Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Hücresel fonksiyonun manipülasyonu, son 15 yıl içinde klasik DNA transfeksiyonu veya viral transdüksiyon yaklaşımları ile sağlanabilir. Başka bir yöntem gelişti. Protein transdüksiyonu biyolojik aktif proteini, hücresel alımı teşvik eden, ilgilenilen proteine kaynaşmış küçük peptitler kullanılarak doğrudan memeli hücrelerine verilebilir.

DNA kullanılmadığı için efor agenezisi riski önlenir. Yukarıda belirtilen klasik yöntemlerin aksine. Protein iletimi, proteinlerin titre edilebilir bir şekilde verilmesini sağlar.

Ayrıca, küçük hücre popülasyonlarının yanı sıra post mitotik nöronlar gibi bölünmeyen hücreler de modüle edilebilir. Rekombinant proteini verimli bir şekilde ifade etmek için Paciz vektör sisteminin kullanılmasını öneririz. Bir uç terminal ve bir C terminal varyantından oluşan modüler bir vektör sistemidir.

Her iki vektör de saflaştırma araçları için ilgilendiğiniz genin kolayca yerleştirilmesine izin verir. Bir histidin etiketi, bir protein iletim alanının yanı sıra entegre edilmiştir. Bizim durumumuzda, hücresel dağılım için hücresel alımı teşvik eden HI virüsüne dokunun.

Bir nükleer lokalizasyon sinyali, kontrol nedenleriyle vektörü tamamlar: füzyon etiketleri basitçe çıkarılabilir. Ayrıca, bu etiketlerin düzenlenmesi, füzyon proteinlerinin özellikleri üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Verim ve saflığın yanı sıra satılabilirlik ve biyolojik işlev üzerindeki etkisi tahmin edilemez.

Merhaba, benim adım Bernard Mus ve Almanya'nın Bond kentindeki Rekonstrüktif Nörobiyoloji Enstitüsü'nde kök hücre mühendisliği grubunda çalışıyorum. Merhaba, benim adım Christoph P ve aynı zamanda Hoover Lab'ın bir üyesiyim. Çalışma grubumuz, biyolojik aktif proteini çeşitli memeli hücrelerine doğrudan iletmek için protein transdüksiyon tekniğini yoğun bir şekilde kullanmaktadır ve bugün, e coli'nin içinde ve e'den ekspresyon ve saflaştırma sürecinde size rehberlik etmek istiyoruz.

Daha sonra, tüm prosedür ifadesini, saflaştırılmasını ve uygulanmasını örneklemek için hücre kültüründe hücre kalıcı füzyon proteininin nasıl uygulanacağını size göstermek istiyoruz. Fare onik kök hücrelerini genetik olarak değiştirmek için bölgeye özgü rekombinasyon Cree'yi kullanıyoruz. Tamam. Başlayalım.

Gece boyunca kültürü aşılamak için, eksi 80 santigrat derecede bir gliserol stoğunda depolanan önceden dönüştürülmüş bakterileri kullanıyoruz. Bu bakteriler zaten decre rekombinasyonu için vektör kodlaması içerir. Bir kaval ucu kullanarak, piper ucuna az miktarda bakteri çiziyoruz ve gece boyunca kültürü içeren behere bırakıyoruz.

Gece boyunca kültür, oh% 0.5'lik bir nihai konsantrasyonda glikoz ve ml başına 50 mikrogram karbonik insülin ile takviye edilmiş LB ortamından oluşur. Beher daha sonra, bölgeye özgü Rekombinate Cree'nin ekspresyonu için 37 santigrat derecede çalışan bir inkübatöre konur. Büyük ölçekli ifade kültürümüz için savaş öncesi tüberküloz medyasını kullanıyoruz.

Ekspresyonunu hızlandırmak için, rekombinant proteinin ekspresyonu sırasındaki sıcaklığı temsil eden 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış TB ortamının kullanılmasını öneririz. Daha sonra, TB ortamına oh% 0.5'lik bir nihai konsantrasyonda glikoz ekliyoruz Glikoz, indüksiyondan önce ekspresyon kültürünün büyümesi sırasında füzyon proteininin artan bazal ekspresyonunu önler. Son olarak, ampisilin, yalnızca kararname proteinini kodlayan plazmidi hala barındıran bakterileri içeren saf bir kültür sağlamak için ml başına 100 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda ekspresyon kültürüne eklenir.

Artık bir gecede kültürümüzü elde edebilir ve ifade kültürünü bire 50 oranında aşılayabiliriz. Beherler daha sonra 37 santigrat sıcaklıkta çalışan bir inkübatöre aktarılır. İfade boyunca optik yoğunluğu düzenli olarak ölçmek için örnekler almalısınız.

Kültür 1.5'lik bir optik yoğunluğa ulaşır ulaşmaz, bakteriler oh 0.5 milimolar IPTG'lik bir nihai konsantrasyon ile indüklenir. Bir saatlik indüksiyondan sonra, ekspresyon kültürü tüplere aktarılır ve daha sonra santrifüjleme yoluyla hasat edilir. Bunun için bir SLA 3000 rotor kullanıyoruz.

Santrifüj, dört derece antegradde 10 dakika boyunca dakikada 5.000 tur hızında çalışıyor. Snat daha sonra atılır ve bakteri peleti eksi 20 santigrat derecede süresiz olarak saklanabilir. Donmuş peletler, bir litre ekspresyon kültürüne karşılık gelen bir temyiz olan lizza tamponunda yeniden süspanse edilir.

10 ml lizza tamponu kullanıyoruz, çözelti homojen hale gelene kadar yaklaşık 15 dakika bekliyoruz. Daha sonra her ML süspansiyon başına bir miligram lizozim eklenir. Çözelti, enzimin bakterileri kırmasına izin vermek için 20 dakika boyunca karıştırılır.

Daha sonra, Benson Nase, 15 dakika daha boyunca bir ila 1000 arasında bir seyreltme ile eklenir, bu da DNA'yı keserek viskoz olmayan bir çözelti elde eder. Son olarak, hücrelerin parçalanmasını sağlamak için bir sonatör kullanılır. Program, sertifikasyonun tamamlanmasından sonra %45 gücünde bir buçuk dakika boyunca çalışmaktadır.

Buradaki her adımın bir örneğini almayı unutmayın, saflaştırmanın ham lizat veya SDS sayfası analizi. Kararname proteini gliserol stoğu içinde çökelme eğiliminde olacağından, her ML süspansiyon başına bir ml buz gibi soğuk TSB tamponu eklemek artık gerçekten önemlidir. Bu adımı atlayacaksanız, çözelti kısa süre içinde karıştırılır ve kabaca artık santrifüjleme için hazırdır.

Bu amaçla bir SS 34 rotor kullanıyoruz. Santrifüj, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 17.000 RPM'de çalışıyor. Bittiğinde, santrifüj Inc, S süpernatantını dikkatlice taze 50 ml'lik Falcon tüplerine aktardı.

Şimdi süpernatan nikele nikel anti A bulamacı ekleyin. Anti A, histidin teknolojisi füzyon proteinlerinin uygun şekilde saflaştırılması için çok önemli bir reaktiftir. Histidin, afinite saflaştırmasını sağlayan nikel iyonları ile bir kompleks oluşturur, şimdi park tüplerini 40 derece santigrat derecede 60 dakika boyunca hafifçe sallar.

Bir saat sonra, artık süspansiyonu 20 ML sütuna uygulayabilir ve çözeltinin yerçekimi akışıyla geçmesine izin verebilirsiniz. Büyük ölçekli üretimler için, süspansiyonu birkaç sütuna bölmek mümkündür. Daha sonra sütunu 15 milimolar iç taban içeren bir tamponla iki kez yıkarız.

Uygulanan tampon miktarı reçine hacmine bağlıdır. İki MLS nikel NTA, yıkama araçları için bir ml reçineye karşılık gelir. Yıkadıktan sonra kolona beş reçine hacmi yıkama tamponu koyduk, artık proteinimizden kaçmaya hazırız.

Bu nedenle, 250 milimolar immüno konsantrasyonuna sahip bir elüsyon tamponu kullanıyoruz. Bu yüzden reçinenin renginin yeşile doğru nasıl değiştiğine dikkat edin. CRE proteininin yüksek konsantrasyonları nedeniyle, OID fraksiyonu bazen bozulur.

Bunu önlemek için, çözeltiyi karıştırın ve ek lys tamponu ekleyin, tüm fraksiyonlar şimdi toplanır ve daha sonra bir lizis tüpüne aktarılır. Lizis oleyi çıkaracak ilk diyalizör adımı, yüksek konsantrasyonda tuz içeren tampona karşı gerçekleştirilir. Bir saat sonra yüksek tuz tamponu değiştirilir ve gece boyunca diyaliz işlemi uygulanır.

Ertesi gün, diyaliz tüpü yüksek tuz tamponundan çıkarılır ve bir gliserol tamponuna aktarılır. Üç ila beş saat sonra, gliserol tamponu değiştirilir ve diyaliz gece boyunca tekrar yapılır. Gliserol tamponuna karşı lizis, en az üç kat konsantre stok çözeltisi ile sonuçlanacaktır.

Stok çözeltisi artık eksi 20 santigrat derecede birkaç yıl boyunca aktivite kaybı olmadan saklanabilir Kalite güvencesi için, toplanan SDS sayfası örneklerinizi bir jele yükleyebilir ve daha sonra boyayabilirsiniz. Kamasi için, Cree füzyon proteini, OID fraksiyonunda belirgin bir bant olarak tespit edilebilir. Uygun mürettebat rekombinasyonu konsantrasyonunu kullanmak için, konsantrasyonu Redford testi ile belirlemelisiniz.

Bu kadar kalıcı proteinler memeli hücrelerine nasıl uygulanır? Her şeyden önce, en yüksek protein iletim verimliliğini elde etmek için hedef hücrelerinizi hazırlayın. Hedef hücrelerinizin kompakt koloniler halinde yetiştirilen evet hücreleri olması durumunda, ertesi gün %80 ila %90 birleşen hücre tabakasıyla sonuçlanan yoğunluktaki tek katmanlı hücreleri görün.

Hücreleri somatik olarak ayırın ve beş saat önceden tek bir hücre süspansiyonunda görün. Protein transdüksiyonundan önce tek bir hücre süspansiyonu yapmak önemlidir, çünkü aksi takdirde sadece bir koloninin yüzeyindeki hava hücreleri transfüzyon yapılabilir. Tedaviyi denemeden önce medyayı aspire edin ve hava hücrelerini PPS ile kısa bir süre izleyin.

Kalan Evet, serum içeren brüt ortamı çıkarın. PPS'yi aspire ettikten sonra, hücreleri damlatarak kaplayın ve üç ila beş dakika inkübe etmelerine izin verin. Şimdi gelen tüm koloninin tek hücrelere çözülüp çözülmediğini mikroskopla kontrol edin.

Az önce bahsedilen nedenler, bu, evet hücrelerine protein geçişi için çok önemli bir adımdır. Ayrılan hücreleri bir tüpe aktarın. Tüpü bir masaya yerleştirin, santrifüjleyin ve hücreleri aşağı doğru döndürün, Süper ajanı aspire edin ve hücreyi yeniden süspanse edin.

Büyüme ortamındaki P, hücreleri uygun hücre sayısına seyreltir. Bu elbette doku kültürünün boyutuna bağlıdır. Çanak hava hücrelerini beş saat daha inkübe edin.

Bu, hava hücrelerine tabana yapışması ve yapışması için yeterli zaman verecektir. Üç sınıf sıra stoğu eksi 20 derecede iki yıldan fazla saklanabilir. Rekombinant hücre kalıcı füzyon proteini ile çalışırken, talep üzerine kullanılabilecek böyle bir stok çözeltisine sahip olmak çok faydalıdır.

Hücrelerin tabağa yapışmasını beklerken, C transdüksiyon ortamını hazırlayabilirsiniz, sadece kolesterol stoğundan uygun bir hacimde hücre kalıcı sürünme proteinini kendinize seyreltebilirsiniz. Medya. Clare stok çözeltisi henüz steril olmadığından, trans besiyerinin uygulanmadan önce steril olarak filtrelenmesi gerekir. Bir lob protein bağlayıcı filtreye vidalanabilen bir şırınga kullanmanızı öneririz.

Nihai dere konsantrasyonu, hücre tipine veya ortam takviyelerine bağlıdır. Örneğin, serumun transdüksiyon verimliliği üzerinde güçlü bir olumsuz etkisi vardır. Bu, serum içermeyen ortam kullanılarak veya artan bir dere konsantrasyonu ile üstesinden gelinebilir.

En yüksek rekombinasyon verimliliğini sağlayan en uygun koşulu buluyoruz. Hidrat kararnamesi konsantrasyonu oh 0.5'ten 10 mikromolar'a kadar. Altı ila 18 saat arasında farklı inkübasyon sürelerini test etmenizi öneririz.

Beş saatlik inkübasyondan sonra, hedef hücrelerinizi çıkarın ve çapraz besiyerini aspire edin. Daha sonra, onu protein transdüksiyon ortamı ile değiştiririz, gece boyunca inkübasyondan sonra hava hücrelerini inkübatöre geri koyarız. D hücreleri PPS ile kısa bir süre yıkandı ve protein transdüksiyon ortamını normal ES ortamına değiştirdi.

Hücrenin inkübasyonundan 48 saat sonra kalıcı Cree vent gen ekspresyonu xul yoluyla tespit edilebilir. Pozitif bega fenotipine sahip boyama hücreleri, bölgeye özgü rekombinasyon ile başarılı bir şekilde genetik olarak tasarlanmıştır. Raporu cree.

Hücreler, pre-mediad rekombinasyon üzerine Lae yapısını kullanarak CRE barındırır. Bir kilit P kanat durdurma dizisi eksize edilir ve takım promotörü tarafından yönlendirilen lüks bir raportör geni aktive edilir. Ön işleme tabi tutulmuş raportör hava hücrelerinde rekombinasyon verimliliğini değerlendirmek için hücrelerin sabitlenmesi gerekir.

Aspirat ortamı, hücreleri %4 PFA'lı PBS kaplama hücreleri ile iki kez yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri PBS ile bir kez daha üç kez yıkayın. PBS'yi Xal Stain solüsyonundaki son yıkama adımından kuyucuklara aspire ettikten sonra, hücreleri bir inkübatörde gece boyunca 37 derecede inkübe edin.

Ertesi gün, Beal aktivitesi mavi yakalı hücreler tarafından izlenebilir. Rekombinasyon verimliliği, mavi kolonilerin sayısı ile belirlenebilir. Optimum koşullar altında, %90'dan daha yüksek bir rekombinasyon verimliliği elde edebilmelisinizPekala, bugün size siteye özgü sorgu rekombinasyonunu nasıl ifade edeceğinizi ve saflaştıracağınızı gösterdik.

Bu prensip kanıtı çalışmasında, tuzun çoğunda rekombinasyonu indükleyebildik. Tamam, bu kadar. Deneylerinizde iyi şanslar.