Name: Mühendislik Hücre geçirgen Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 8 s
Description: Keşfedin protein geçirme yöntemiyle memeli hücrelere biyolojik olarak aktif proteinlerin doğrudan teslimatını. Bu teknik, kalıcı genetik modifikasyon riski olmadan hücre manipülasyonu sağlar ve bölünmeyen hücrelerde bile etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Oliver Brüstle ve Kök Hücre Mühendisliği Grubu, Bonn Üniversitesi, destek ve değerli tartışmalar için tüm üyelerine teşekkür ediyorum. Sabine Schenk, SDS-PAGE ve proje boyunca kalıcı destek hazırlanması için teşekkür ederiz. Nicole Russ ve Anna Magerhans mükemmel teknik destek sağladı. Ayrıca, biz Andreas Bär ve Sheila Mertens film üretimi için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Volkswagen Vakfı (Az I/77864) ve Alman Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF, 01 GN 0813) hibe tarafından desteklenmiştir.

Ifade vektör ve ifade İnşaat: PSESAME Cre ekspresyon vektörü standart klonlama yöntemleri kullanarak AvrII ve NheI kısıtlama siteleri aracılığıyla pSESAME bir Cre-kodlama parçası takarak inşa edilmiştir. pSESAME histidin etiketi, TAT-domain, NLS sırası ve Cre, kısaltılmış HTNCre oluşan bir füzyon proteini kodlar. HTNCre ifade için pSESAME Cre TUNER (de3) pLacI dönüştü ve bir gliserol stok hazırlamak için kullanılan. <ol><li> Bir gece aşırı kültür gliserol stok dönüştürdü bakteri ile kaplı bir pipetlemeyin ucunu kullanarak ekildi. % 0.5 glukoz ile desteklenmiş LB medya oluşan aşırı gece kültür [v / v] ve 50 mcg / mL nihai konsantrasyonda carbenicillin ve 37 büyümeye izin ° C de 16 saat boyunca. </li><li> Ertesi gün yoğun olarak yetiştirilen üzerinde gece kültürü 1 ila 40 arasında bir oranı ifade kültürünü aşılamak için kullanılan ve 37 ° C'de bir inkübatör konuldu İfade kültürü, son bir 100 mcg / mL konsantrasyonda% 0.5 'lik glukoz [v / v] ve ampisilin ile desteklenmiş TB medya oluşuyordu. </li><li> OD 595 1.5 ifade kültürü 1 saat için 0.5 mM IPTG ile indüklenen </li><li> Daha sonra bakteri SLA3000 rotor 10 dakika 5000 rpm'de santrifüj yoluyla toplanmıştır. </li><li> Bakteriler pelet eksi 20 ° C arıtma kadar saklandı. </li></ol> Hücre geçirgen protein saflaştırılması: <ol><li> Dondurulmuş bakteri pelet oda sıcaklığında 15 dakika başına 10 litre şişesi kültür mL lizis tamponu yeniden süspanse edildi. </li><li> Süspansiyon sonra oda sıcaklığında karıştırılması sırasında, ek 15 dakika boyunca 1 mg / ml lizozim inkübe edildi. </li><li> 25 U / ml Benzonase sonra eklenir ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karıştırma inkübe edildi. </li><li> Gücünün% 45 0,5 darbeleri ile 1.5 dakika süreyle buz sonification sonra, 1 ml soğuk tartarik tuz tamponu (TSB) başına ml süspansiyon dikkatle süre eklendi karıştırma ve buz üzerinde 5 dakika inkübe. SDS-PAGE lizat fraksiyonu (L) örnek alındı. </li><li> Temizlendi lizat ° C 'de 30 dakika 30.000 g. 4 santrifüj yoluyla elde edildi Çözünür (S) ve çözünmez fraksiyonları (I) SDS-PAGE örnekleri alındı. </li><li> Süpernatant taze 50 ml şahin tüpler içine transfer oldu ve 4 az 1 saat sonra hafifçe karıştırılır ° C,% 50 Ni-NTA bulamaç ilk ifade kültür litre başına 2 ml. </li><li> Süspansiyon gravite akışı EconoPac sütunu (fraksiyonu akış ile alınmıştır (FT) SDS-PAGE örnek) ile paketlenir ve 5 yatak yıkama tampon hacimleri ile iki kez yıkandı. Hem yıkama fraksiyonları (W1 ve W2) SDS-PAGE örnekleri alındı. </li><li> HTNCre içeren fraksiyonlar eluat fraksiyonu (E) SDS-PAGE analizi için elüsyon tampon ve örnek 3 yatak hacimleri ile yıkandı alınmıştır. </li><li> Imidazol yüksek tuz tamponu iki kez karşı elüsyon fraksiyonu diyaliz tarafından kaldırıldı. </li><li> Protein solüsyonu gliserol tampon karşı iki kez diyaliz daha fazla konsantre oldu. Tüm diyaliz adımları örnek tampon oranı en az 50 oldu. Bu prosedür, 200 ve 450 mcM arasında bir normal konsantrasyonda HTNCre içeren bir gliserol stok solüsyonu ile sonuçlandı, yani 1 litre ifade kültür ~ 12 mg protein neden olacaktır. Gliserol stoku (GS) SDS-PAGE analizi için örnek toplanmıştır. HTNCre stok solüsyonu eksi 20 saklanabilir ° C </li></ol><img border="0" src="/files/ftp_upload/1627/1627fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Cre recombinase saflaştırma işlemi sırasında toplanan örneklerin SDS-PAGE analizi. Cre ifade İndüksiyon lizat fraksiyonu egemen grup tarafından gösterilir. Çözünmeyen protein bir parçası olmakla birlikte, eluat ve gliserol stok kesirler görüldüğü gibi Cre proteini daha zenginleştirilmiş olabilir. L: Lizat: çözünmez, S: Süzüntü FT: Akış, W: Yıkama, E: Eluat, GS: Gylcerol Stok. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1627/1627fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . Fare embriyonik kök (ES) hücrelerin içine protein transdüksiyon: <ol><li> Bir koşullu β-galaktosidaz muhabiri 5 inşa taşıyan ES hücrelerinin yapışık hücrelere disosiasyon için TrypLE ™ Express kullanan tek bir hücre olarak seribaşı. 4 ila 6 saat sonra hücrelerin yeniden bağlı olan ve orta kaldırıldı. </li><li> Daha sonra ES hücrelerinin, 16 saat süreyle HTNCre içeren orta inkübe edildi. <ul><li> Gliserol stokunun HTNCre protein uygun bir miktar (10 mcM karşılık), ES, orta ve daha sonra steril filtre (0.22 mm) içine sulandırılmış oldu. </li></ul></li><li> Protein transdüksiyon orta normal büyüme ortamına geri çevrildikten sonra. </li><li> Iki gün hücreler PBS ile yıkanmış ve 10 dakika için% 4 Paraformaldehit (PFA) ile fikse edildi. </li><li> İki ekPBS ile fonksiyonel yıkama adımları X-Gal boyama yapıldı önce idam edildi. </li><li> Sabit hücreleri X-Gal boyama çözüm 6 bir tabaka ile kaplıdır ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Ertesi gün X-Gal boyama çözüm talip oldu ve hücreler PBS mikroskopi analizi için bir tabaka ile kaplıydı. Recombined hücreleri 80 -% 100 β-galaktosidaz aktivitesi tarafından değerlendirilecektir fare ES hücrelerinin içinde gözlenebilmektedir.

<ol><li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+revisited%3A+novel+insights+into+the+mechanism+underlying+intracellular+delivery+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins.</a> Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).</li>
<li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talking+about+a+revolution%3A+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).</li>
<li>Nolden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+in+human+embryonic+stem+cells+induced+by+cell-permeant+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase.</a> Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+site-directed+recombination+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).</li>
<li>Peitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+cell-permeant+Cre+and+germline+transmission+after+transduction+into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells.</a> Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).</li>
<li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transducible+versions+of+transcription+factors+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li>
<li>Landry, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx+genes+are+direct+targets+of+Scl%2FTal1+in+the+yolk+sac+and+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver.</a> Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).</li>
</ol>

Cre füzyon protein saflaştırma işlemi sırasında buz TBS tampon ek santrifüj önce atlamak için önemlidir. Aksi takdirde Cre recombinase gliserol tampon içinde çökelti eğilimindedir. Eluat fraksiyonu haline görünüyorsa çözüm yine ortadan kalkıncaya kadar, füzyon proteini ek elüsyon tampon yüksek konsantrasyonu nedeniyle bulanık eklenmelidir. 10 mcM Cre füzyon protein uygulama genellikle 80 ila% 100 arasında bir rekombinasyon verimlilik sonuçlanır. Fötal Buzağı Serumu (FCS) ES hücre ortamın önemli bir bileşeni olan, güçlü bir şekilde protein transdüksiyon inhibe eder. Cre recombinase Bu nedenle yüksek konsantrasyonda kullanılması gerekiyordu. Serum serbest koşullarda çalışırken daha az protein (0.5 - 2 mcM) benzer rekombinasyon verimliliği elde etmek için kullanılabilir. Eldeki pSESAME vektör sistemi ile bir Oct4 ve Sox2 7 ve Scl/Tal1 8 gibi transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere diğer proteinler protein iletimi tekniği uygulayabilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>TUNER (DE3) pLacI</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70625</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>T876.1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Bazı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X998.4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Maya Ekstraktı</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>2363.4</td><td></td></tr><tr><td>Tripton/Pepton</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>8952.4</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; </td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Karbensilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaz</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Tartarik asit, disodyum tuzu </td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%50 Ni-NTA süspansiyonu</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>EconoPac kolonları</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Steril filtre 0,22&amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB besiyeri</td><td></td><td></td><td>Maya ekstraktı, Tripton/Pepton, NaCl</td></tr><tr><td>TB besiyeri</td><td></td><td></td><td>Maya ekstraktı, Tripton/Pepton, Gliserol, K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Lizis Tamponu</td><td></td><td></td><td>50 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 mM tris, pH 7.8</td></tr><tr><td>Tartrat Tuz Tamponu (TSB)</td><td></td><td></td><td>2 M L-Tartarik asit, disodyum tuzu ve 20 mM İmidazol içeren PTB</td></tr><tr><td>Yıkama Tamponu</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 15 mM İmidazol</td></tr><tr><td>Elüsyon Tamponu</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 250 mM İmidazol</td></tr><tr><td>Yüksek Tuz Tamponu</td><td></td><td></td><td>600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>Gliserol Tamponu</td><td></td><td></td><td>%50 gliserol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>TrypLE&amp;#8482; Express</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Gal boyama çözeltisi:</td><td></td><td></td><td>4 mM K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;), 4 mM K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;),&lt;br/&gt;2mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; PBS içinde çözülmüş 0.4 mg/mL X-Gal</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3367</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr></tbody></table>

mühendislik hücre geçirgen protein

Engineering Cell-permeable Protein

Protein iletim tekniği, memeli hücrelerinin içine biyolojik aktif madde doğrudan teslim sağlar [1,2 inceleme için bakınız] . Bu yüzden adı verilen hücre delici peptidler (ABM&#39;lerini) translocating yeteneği kullanmak için, aynı zamanda protein transdüksiyon domain (PTDs) olarak belirlenmiş. Insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) Tat (trans-transkripsiyon aktivatörü) protein yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır türetilen TAT-CPP. Olumlu ücret TAT, böylece hücre zarının endositoz ve / veya doğrudan membran penetrasyonu 2 engellerinin aşılması hücre geçirgenliğini artırır . Bir nükleer lokalizasyon sinyal ile birlikte (NLS) füzyon proteinleri çekirdeği sergileyen işlevselliği girebilecekler. Bizim video sunumu hücre geçirgen proteinlerin mühendislik, inşaat, üretim ve geçirgen bir hücre DNA modifiye enzim Cre sürümü uygulaması için bir örneklendirme olarak gösteriyor. Cre memeli hücrelerinde in vitro ve in vivo olarak 34 baz çifti loxP siteleri tanımak ve rekombinasyona bir siteye özgü recombinase . Bu nedenle Cre / loxP sistemi yaygın koşullu canlı hücreler 3,4 genom mutasyonları ikna etmek için kullanılır. Ancak, hücreleri aktif Cre recombinase teslim bir sınırlama temsil eder. Biz, gen-faiz doğrudan bir ekleme verir ve hızla uygun ve standart bir şekilde vektör içinde kullanılan farklı etki alanları ve etiketler clone bir platform sağlar pSESAME vektör sistemi açıklanmaktadır. Farklı etiketler yeniden düzenlenmesi, daha yüksek verim ve daha iyi çözünürlük elde etmek için bir olasılık sağlayan füzyon proteinlerin biyokimyasal özellikleri değiştirmek için gösterilmiştir. Ve E. coli hücre permeant rekombinant proteinleri ifade ve arındırmak için nasıl gösterilmektedir. Rekombinant Cre protein işlevselliğini nihayet hücre kültürü, hücre içi recombinase faaliyet değerlendirerek doğrulanır.

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Protein transduksiyon tekniği, biyolojik olarak aktif materyalin memeli hücrelerine doğrudan iletilmesini sağlar [inceleme için bkz. 1,2]. Bunun için ...

Hücresel fonksiyonların manipülasyonu, son 15 yıl içerisinde klasik DNA transfeksiyonu veya viral transdüksiyon yaklaşımlarıyla gerçekleştirilebilmekteydi. Bu süreçte başka bir yöntem gelişmiştir. Protein transdüksiyonu ile biyolojik olarak aktif proteinler, hücresel alımı artıran ve ilgilenilen proteine füzyonlanmış küçük peptitler kullanılarak doğrudan memeli hücrelerine iletilebilmektedir.Herhangi bir DNA kullanılmadığı için, ekzojen ajanogenez riski önlenmiş olur. Yukarıda belirtilen klasik yöntemlerin aksine, protein transdüksiyonu proteinlerin titrasyon yapılabilir bir şekilde iletilmesini sağlar.Ayrıca, post-mitotik nöronlar gibi bölünmeyen hücrelerin yanı sıra küçük hücre popülasyonları da modüle edilebilir. Rekombinant proteini verimli bir şekilde eksprese etmek için Paciz vektör sisteminin kullanımını öneriyoruz. Bu sistem, bir N-terminal ve bir C-terminal varyantından oluşan modüler bir vektör sistemidir.Her iki vektör de saflaştırma amacıyla ilgi duyulan geninizin kolayca yerleştirilmesine olanak tanır. Bir histidin etiketi ile bir protein transdüksiyon alanı entegre edilmiştir. Bizim durumumuzda, hücresel dağılım için hücresel alımı teşvik eden HIV virüsünden türetilmiş bir alan kullanılmıştır.Kontrol amaçlarıyla vektör, bir nükleer lokalizasyon sinyali ile tamamlanır; füzyon etiketleri basitçe kaldırılabilir. Bunun yanı sıra, bu etiketlerin düzenlemesi, füzyon proteinlerinin özellikleri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Verim ve saflığın yanı sıra satılabilirlik ve biyolojik fonksiyon üzerindeki etki öngörülemez.Merhaba, benim adım Bernard Mus ve Almanya'daki Bond Rekonstrüktif Nörobiyoloji Enstitüsü'ndeki Kök Hücre Mühendisliği grubunda çalışıyorum. Merhaba, benim adım Christoph P ve ben de Hoover Laboratuvarı'nın bir üyesiyim. Çalışma grubumuz, biyolojik olarak aktif proteinleri çeşitli memeli hücrelerine doğrudan iletmek için protein transdüksiyon tekniğini yoğun bir şekilde kullanmaktadır ve bugün size e coli içerisinde ekspresyon ve saflaştırma sürecinde rehberlik etmek istiyoruz.Ardından, tüm ekspresyon, saflaştırma ve uygulama prosedürünü örneklendirmek için hücre kültüründe hücreye sabitlenmiş füzyon proteininin nasıl uygulanacağını göstermek istiyoruz. Fare onik kök hücrelerini genetik olarak modifiye etmek için bölgeye özgü rekombinasyon Cree'den yararlanıyoruz.Tamam.Tamam. Hadi başlayalım.Gece boyu kültürü inoküle etmek için, -80 °C'de gliserol stokunda saklanan, önceden transforme edilmiş bakterileri kullanıyoruz. Bu bakteriler halihazırda decre rekombinasyonunu kodlayan vektörü içermektedir. Bir pipet ucu kullanarak, bakterilerden küçük bir miktarı pipet ucuna sıyırıyoruz ve bunu gece boyu kültürünü içeren behere damlatıyoruz.Gece boyu kültür, son konsantrasyonu 0.5% glukoz ve ml başına 50 µg karbonik insülin ile desteklenmiş LB besiyerinden oluşur. Beher, ardından bölgeye özgü Rekombinant Cre'nin ekspresyonu için 37 °C'de çalışan bir inkübatöre yerleştirilir. Büyük ölçekli ekspresyon kültürümüz için önceden ısıtılmış TB besiyeri kullanıyoruz.Ekspresyonu hızlandırmak için, rekombinant proteinin ekspresyonu sırasındaki sıcaklığı temsil eden 37 °C'ye ısıtılmış TB besiyerinin kullanımını öneriyoruz. Ardından, TB besiyerine son konsantrasyonu 0,5% olacak şekilde glikoz ekleriz. Glikoz, indüksiyon öncesi ekspresyon kültürünün büyümesi sırasında füzyon proteininin bazal ekspresyonunun artmasını önler. Son olarak, yalnızca protein kodlayan plazmidi taşıyan bakterilerin bulunduğu saf bir kültür sağlamak amacıyla, ekspresyon kültürüne son konsantrasyonu 100 µg/mL olacak şekilde ampisilin eklenir.Şimdi gece boyu kültüre edilen örneğimizi alabilir ve ekspresyon kültürünü 1:50 oranında inoküle edebiliriz. Beherler daha sonra 37 °C sıcaklıkta çalışan bir inkübatöre aktarılır. Ekspresyon boyunca optik yoğunluğu ölçmek için düzenli aralıklarla örnekler almalısınız.Kültür 1,5 optik yoğunluğa ulaştığında, bakteriler 0,5 millimolar nihai konsantrasyondaki IPTG ile indüklenir. Bir saatlik indüksiyonun ardından, ekspresyon kültürü tüplere aktarılır ve ardından santrifüj yoluyla hasat edilir. Bu amaç için SLA 3000 rotor kullanmaktayız.Santrifüj, 4 °C'de 10 dakika boyunca dakikada 5,000 devir hızda çalıştırılır. Ardından süpernatan uzaklaştırılır ve bakteri peleti -20 °C'de süresiz olarak saklanabilir. Dondurulmuş peletler, bir litre ekspresyon kültürüne karşılık gelen miktarda Lizza tamponu içinde yeniden süspanse edilir.10 mL lizza tamponu kullanıyoruz ve çözelti homojen hale gelene kadar yaklaşık 15 dakika bekliyoruz. Ardından, süspansiyonun her mL'si için bir miligram lizozim eklenir. Enzimin bakterileri parçalamasına izin vermek için çözelti 20 dakika boyunca karıştırılır.Ardından, DNA'yı keserek daha az viskoz bir çözelti elde etmek amacıyla 1/1000 seyreltme oranında Benzon nükleaz 15 dakika boyunca eklenir. Son olarak, hücrelerin lizisini sağlamak için bir sonikatör kullanılır. Sertifikasyon tamamlandıktan sonra program, %45 güçle bir buçuk dakika boyunca çalıştırılır.Buradaki her adımdan, kaba lizattan veya saflaştırmanın SDS page analizinden bir örnek almayı unutmayın. Gliserol stok içinde proteinler çökmeye eğilimli olacağı için, süspansiyonun her mL'si başına 1 mL buz gibi soğuk TSB tamponu eklemek şu an gerçekten önemlidir. Bu adımı atlayacaksanız, çözelti kısa süre karıştırılır ve kaba lizat artık santrifüj için hazırdır.Bu amaçla, SS 34 rotoru kullanıyoruz. Santrifüj, 4 °C'de 30 dakika boyunca 17.000 RPM'de çalıştırılır. İşlem tamamlandığında, süpernatan dikkatlice taze 50 ml Falcon tüplerine aktarılır.Şimdi süpernatanta nikel anti A süspansiyonu ekleyin. Anti A, histidin etiketli füzyon proteinlerinin uygun şekilde saflaştırılması için kritik bir reaktiftir. Histidin, nikel iyonları ile bir kompleks oluşturarak afinite saflaştırmasını sağlar; şimdi parkチューブları (santrifüj tüplerini) 40 °C'de 60 dakika boyunca nazikçe çalkalayın.Bir saat sonra, süspansiyonu 20 ML kolonlara uygulayabilir ve solüsyonun yer çekimi akışıyla geçmesine izin verebilirsiniz. Büyük ölçekli üretimler için, süspansiyonu birkaç kolona bölmek mümkündür. Daha sonra kolonu, 15 millimolar innersole içeren bir tampon ile iki kez yıkarız.Uygulanan tampon miktarı, reçine hacmine bağlıdır. Yıkama işlemleri için iki mL nikel NTA, bir ml reçineye karşılık gelir. Yıkama işleminden sonra kolona beş reçine hacmi kadar yıkama tamponu ekleriz; artık proteinimizi elüe etmeye hazırız.Bu nedenle, 250 millimolar konsantrasyonda imüno içeren bir elüsyon tamponu kullanıyoruz. Reçinenin renginin yeşile doğru nasıl değiştiğine dikkat edin. CRE proteininin yüksek konsantrasyonları nedeniyle, OID fraksiyonu bazen bulanıklaşır.Bunu önlemek için çözeltiyi karıştırın ve ek liz buffer ekleyin; tüm fraksiyonlar şu anda havuzlanmakta ve ardından bir liz tüpüne aktarılmaktadır. Liz işlemi ole'yi uzaklaştıracaktır, ilk diyalizer adımı yüksek tuz konsantrasyonu içeren buffer karşısında gerçekleştirilir. Bir saat sonra, yüksek tuzlu buffer değiştirilir ve diyaliz prosedürü gece boyunca uygulanır.Ertesi gün, diyaliz tüpü yüksek tuzlu tampondan çıkarılır ve gliserol tamponuna aktarılır. Üç ila beş saat sonra, gliserol tamponu değiştirilir ve diyaliz işlemi gece boyunca tekrar gerçekleştirilir. Gliserol tamponu ile yapılan lizis, en az üç kat konsantre bir stok çözelti ile sonuçlanacaktır.Stok çözelti, aktivite kaybı olmadan birkaç yıl boyunca -20 °C'de saklanabilir. Kalite güvencesi için, topladığınız SDS-PAGE örneklerini bir jele yükleyebilir ve ardından boyayabilirsiniz. Coomassie ile, Cre füzyon proteini OID fraksiyonunda belirgin bir bant olarak saptanabilir. Uygun Cre rekombinaz konsantrasyonunu kullanabilmek için, konsantrasyonu Bradford deneyi ile belirlemelisiniz.Kalıcı proteinlerin memeli hücrelerine nasıl uygulanacağı hakkında. Öncelikle, en yüksek protein transduksiyon verimliliğini elde etmek için hedef hücrelerinizi hazırlayın. Hedef hücreleriniz kompakt koloniler halinde büyüyen hücreler ise, ertesi gün %80 ila %90 konfluens hücre tabakasıyla sonuçlanacak yoğunlukta monolayer hücreler hazırlayın.Hücreleri somatik olarak ayırın ve beş saat önceden tek hücre süspansiyonu haline getirin. Protein transdüksiyonu öncesinde tek hücre süspansiyonu hazırlamak önemlidir; aksi takdirde sadece koloninin yüzeyindeki hava hücreleri transfuse edilebilir. Besiyerini aspire edin ve tedaviye başlamadan önce hava hücrelerini kısa bir süre PPS ile gözlemleyin.Kalan serum içeren toplam medyumu uzaklaştırın. PPS üst tabakasını aspire ettikten sonra hücrelerin üzerine damlatma yapın ve üç ila beş dakika inkübe olmalarına izin verin. Şimdi, tüm kolonilerin tekil hücrelere ayrılıp ayrılmadığını mikroskop altında kontrol edin.Az önce belirtilen nedenlerle, bu adım proteinlerin yes hücrelerine transduksiyonu için kritik bir adımdır. Ayrılmış hücreleri bir tüpe aktarın. Tüpü bir standa yerleştirin, santrifüjleyerek hücreleri çöktürün, süpernatantı aspire edin ve hücreleri yeniden süspande edin.Büyüme ortamındaki hücreleri uygun hücre sayısına gelecek şekilde seyreltin. Bu durum elbette doku kültürü kabının boyutuna bağlıdır. Hücreleri beş saat daha inkübe edin.Bu, hava hücrelerinin dibe tutunması ve aderen olarak büyümesi için yeterli süreyi sağlayacaktır. Üç sınıf satır stokları, -20 °C'de iki yılı aşkın süreyle saklanabilir. Rekombinant hücre kalıcı füzyon proteini ile çalışırken, ihtiyaç duyulduğunda kullanılabilecek böyle bir stok çözeltisine sahip olmak oldukça faydalıdır.Hücrelerin kaba tutunması beklenirken, uygun hacimdeki hücre kalıcı creep protein kolesterol stok çözeltisinin kendi ortamınıza seyreltilmesiyle C transdüksiyon medyası hazırlanabilir. Clare stok çözeltisi henüz steril olmadığı için, transdüksiyon medyası uygulama öncesinde steril filtrelemeden geçirilmelidir. Protein bağlayıcı bir filtreye vidalanabilen bir şırınga kullanmanız önerilir.Final creek konsantrasyonu, hücre tipine veya besiyeri takviyelerine bağlıdır. Örneğin, serumun transduksiyon verimliliği üzerinde güçlü bir negatif etkisi vardır. Bu durum, serumsuz besiyerleri kullanılarak veya creek konsantrasyonu artırılarak aşılabilir.En yüksek rekombinasyon verimliliğini sağlayan optimal koşulu belirliyoruz. Konsantrasyonu 0.5 ile 10 µM arasında kademeli olarak artırın. Altı ile 18 saat arasındaki farklı inkübasyon sürelerinin test edilmesini öneriyoruz.Beş saatlik inkübasyonun ardından, hedef hücrelerinizi dışarı çıkarın ve çapraz medyumu aspire edin. Ardından, bunu protein transdüksiyon medyumu ile değiştirin ve hücreleri gece boyunca inkübe edilmek üzere inkübatöre geri yerleştirin. Kısaca, D hücrelerini PBS ile yıkayın ve protein transdüksiyon medyumunu normal ES medyumu ile değiştirin.Hücre inkübasyonundan 48 saat sonra, kalıcı Cre vent gen ekspresyonu XUL aracılığıyla tespit edilebilir. Pozitif beta fenotipi ile boyanan hücreler, bölgeye özgü rekombinasyon yoluyla başarıyla genetik olarak modifiye edilmiştir. Cre raporu.Hücreler, ön medikal rekombinasyon üzerine Lae konstrüktü kullanan CRE taşır. Bir lock P flank stop dizisi kesilir ve team promoter tarafından yönlendirilen bir luxe reporter geni aktive edilir. Ön işlem görmüş reporter air hücrelerinde rekombinasyon verimliliğini değerlendirmek için hücrelerin fikse edilmesi gerekir.Hücrelerin ortamını aspire edin ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın, ardından hücrelerin üzerini %4 PFA ile kaplayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra hücreleri üç kez daha PBS ile yıkayın. Son yıkama adımından sonra PBS'yi aspire ettikten sonra kuyucuklara Xal boyama solüsyonu ekleyin ve hücreleri bir inkübatörde 37 derecede gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, Beal aktivitesi mavi renkli hücreler aracılığıyla izlenebilir. Rekombinasyon verimliliği, mavi koloni sayısı ile belirlenebilir. Optimal koşullar altında, %90'ın üzerinde bir rekombinasyon verimliliği elde edebilmelisiniz. Pekala, bugün size E. coli'den bölgeye özgü sorgu rekombinasyonunun nasıl eksprese edileceğini ve saflaştırılacağını gösterdik.Bu prensip kanıtlama çalışmasında, tuzların çoğunda rekombinasyon indükleyebildik. Tamam, bu kadar. Deneylerinizde başarılar dilerim.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, hücre zarı taklitleri (büyük unilamellar veziküller veya LUV'ler, bir floresan boya ve bir söndürücü ile kapsüllenmiş) kullanarak hücreye nüfuz eden peptitlerin hücre zarlarıyla etkileşimlerini incelemek için floresan sızıntı testi tartışılmaktadır.

Membran ile Hücreye Nüfuz Eden Peptit Etkileşimini İncelemek için Floresan Sızıntı Testi

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Organik Elektrokimyasal Transistor canlı hücreler ile entegre ve mide-bağırsak epitelyal bariyer boyunca iyon akışı izlemek için kullanılır. Bu çalışmada, kalsiyum kenetleme maddesi EGTA (etilen glikol-bis (beta-aminoetil eter)-N, N, N ', N'-tetra asetik asit varlığı ile indüklenen sıkı birleşme bozulması ile ilişkili iyon akışında bir artış, asit), ölçülür.

Organik Elektrokimyasal Transistör Bariyer Doku bozulması ve Algılama

Bu sunum, hücreler iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit ile kaplanmış bir slayt üzerinde büyürken, hücreler arası, kavşak iletişiminin incelenmesi için yapışık, kültürlenmiş hücrelerin elektroporasyonunun kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

Elektroporasyon, saflaştırılmış bakteriyel virülans efektör proteinlerini doğrudan canlı ökaryotik hücrelere yerleştirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu konfokal immünofloresan mikroskopi ile izlendi. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerde heterolog ekspresyon ihtiyacını ortadan kaldırarak, aktif eksojen proteinleri kullanarak kaçakçılık, fonksiyon ve protein-protein etkileşimleri üzerine çalışmalara izin verir.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Bu protokol, çip üzerinde laboratuvar, mikroakışkan elektroporasyon cihazı oluşturmak için gereken mikrofabrikasyon tekniklerini açıklar. Deney düzeneği, sürekli bir akışta kontrollü, tek hücre düzeyinde transfeksiyonlar gerçekleştirir ve popülasyon tabanlı kontrol ile daha yüksek verimlere genişletilebilir. Hücre zarı geçirgenliğinin derecesini gerçek zamanlı olarak elektriksel olarak izleme yeteneğini gösteren bir analiz sağlanmıştır.

Sürekli akışlı, permeabilizasyon algılamalı mikro-elektroporasyon sisteminin imalatı ve işletilmesi

Gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP), tutarlı, yüksek verimli iletimi yüksek hücre canlılığı ile eşleştirir. Transepitelyal elektrik empedans (TEEI) ölçümlerinin tanıtılması, PSEP'in ara süreçleri hakkında bilgi sağlar ve etiketsiz teslimata olanak tanır. Bu makalede, PSEP dağıtım deneylerini ve TEEI ölçüm analizini aynı anda gerçekleştirmek için bir yöntem tartışılmaktadır.

Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon

Keşfedin protein geçirme yöntemiyle memeli hücrelere biyolojik olarak aktif proteinlerin doğrudan teslimatını. Bu teknik, kalıcı genetik modifikasyon riski olmadan hücre manipülasyonu sağlar ve bölünmeyen hücrelerde bile etkilidir.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

Daha fazla video keşfet