahil olmak üzere reesei Cel5A. Burada anlatılan sistem etkin bir hücre üretmek için kullanılabilirKısa bir süre içinde ulase, kurucu ya da uyarılabilir sentezleme sistemleri ile bitkilerde daha fazla üretim potansiyelini değerlendirmek üzere.

TrCel5A ve TrCel5A mCherry geçici ekspresyon sistemi (Şekil 1A ve 1B) kullanılarak başarılı bir şekilde tütün bitkilerinde ifade edildi. TrCel5A mCherry füzyon proteininin ifade deseninin incelenmesi sağlıklı yaprakları yeşil ışık (Şekil 1D) altında yaygın bir protein ekspresyonu gösterdi (Şekil 1 C) ortaya çıkardı. Toplam çözünür proteinlerin çıkarımı ihtiva yaprağı vardı tütün bitkileri üzerinde gerçekleştirilmiştir geçici...

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kısa bir zaman diliminde bitki tabanlı enzim ekspresyonunun fizibilitesi hakkında fikir edinmek için hedef proteinleri tütünde geçici olarak eksprese etmektir. Bu geçici ekspresyon, ikinci bir adım olarak, ilgilenilen geni içeren bir vektöre sahip bir agrobacterium tumor fain suşunun tütün yapraklarına infiltre edilmesiyle gerçekleştirilir. İnkübasyondan sonra infiltre edilmiş bitki yaprakları hasat edilir ve çalışılabilir bir enzim çözeltisi elde etmek için protein ekstraktları kısmen saflaştırılır. Ardından, bitki tabanlı ekspresyonun enzim üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve enzimatik aktivitesini doğrulamak için protein analizi gerçekleştirilir.Western blotting, zy ve substrat bozunma analizlerine dayanarak protein boyutu, olası glikozilasyon etkileri ve enzimatik aktiviteyi gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu yöntem, bitki biyokütle dönüşümü hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve ayrıca tütünde geçici olarak eksprese edilen enzimlerin aktivitesi hakkında bilgi sağlayabilir. İnfiltrasyon adımlarının, yaprakların şırınga ile kolayca zarar görmesi nedeniyle öğrenilmesinin zor olması sebebiyle bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir ve deneyleri steril koşullar altında gerçekleştireceğim.Tekil agrobacterium kolonilerini, 10 mililitre antibiyotikli maya özütü besiyeri içeren bir erlenmeyer flaskına aktarın. Ardından, inoküle edilen besiyerini 26 °C'de 180 RPM çalkalamayla 36 ila 40 saat boyunca inkübe edin; daha sonra her kültürden 200 µL'yi, öncekiyle aynı antibiyotikleri içeren 20 mililitre maya özütü besiyerine inoküle edin ve aynı koşullar altında 36 ila 40 saat boyunca inkübe edin.Kültürleri iki µL asetofenon, 100 µL %40'lık glukoz çözeltisi ve pH 5.6'da bir M MES tamponu ile indükleyin ve gece boyunca inkübasyona devam edin. Şimdi bitkileri seradan alın ve infiltrasyonu kolaylaştırmak için bir pipet ucu kullanarak bitkinin üstten üçüncü ile beşinci yaprağının AB aksiyel tarafına küçük bir çentik atın. Ardından bir şırıngayı infiltrasyon ortamı ile doldurun ve daha önce oluşturulan çentiklerden birinin üzerine yerleştirin.Şırıngayı aksiyel yaprak tarafında bir parmağınızla destekleyin ve besiyerini intravenöz yaprak bölgesine dikkatlice enjekte edin. TR cell 5:00 AM cherry eksprese eden yaprak kesitlerindeki floresansı görselleştirmek için bitkileri yeşil ışık yayan taşınabilir bir ışık kaynağı ile aydınlatın. Kırmızı bir filtre üzerinden bakıldığında, TR cell 5:00 AM cherry'den gelen floresans net bir şekilde görülecektir.Eksprese edilen proteinleri ekstrakte etmek için, AUM içeren P track ERTR cell five A ile infiltre edilmiş tütün yapraklarını seçin ve bunları bir gramlık parçalara bölün. Ardından, yaprakları önceden soğutulmuş bir havana yerleştirin ve örneklere uygun miktarda sıvı nitrojen ekleyin. Yaprakları bir havan eli kullanarak toz haline gelene kadar öğütün.Kontrol örnekleri elde etmek için işlemi infiltre edilmemiş tütün yapraklarıyla tekrarlayın. Ardından, öğütülmüş yaprak materyaline 1 mM fenil metil sülfonil florür içeren 2 mL PBS ekleyin ve yaprak materyalinin büyük çoğunluğu süspansiyona girene kadar karıştırın. Ekstraktı 4 °C'de 20 dakika boyunca 15.000 ×g'de santrifüjleyin.Ardından pelletten kurtulun, protein içeren SNAT'ı 55 °C'de 10 dakika inkübe ederek kısmen saflaştırılmış TR hücre beş A'yı hazırlayın ve oda sıcaklığında 10 dakika daha dinlenmeye bırakın. Daha sonra SNAT'ı oda sıcaklığında 15.000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Pelleti atın ve tüm işlemler için protein içeren SNAT'ı kullanın.Ek analizler. Kontrol örnekleri elde etmek için infiltre edilmemiş bitkiler için de kısmi saflaştırma işlemini gerçekleştirin. Bu prosedürde, %1.5'luk bir çözelti elde etmek için etil selüloz ve suyu karıştırın ve çözünene kadar karıştırarak inkübe edin.A-C-M-C-S-D-S sayfa jeli hazırlamak için, 10 mililitrelik bir SDS sayfa jel karışım solüsyonundaki bir mililitre su yerine bir mililitre %1,5 CMC koyun ve jeli normal şekilde dökün; ardından örnekleri SDS varlığında kaynatarak denatüre edin. Elektroforezi, boya önü jelin altına ulaşana kadar 200 volt ile 50 dakika boyunca gerçekleştirin. Şimdi, %15 C-M-C-S-D-S sayfa jeli üzerinde jel içi protein yeniden katlanması işlemini gerçekleştirin.pH 6.5'de 20 millimolar fosfat sitrat tamponunda %1,5 beta siklodekstrin kullanın. Jeli bu çözelti içinde, oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak 15 dakika boyunca inkübe edin. Beta siklodekstrin çözeltisini dökün ve jeli suyla kısaca yıkayın; ardından pH 4.8'de 50 millimolar sodyum asetat tamponunda oda sıcaklığında 15 dakika daha inkübe edin.Ardından, jeli 50 °C'de 20 dakika boyunca 30 millimolar sodyum asetat tamponu içerisinde inkübe ederek yeniden katlanmış nokta %15C-M-C-S-D-S sayfa jelini kullanarak CMC zy gerçekleştirin. CMC'nin nerede degrade olduğunu görselleştirmek için jeli %0,1 Kongo kırmızısı çözeltisi kullanarak 10 dakika boyunca boyayın ve bir molar sodyum klorür ile 30 dakika boyunca veya net bantlar gözlemlenene kadar boyasını giderin; sonunda jeli %0,3 asetik asit ile yıkayın. Analizi çalıştırmadan hemen önce daha net görüntüleme sağlamak için, dört MUC iki X çalışma çözeltisi hazırlayın ve bir 96 kuyucuklu plakanın ayrı kuyucuklarına 100 µL dört MUC çalışma çözeltisi pipetleyin.Ardından, her bir örneğin 100 µL'sini ilgili kuyucuklara ekleyerek, 360 nm eksitasyon dalga boyu ve 465 nm emisyon dalga boyu kullanarak her örneği üç tekrarlı olarak çalıştırın. Florasan spektroskopisi aracılığıyla sıfırıncı dakika zaman noktasındaki florasan değerini belirleyin. Daha sonra, plakaları yapışkan kapaklarla kapatarak 50 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, dondurarak reaksiyonu durdurun. Daha sonra, sıfırıncı dakika zaman noktasıyla aynı parametreleri kullanarak son nokta mu floresansını ölçün. Analizi çalıştırmadan hemen önce meydana gelen enzimatik aktiviteye bağlı floresans değişimini belirlemek için, 20. dakikadaki floresans değerinden sıfırıncı dakikadaki floresans değerini çıkarın.2X A-O-C-M-C çalışma çözeltisini hazırlayın. Ardından, 1,5 mililitrelik bir tüp içerisinde 50 mikrolitre numune ile 50 mikrolitre çalışma çözeltisini birleştirin. Sonrasında, numuneleri 50 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.250 µL çöktürme çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, örneğin çöktürme çözeltisiyle tamamen karıştığından emin olmak için her örneği 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Daha sonra örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve 1000 Gs'de 10 dakika santrifüjlemeden önce tekrar vorteksleyin.Ardından, her örnekten 200 µL SNAT'ı, bozmamaya dikkat ederek 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Pelet enzimatik aktivitesi, çözünmüş boyanın daha yüksek seviyeleri ile gösterilir. Bunu, 590 nm dalga boyunda absorbsiyon spektroskopisi kullanarak ölçün.Bu adımda, filtre kağıdı dairelerini 1,5 veya iki mililitrelik tüplere yerleştirin. Filtre kağıdı dairelerine 100 µL 60 mM sodyum asetat ve 100 µL örnek ekleyin ve 50 °C'de 300 RPM çalkalama ile 20 saat boyunca inkübe edin.Ek olarak, analizden hemen önce kontrol olarak filtre kağıdı içermeyen münferit örnekleri inkübe edin. Bir mililitre PABA çözeltisi A ve dokuz mililitre PABA çözeltisi B içeren 1,5 x PABA çalışma çözeltisi hazırlayın. Kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Ardından, örnekleri 0,5 mililitrelik ısıya dayanıklı tüplerde hazırlayın.Numuneler 45 µL su, filtre kağıdı ile inkübe edilmiş her bir solüsyondan beş µL ve 100 µL PABA çalışma solüsyonundan oluşur. Bundan sonra, aynı şekilde hazırlanan numune kontrollerini ve beş standardı çalıştırın. Ardından numuneleri, kontrolleri ve standartları tam olarak 10 dakika boyunca 100 °C'de inkübe edin ve 10 dakika daha oda sıcaklığında soğutun.Çözeltiden 100 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakaya pipetleyin ve bir spektrofotometre ile 410 nm dalga boyunda analiz edin. Salınan indirgen şeker miktarını belirlemek için, kontrol değerlerini filtre kağıdı örnek değerlerinden çıkarın. Burada, ekspresyon kasetlerinin yanı sıra tütün bitkilerindeki protein ekspresyonunu gösteren bir görüntü yer almaktadır.Bu, infiltre edilmiş bir tütün yaprağının normal ışık altında ve TR cell 5:00 AM cherry ifadesinin kırmızı renk ile burada açıkça görülebildiği kırmızı filtreli yeşil ışık altındaki görünümüdür. T cell five A'nın boyutunu ve aktivitesini gösteren SDS-PAGE jeli, western blot ve CMC zymogramı. Toplam çözünür proteinler ayrıştırılmıştır ve bunları Coomassie blue boyama ile görselleştirebiliriz. T cell five A'nın hist-tag bölgesine karşı yapılan western blotting, protein boyutunu doğrulamaktadır ve ek olarak CMC'ye karşı cellulase aktivitesi, Congo red ile boyanmış bir zymogram ile gösterilmiştir. Burada görülenler, TR cell five A'nın geçici olarak ifade edildiği tütün bitkisi yapraklarından elde edilen toplam çözünür proteinlerdir; termal çöktürme saflaştırması öncesi ve sonrası durumda TR cell five A en büyük görünür banttır ve ayrıca western blot ile CMC zymogramında da görülebilmektedir.Ayrıca, termal çöktürme sonrası Tcell five A içeren ve içermeyen tütün bitkilerinden elde edilen toplam çözünür proteinleri ve ticari olarak mevcut bir tresa sellulaz karışımından gelen proteinleri görüyoruz. Bu şekil, TR cell five A'nın enzim aktivite kantifikasyonunu göstermektedir; TR cell five A, dört MUC Azo CMC veya filtre kağıdı ile inkübe edilmiş ve substrat degradasyonu, fluoro four four mu azo boyasının salınımıyla veya bu prosedürü takiben PBA'nın renk değişiminden indirgen şekerlerin kantifiye edilmesiyle ölçülmüştür. Protein hedefleme gibi diğer yöntemler, protein lokalizasyonunun enzim stabilitesini ve aktivitesini nasıl etkileyebileceğine dair ek bilgiler sağlamak için kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, tütünde geçici protein ekspresyonunun nasıl gerçekleştirileceğine dair net bir anlayışa ve selüloz biyokütle dönüşümü için enzimatik aktivitenin nasıl değerlendirileceğine dair iyi bir bilgiye sahip olmanız gerekir.

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi...

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım...

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Bu bitkilerde monoklonal antikorlar ve raportör proteinlerin geçici transgen ifadesi üzerindeki düzenleyici elemanlar, bitki büyüme ve gelişme parametreleri ve inkübasyon koşullarının etkisini belirlemek ve modellemek için kullanılabilecek deneyler yaklaşımın bir tasarımını tarif eder.

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Öğrenin, Trichoderma reesei kaynaklı rekombinant selüloz enzimi TrCel5A'nın tütün bitkilerinde geçici ifadesini ve enzimatik aktivite analizini. Bu yöntem, bitki biyoteknolojisi ve biyokütle dönüşümü çalışmaları için uygulanabilirlik sağlar.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren

Daha fazla video keşfet