Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Hücresel fonksiyonların manipülasyonu, son 15 yıl içerisinde klasik DNA transfeksiyonu veya viral transdüksiyon yaklaşımlarıyla gerçekleştirilebilmekteydi. Bu süreçte başka bir yöntem gelişmiştir. Protein transdüksiyonu ile biyolojik olarak aktif proteinler, hücresel alımı artıran ve ilgilenilen proteine füzyonlanmış küçük peptitler kullanılarak doğrudan memeli hücrelerine iletilebilmektedir.

Herhangi bir DNA kullanılmadığı için, ekzojen ajanogenez riski önlenmiş olur. Yukarıda belirtilen klasik yöntemlerin aksine, protein transdüksiyonu proteinlerin titrasyon yapılabilir bir şekilde iletilmesini sağlar.

Ayrıca, post-mitotik nöronlar gibi bölünmeyen hücrelerin yanı sıra küçük hücre popülasyonları da modüle edilebilir. Rekombinant proteini verimli bir şekilde eksprese etmek için Paciz vektör sisteminin kullanımını öneriyoruz. Bu sistem, bir N-terminal ve bir C-terminal varyantından oluşan modüler bir vektör sistemidir.

Her iki vektör de saflaştırma amacıyla ilgi duyulan geninizin kolayca yerleştirilmesine olanak tanır. Bir histidin etiketi ile bir protein transdüksiyon alanı entegre edilmiştir. Bizim durumumuzda, hücresel dağılım için hücresel alımı teşvik eden HIV virüsünden türetilmiş bir alan kullanılmıştır.

Kontrol amaçlarıyla vektör, bir nükleer lokalizasyon sinyali ile tamamlanır; füzyon etiketleri basitçe kaldırılabilir. Bunun yanı sıra, bu etiketlerin düzenlemesi, füzyon proteinlerinin özellikleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Verim ve saflığın yanı sıra satılabilirlik ve biyolojik fonksiyon üzerindeki etki öngörülemez.

Merhaba, benim adım Bernard Mus ve Almanya'daki Bond Rekonstrüktif Nörobiyoloji Enstitüsü'ndeki Kök Hücre Mühendisliği grubunda çalışıyorum. Merhaba, benim adım Christoph P ve ben de Hoover Laboratuvarı'nın bir üyesiyim. Çalışma grubumuz, biyolojik olarak aktif proteinleri çeşitli memeli hücrelerine doğrudan iletmek için protein transdüksiyon tekniğini yoğun bir şekilde kullanmaktadır ve bugün size e coli içerisinde ekspresyon ve saflaştırma sürecinde rehberlik etmek istiyoruz.

Ardından, tüm ekspresyon, saflaştırma ve uygulama prosedürünü örneklendirmek için hücre kültüründe hücreye sabitlenmiş füzyon proteininin nasıl uygulanacağını göstermek istiyoruz. Fare onik kök hücrelerini genetik olarak modifiye etmek için bölgeye özgü rekombinasyon Cree'den yararlanıyoruz.Tamam.Tamam. Hadi başlayalım.

Gece boyu kültürü inoküle etmek için, -80 °C'de gliserol stokunda saklanan, önceden transforme edilmiş bakterileri kullanıyoruz. Bu bakteriler halihazırda decre rekombinasyonunu kodlayan vektörü içermektedir. Bir pipet ucu kullanarak, bakterilerden küçük bir miktarı pipet ucuna sıyırıyoruz ve bunu gece boyu kültürünü içeren behere damlatıyoruz.

Gece boyu kültür, son konsantrasyonu 0.5% glukoz ve ml başına 50 µg karbonik insülin ile desteklenmiş LB besiyerinden oluşur. Beher, ardından bölgeye özgü Rekombinant Cre'nin ekspresyonu için 37 °C'de çalışan bir inkübatöre yerleştirilir. Büyük ölçekli ekspresyon kültürümüz için önceden ısıtılmış TB besiyeri kullanıyoruz.

Ekspresyonu hızlandırmak için, rekombinant proteinin ekspresyonu sırasındaki sıcaklığı temsil eden 37 °C'ye ısıtılmış TB besiyerinin kullanımını öneriyoruz. Ardından, TB besiyerine son konsantrasyonu 0,5% olacak şekilde glikoz ekleriz. Glikoz, indüksiyon öncesi ekspresyon kültürünün büyümesi sırasında füzyon proteininin bazal ekspresyonunun artmasını önler. Son olarak, yalnızca protein kodlayan plazmidi taşıyan bakterilerin bulunduğu saf bir kültür sağlamak amacıyla, ekspresyon kültürüne son konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde ampisilin eklenir.

Şimdi gece boyu kültüre edilen örneğimizi alabilir ve ekspresyon kültürünü 1:50 oranında inoküle edebiliriz. Beherler daha sonra 37 °C sıcaklıkta çalışan bir inkübatöre aktarılır. Ekspresyon boyunca optik yoğunluğu ölçmek için düzenli aralıklarla örnekler almalısınız.

Kültür 1,5 optik yoğunluğa ulaştığında, bakteriler 0,5 millimolar nihai konsantrasyondaki IPTG ile indüklenir. Bir saatlik indüksiyonun ardından, ekspresyon kültürü tüplere aktarılır ve ardından santrifüj yoluyla hasat edilir. Bu amaç için SLA 3000 rotor kullanmaktayız.

Santrifüj, 4 °C'de 10 dakika boyunca dakikada 5,000 devir hızda çalıştırılır. Ardından süpernatan uzaklaştırılır ve bakteri peleti -20 °C'de süresiz olarak saklanabilir. Dondurulmuş peletler, bir litre ekspresyon kültürüne karşılık gelen miktarda Lizza tamponu içinde yeniden süspanse edilir.

10 mL lizza tamponu kullanıyoruz ve çözelti homojen hale gelene kadar yaklaşık 15 dakika bekliyoruz. Ardından, süspansiyonun her mL'si için bir miligram lizozim eklenir. Enzimin bakterileri parçalamasına izin vermek için çözelti 20 dakika boyunca karıştırılır.

Ardından, DNA'yı keserek daha az viskoz bir çözelti elde etmek amacıyla 1/1000 seyreltme oranında Benzon nükleaz 15 dakika boyunca eklenir. Son olarak, hücrelerin lizisini sağlamak için bir sonikatör kullanılır. Sertifikasyon tamamlandıktan sonra program, %45 güçle bir buçuk dakika boyunca çalıştırılır.

Buradaki her adımdan, kaba lizattan veya saflaştırmanın SDS page analizinden bir örnek almayı unutmayın. Gliserol stok içinde proteinler çökmeye eğilimli olacağı için, süspansiyonun her mL'si başına 1 mL buz gibi soğuk TSB tamponu eklemek şu an gerçekten önemlidir. Bu adımı atlayacaksanız, çözelti kısa süre karıştırılır ve kaba lizat artık santrifüj için hazırdır.

Bu amaçla, SS 34 rotoru kullanıyoruz. Santrifüj, 4 °C'de 30 dakika boyunca 17.000 RPM'de çalıştırılır. İşlem tamamlandığında, süpernatan dikkatlice taze 50 ml Falcon tüplerine aktarılır.

Şimdi süpernatanta nikel anti A süspansiyonu ekleyin. Anti A, histidin etiketli füzyon proteinlerinin uygun şekilde saflaştırılması için kritik bir reaktiftir. Histidin, nikel iyonları ile bir kompleks oluşturarak afinite saflaştırmasını sağlar; şimdi parkチューブları (santrifüj tüplerini) 40 °C'de 60 dakika boyunca nazikçe çalkalayın.

Bir saat sonra, süspansiyonu 20 ML kolonlara uygulayabilir ve solüsyonun yer çekimi akışıyla geçmesine izin verebilirsiniz. Büyük ölçekli üretimler için, süspansiyonu birkaç kolona bölmek mümkündür. Daha sonra kolonu, 15 millimolar innersole içeren bir tampon ile iki kez yıkarız.

Uygulanan tampon miktarı, reçine hacmine bağlıdır. Yıkama işlemleri için iki mL nikel NTA, bir ml reçineye karşılık gelir. Yıkama işleminden sonra kolona beş reçine hacmi kadar yıkama tamponu ekleriz; artık proteinimizi elüe etmeye hazırız.

Bu nedenle, 250 millimolar konsantrasyonda imüno içeren bir elüsyon tamponu kullanıyoruz. Reçinenin renginin yeşile doğru nasıl değiştiğine dikkat edin. CRE proteininin yüksek konsantrasyonları nedeniyle, OID fraksiyonu bazen bulanıklaşır.

Bunu önlemek için çözeltiyi karıştırın ve ek liz buffer ekleyin; tüm fraksiyonlar şu anda havuzlanmakta ve ardından bir liz tüpüne aktarılmaktadır. Liz işlemi ole'yi uzaklaştıracaktır, ilk diyalizer adımı yüksek tuz konsantrasyonu içeren buffer karşısında gerçekleştirilir. Bir saat sonra, yüksek tuzlu buffer değiştirilir ve diyaliz prosedürü gece boyunca uygulanır.

Ertesi gün, diyaliz tüpü yüksek tuzlu tampondan çıkarılır ve gliserol tamponuna aktarılır. Üç ila beş saat sonra, gliserol tamponu değiştirilir ve diyaliz işlemi gece boyunca tekrar gerçekleştirilir. Gliserol tamponu ile yapılan lizis, en az üç kat konsantre bir stok çözelti ile sonuçlanacaktır.

Stok çözelti, aktivite kaybı olmadan birkaç yıl boyunca -20 °C'de saklanabilir. Kalite güvencesi için, topladığınız SDS-PAGE örneklerini bir jele yükleyebilir ve ardından boyayabilirsiniz. Coomassie ile, Cre füzyon proteini OID fraksiyonunda belirgin bir bant olarak saptanabilir. Uygun Cre rekombinaz konsantrasyonunu kullanabilmek için, konsantrasyonu Bradford deneyi ile belirlemelisiniz.

Kalıcı proteinlerin memeli hücrelerine nasıl uygulanacağı hakkında. Öncelikle, en yüksek protein transduksiyon verimliliğini elde etmek için hedef hücrelerinizi hazırlayın. Hedef hücreleriniz kompakt koloniler halinde büyüyen hücreler ise, ertesi gün %80 ila %90 konfluens hücre tabakasıyla sonuçlanacak yoğunlukta monolayer hücreler hazırlayın.

Hücreleri somatik olarak ayırın ve beş saat önceden tek hücre süspansiyonu haline getirin. Protein transdüksiyonu öncesinde tek hücre süspansiyonu hazırlamak önemlidir; aksi takdirde sadece koloninin yüzeyindeki hava hücreleri transfuse edilebilir. Besiyerini aspire edin ve tedaviye başlamadan önce hava hücrelerini kısa bir süre PPS ile gözlemleyin.

Kalan serum içeren toplam medyumu uzaklaştırın. PPS üst tabakasını aspire ettikten sonra hücrelerin üzerine damlatma yapın ve üç ila beş dakika inkübe olmalarına izin verin. Şimdi, tüm kolonilerin tekil hücrelere ayrılıp ayrılmadığını mikroskop altında kontrol edin.

Az önce belirtilen nedenlerle, bu adım proteinlerin yes hücrelerine transduksiyonu için kritik bir adımdır. Ayrılmış hücreleri bir tüpe aktarın. Tüpü bir standa yerleştirin, santrifüjleyerek hücreleri çöktürün, süpernatantı aspire edin ve hücreleri yeniden süspande edin.

Büyüme ortamındaki hücreleri uygun hücre sayısına gelecek şekilde seyreltin. Bu durum elbette doku kültürü kabının boyutuna bağlıdır. Hücreleri beş saat daha inkübe edin.

Bu, hava hücrelerinin dibe tutunması ve aderen olarak büyümesi için yeterli süreyi sağlayacaktır. Üç sınıf satır stokları, -20 °C'de iki yılı aşkın süreyle saklanabilir. Rekombinant hücre kalıcı füzyon proteini ile çalışırken, ihtiyaç duyulduğunda kullanılabilecek böyle bir stok çözeltisine sahip olmak oldukça faydalıdır.

Hücrelerin kaba tutunması beklenirken, uygun hacimdeki hücre kalıcı creep protein kolesterol stok çözeltisinin kendi ortamınıza seyreltilmesiyle C transdüksiyon medyası hazırlanabilir. Clare stok çözeltisi henüz steril olmadığı için, transdüksiyon medyası uygulama öncesinde steril filtrelemeden geçirilmelidir. Protein bağlayıcı bir filtreye vidalanabilen bir şırınga kullanmanız önerilir.

Final creek konsantrasyonu, hücre tipine veya besiyeri takviyelerine bağlıdır. Örneğin, serumun transduksiyon verimliliği üzerinde güçlü bir negatif etkisi vardır. Bu durum, serumsuz besiyerleri kullanılarak veya creek konsantrasyonu artırılarak aşılabilir.

En yüksek rekombinasyon verimliliğini sağlayan optimal koşulu belirliyoruz. Konsantrasyonu 0.5 ile 10 µM arasında kademeli olarak artırın. Altı ile 18 saat arasındaki farklı inkübasyon sürelerinin test edilmesini öneriyoruz.

Beş saatlik inkübasyonun ardından, hedef hücrelerinizi dışarı çıkarın ve çapraz medyumu aspire edin. Ardından, bunu protein transdüksiyon medyumu ile değiştirin ve hücreleri gece boyunca inkübe edilmek üzere inkübatöre geri yerleştirin. Kısaca, D hücrelerini PBS ile yıkayın ve protein transdüksiyon medyumunu normal ES medyumu ile değiştirin.

Hücre inkübasyonundan 48 saat sonra, kalıcı Cre vent gen ekspresyonu XUL aracılığıyla tespit edilebilir. Pozitif beta fenotipi ile boyanan hücreler, bölgeye özgü rekombinasyon yoluyla başarıyla genetik olarak modifiye edilmiştir. Cre raporu.

Hücreler, ön medikal rekombinasyon üzerine Lae konstrüktü kullanan CRE taşır. Bir lock P flank stop dizisi kesilir ve team promoter tarafından yönlendirilen bir luxe reporter geni aktive edilir. Ön işlem görmüş reporter air hücrelerinde rekombinasyon verimliliğini değerlendirmek için hücrelerin fikse edilmesi gerekir.

Hücrelerin ortamını aspire edin ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın, ardından hücrelerin üzerini %4 PFA ile kaplayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra hücreleri üç kez daha PBS ile yıkayın. Son yıkama adımından sonra PBS'yi aspire ettikten sonra kuyucuklara Xal boyama solüsyonu ekleyin ve hücreleri bir inkübatörde 37 derecede gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, Beal aktivitesi mavi renkli hücreler aracılığıyla izlenebilir. Rekombinasyon verimliliği, mavi koloni sayısı ile belirlenebilir. Optimal koşullar altında, %90'ın üzerinde bir rekombinasyon verimliliği elde edebilmelisiniz. Pekala, bugün size E. coli'den bölgeye özgü sorgu rekombinasyonunun nasıl eksprese edileceğini ve saflaştırılacağını gösterdik.

Bu prensip kanıtlama çalışmasında, tuzların çoğunda rekombinasyon indükleyebildik. Tamam, bu kadar. Deneylerinizde başarılar dilerim.