Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren Trichoderma reesei Tütün Bitkilerinde

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kısa bir zaman diliminde bitki bazlı enzim ekspresyonunun fizibilitesi hakkında bir fikir edinmek için hedef proteinleri tütünde geçici olarak eksprese etmektir. Bu geçici ekspresyon, tütün yapraklarının, ikinci adım olarak ilgilenilen geni içeren bir vektör içeren bir agrobacterium tümör fain suşu ile sızmasıyla elde edilir: İnkübasyondan sonra, sızan bitki yaprakları hasat edilir ve protein ekstraktları, çalışan bir enzim çözeltisi elde etmek için kısmen saflaştırılır. Daha sonra, bitki bazlı ekspresyonun enzim üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve enzimatik aktivitesini doğrulamak için protein analizi yapılır.

Western blotting, zy ve substrat bozunma deneylerine dayalı protein boyutu, olası glikozilasyon etkileri ve enzimatik aktiviteyi gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, bitki biyokütle dönüşümü ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve ayrıca tütünde geçici olarak ifade edildikten sonra enzimlerin aktivitesi hakkında fikir verebilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü yaprakların şırınga, herger giysileri tarafından kolayca zarar görmesi nedeniyle sızma adımlarının öğrenilmesi zordur ve deneyleri steril koşullar altında gerçekleştireceğim.

Tek agrobacterium kolonilerini 10 mililitre içeren bir erlenmeyer şişesine aktarın. Maya özü antibiyotikli et suyu. Daha sonra aşılanmış suyu 36 ila 40 saat boyunca 26 santigrat derecede 180 RPM çalkalayarak inkübe edin, ardından her kültürden 200 mikrolitre 20 mikrolitre maya ekstraktı suyuna daha önce olduğu gibi aynı antibiyotiklerle aşılayın ve 36 ila 40 saat sonra aynı koşullar altında inkübe edin.

Kültürleri iki mikrolitre asetofenon, 100 mikrolitre% 40 glikoz çözeltisi ve 200 mikrolitre bir molar MES tamponu ile pH 5.6'da indükleyin ve gece boyunca inkübe etmeye devam edin. Şimdi bitkileri seradan alın ve sızmayı kolaylaştırmak için üçüncü ila beşinci yaprağın AB eksenel tarafını bitkinin tepesinden çentiklemek için bir pipet ucu kullanın. Daha sonra bir şırıngayı sızma ortamı ile doldurun ve daha önce yapılmış çentiklerden birine yerleştirin.

Şırıngayı axio yaprağı tarafında bir parmağınızla destekleyin ve ortamı intravenöz yaprak bölgesine dikkatlice enjekte edin. TR hücresini ifade eden yaprak bölümlerindeki floresansı görselleştirmek için 05:00 kiraz, bitkileri yeşil ışık yayan taşınabilir bir ışık kaynağıyla parlatın. Kırmızı bir filtreden bakıldığında, TR hücresi 05:00 kirazından gelen floresan açıkça görülecektir.

Eksprese edilen proteinleri ekstrakte etmek için, P izi ERTR hücresi beş A içeren AUM ile sızmış tütün yapraklarını seçin ve bunları bir gramlık parçalar halinde kesin. Daha sonra, bunları önceden soğutulmuş bir harç içine koyun ve numunelere uygun miktarda sıvı nitrojen ekleyin. Yaprakları bir havaneli kullanarak toz haline getirin.

Kontrol numuneleri elde etmek için işlemi sızmamış tütün yaprakları ile tekrarlayın. Daha sonra öğütülmüş yaprak maddesine bir milimolar fenil metil süen florür içeren iki mililitre PBS ekleyin ve yaprak maddesinin çoğunluğu süspansiyon haline gelene kadar karıştırın. Ekstraktı 15.000 GS'de dört santigrat derecede 20 dakika

Daha sonra, S natin içeren proteini 55 santigrat derecede 10 dakika inkübe ederek kısmen saflaştırılmış TR hücresi beş A'yı atın ve 10 dakika daha oda sıcaklığında dinlenmeye bırakın. Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 15.000 GS'de bir SNAT santrifüjleyin. Peletleri atın ve herkes için snat içeren proteini kullanın.

Daha fazla tahlil. Ayrıca, kontrol numuneleri elde etmek için sızmamış bitkiler için kısmi saflaştırma işlemini gerçekleştirin. Bu prosedürde,% 1.5'lik bir çözelti elde etmek için etil selüloz ve suyu karıştırın ve eriyene kadar karıştırarak inkübe edin.

A-C-M-C-S-D-S sayfa jeli yapmak için, 10 mililitrelik bir SDS sayfa jel karışımı çözeltisinde bir mililitre su için bir mililitre% 1.5 CMC'yi değiştirin ve jeli normal olarak dökün, daha sonra numuneleri SDS varlığında kaynatarak denatüre edin. Elektroforezi 200 voltta 50 dakika boyunca boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar gerçekleştirin. Şimdi %15 C-M-C-S-D-S sayfa jeli üzerinde jel proteini yeniden katlama işlemini gerçekleştirin.

pH 6.5'te 20 milimolar fosfat sitrat tamponunda %1.5 beta siklodekstrin kullanılması. Jeli bu çözelti içinde oda sıcaklığında 15 dakika hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Beta siklodekstrin çözeltisini atın ve jeli oda sıcaklığında 50 milimolar sodyum asetat tamponunda pH 4.8'de 15 dakika daha inkübe edilmiş su ile kısaca yıkayın.

Ardından, jeli 30 milimolar sodyum asetat tamponunda 50 santigrat derecede 20 dakika inkübe ederek yeniden katlanmış nokta% 15 C-M-C-S-D-S sayfa jeli kullanarak CMC zy gerçekleştirin. CMC'nin nerede bozulduğunu görselleştirmek için, jeli %0.1 Kongo kırmızısı solüsyonu kullanarak 10 dakika lekeleyin ve 30 dakika boyunca bir molar sodyum klorür kullanarak veya sonunda net bantlar gözlenene kadar alıkoyun, jeli %0.3 asetik asit ile yıkayın. Testi çalıştırmadan hemen önce daha net görüntüleme için, 100 mikrolitre dört MUC çalışma solüsyonunu 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına pipetle dört MUC iki X çalışma solüsyonu hazırlayın.

Daha sonra, her bir numuneden 100 mikrolitreyi uygun kuyucuklara ekleyin, her numuneyi 360 nanometrelik bir uyarma dalga boyu ve 465 nanometrelik bir emisyon dalga boyu kullanarak üçlü olarak çalıştırın. Floresan spektroskopisi ile dört mu floresansın sıfır dakikalık zaman noktasını belirleyin. Daha sonra, yapışkan kapaklarla kaplı plakaları 20 dakika boyunca 50 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, dondurarak reaksiyonu durdurun. Bundan sonra, sıfır dakika zaman noktası ile aynı parametreleri kullanarak mu floresan uç noktasını ölçün. Testi çalıştırmadan hemen önce enzimatik aktivitenin neden olduğu floresan değişikliğini belirlemek için sıfır dakikadaki floresan değerini 20 dakikadaki floresan değerinden çıkarın.

A-O-C-M-C two X çalışma çözümünü hazırlayın. Daha sonra 50 mikrolitre numuneyi ve 50 mikrolitre çalışma solüsyonunu 1,5 mililitrelik bir tüpte birleştirin. Daha sonra, numuneleri 50 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

250 mikrolitre çökeltme çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun. Daha sonra, numunenin çökeltme çözeltisi ile tamamen karışmasını sağlamak için her bir numuneyi 10 saniye kuvvetlice vorteksleyin. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve 1000 Gs'de 10 dakika santrifüjlemeden önce tekrar vorteksleyin.

Bundan sonra, her numuneden 200 mikrolitre SNAT'ı rahatsız etmeden 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Pelet enzimatik aktivitesi, daha yüksek seviyelerde çözünmüş boya ile gösterilir. Bunu 590 nanometre dalga boyunda emici spektroskopi kullanarak ölçün.

Bu adımda. Filtre kağıdı halkalarını 1,5 veya iki mililitrelik tüplere yerleştirin. Filtre kağıdı halkalarına 100 mikrolitre 60 milimolar sodyum asetat ve 100 mikrolitre numune ekleyin ve 300 RPM çalkalama ile 50 santigrat derecede 20 saat inkübe edin.

Ek olarak, testi çalıştırmadan hemen önce kontrol olarak filtre kağıdı olmadan tek tek numuneleri inkübe edin. Kullanana kadar buz üzerinde B.Store bir mililitre PBA çözeltisi A ve dokuz mililitre PABA çözeltisi içeren 1.5 x PABA çalışma çözeltisi hazırlayın. Ardından, numuneleri 0,5 mililitrelik termo stabil tüplerde hazırlayın.

Numuneler 45 mikrolitre su, her çözeltiden beş mikrolitre filtre kağıdı ile inkübe edilmiş ve 100 mikrolitre PABA çalışma çözeltisinden oluşur. Bundan sonra, numune kontrollerini ve aynı şekilde hazırlanmış beş standardı çalıştırın. Daha sonra numuneleri, kontrolleri ve standartları 100 santigrat derecede tam olarak 10 dakika inkübe edin ve oda sıcaklığında 10 dakika daha soğutun.

Çözeltinin 100 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin, bu da 410 nanometre dalga boyunda bir spektrofotometre ile bir tahlildir. Salınan indirgeyici şeker miktarını belirlemek için filtre kağıdı numune değerlerinden bireysel numune kontrol değerlerini çıkarın. İşte tütün bitkilerinde protein ekspresyonunun yanı sıra ekspresyon kasetlerini de gösteren bir resim.

Bu, sızmış bir tütün yaprağının normal ışık altında ve kırmızı bir filtre ile yeşil ışık altında nasıl göründüğüdür, burada kırmızı renkle gösterilen TR hücresi 05:00 kirazının ifadesi burada açıkça görülebilir. T hücresi beşin boyutunu ve aktivitesini gösteren SDS sayfası jel western lot ve CMC zy, A.Toplam çözünür proteinler ayrılmıştır ve bunları kumasi mavisi boyama ile görselleştirebiliriz, T hücresi beşin hist tag bölgesine karşı Western blotlama, protein boyutunu doğrular ve ayrıca CMC'ye karşı selülaz aktivitesi, Kongo kırmızısı ile boyanmış bir ksenogreft ile gösterilir. Burada görülebilen, TR hücresi beş A'nın termal yağış saflaştırmasından önce ve sonra geçici olarak eksprese edildiği tütün bitkisi yapraklarından elde edilen toplam çözünür proteinlerdir, burada TR hücresi beş A en büyük görünür banttır ve ayrıca batı lotunda ve CMC'lerin igrafında da görülebilir.

Ayrıca, Tcell five A'nın termal yağıştan sonra da olmadığı tütün bitkilerinden elde edilen toplam çözünür proteinleri ve ticari olarak temin edilebilen bir tresa selülaz karışımından elde edilen proteinleri görüyoruz. Bu şekil, TR hücresi beşin enzim aktivitesi miktar tayinini göstermektedir TR hücresi beş A, dört MUC Azo CMC veya filtre kağıdı ile inkübe edildi ve substrat bozunması, floro dört dört mu azo boyasının salınmasıyla ölçüldü veya bu prosedürü takiben PBA'nın renk değişiminden indirgeyici şekerlerin miktarı belirlendi. Protein hedefleme gibi diğer yöntemler, protein lokalizasyonunun enzim stabilitesini ve aktivitesini nasıl etkileyebileceğine dair ek bilgi sağlamak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, artık proteinlerin tütüne geçici olarak nasıl ifade edileceğine dair net bir anlayışa sahip olmanın yanı sıra, enzimatik aktivitenin nasıl değerlendirileceğine dair iyi bir bilgiye sahip olmalısınız. Foro selüloz biyokütle dönüşümü.