Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi
13 Temmuz 2017
Nematodun, Caenorhabditis elegans'ın , nüfusa dayalı bir deneyde çözünür bileşikler için tercihinin otomatik analizini sağlayan bir davranış kayıt kurulumu ve protokolü sunuyoruz. Bu makale bir davranış odasının inşasını, davranışsal analiz protokolünü ve video analiz yazılımının kullanımını anlatıyor.
Bu davranış kayıt kurulumunun ve protokolünün genel amacı, çok kameralı bir video toplama sistemi kullanarak C Elegans'ın çözünür bileşikler için popülasyona dayalı kemosensör tercihini ölçmek ve ardından otomatik video analizi yapmaktır. Bu yöntem, genetik mutantların daha hızlı ve daha standart davranışsal analizini sağlayarak C Elegans'ın nörobiyoloji araştırmalarını kolaylaştırabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nematod popülasyonunun çözünür ipuçlarına tepkisinin zamansal dinamiklerini izlerken, aynı koşullar altında birden fazla kopyanın aynı anda test edilebilmesidir.
Davranış odası meclisini gösteren, bu laboratuvardan bir personel bilim adamı olan Christopher Cronin olacak. Başlamak için, kumaş kapakları, kamera montaj çubuklarını, köşe braketlerini, ekstrüzyon çubuklarını ve kamera montaj tertibatını ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Orta çubuğa takılı uç çubuklardan başlayarak, kamera standını ve kılıfları kamera montaj düzeneğine takın.
Ardından, davranış odası çerçevesini birleştirin. Dört, bir ayak ekstrüzyon alüminyum çubuğunu kare bir polyester levhaya takarak başlayın. Bir çubuğu, kumaş tabakasının omni olan iki T-somununun üzerine kaydırın ve çubuğu kumaş genişliği boyunca ortalayın.
Kumaş tabakasını her bir çubuğa sabitlemek için bağlantı elemanlarını sıkın. Kare polyester levhayı, ekli dört alüminyum çubuk üstte olacak şekilde çalışma yüzeyine yayın. Ardından, her bir çubuğun her iki ucunda birer tane olmak üzere dört alüminyum çubuğun üst yüzeylerine sekiz köşe braketi kaydırın.
Köşe braketlerini, braketin dikey ayakları çubukların ucuyla aynı hizada olacak şekilde çubukların üzerine yerleştirin ve vidaları T-somunlara sıkarak yerlerine sabitleyin. Her köşede, tek ayaklı bir alüminyum ekstrüzyonu dik tutun ve ekstrüzyonu iki köşe braketi ayağı üzerindeki T-somunların üzerinden kaydırın. Ardından, bağlantı elemanlarını sıkarak dik çubuğu yatay çubuklara sabitleyin, böylece iki bitişik yatay çubuğu birleştirin.
H şeklindeki kamera montaj aksamının gevşek T somunlarını çerçevenin dikmelerine doğru kaydırın. Çerçevenin her bir köşesindeki köşe parantezlerinin üzerine oturmak için H'nin tamamen aşağı kaymasına izin verin. Dört köşe braketi vidasını sıkarak kamera montaj aksamını yerine sabitleyin.
Ardından, odanın alt katmanını monte etmek için son dört tek ayaklı ekstrüzyon alüminyum çubuğunu kullanın. Köşe braketlerini, braketlerin ayakları çubuğun ucuyla aynı hizada olacak şekilde konumlandırın ve yerine sabitlemek için vidaları sıkın. Ardından, dik kanallardaki gevşek T-somunlarla çubukları çerçeve dikmeleri arasında aşağı kaydırın.
Çubuğu, köşe braketlerinin üst kenarları dikmelerin açık ucunun bir inç altında olacak şekilde konumlandırın ve köşe braketi vidalarını sıkarak yerine sabitleyin. Ardından, dört dikdörtgen polyester levhanın T-somunlarını, haznenin kenarlarını kaplamak için dik ekstrüzyon çubuklarının kanallarına kaydırın ve yerine sabitlemek için bağlantı elemanlarını sıkın. Haznenin iç kısmına erişmek için bir tarafı kapı olarak seçin ve haznenin alt katmanındaki iki vidayı ve T-somunları çıkarın.
Tamamlanan çerçeve için ayak görevi görmesi için her köşenin üst ucuna plastik bir kapak yerleştirin. Çerçeveyi sağ tarafı yukarı çevirin ve çerçeve alanı katmanının içine slayt başına iki panel tutucu yerleştirin ve yerlerine sabitlemek için döndürün. Ardından, tahlil plakaları için bir sahne sağlamak üzere panel tutucuların üzerine 12 x 12 inçlik bir şeffaf akrilik parçası yerleştirin.
Son olarak, kamerayı ve sahne şablonunu eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi konumlandırın. Deneyden bir gün önce, 28 adet boş 35 milimetrelik plakayı düz bir yüzeye beş veya daha az yığın halinde yerleştirin. Her tahlil plakasını beş mililitre nematod büyüme ortamı agar ile doldurun ve tahlil plakalarını gece boyunca oda sıcaklığında kapakları kapalı olarak dik olarak kurumaya bırakın.
Deney günü, arka ışığı açın, bilgisayarı başlatın ve mikroskop kamerasının video yakalama yazılımını başlatın. Mikroskop kamerasını bilgisayara bağlayın ve kameranın canlı yayınını görüntülemek için yazılım penceresinin üst kısmındaki numaralı kamera küçük resmine tıklayın. Video kayıt ayarlarını yapmak için kamera beslemesinin sol üst köşesindeki video formatı menüsünü aşağı çekin ve MJPG 1280x1024'ü seçin.
Ardından, video formatı menüsünün yanındaki klasör menüsünü aşağı çekin ve video dosyalarının kaydedileceği bir klasör seçin. Kamera beslemesinin sağ üst köşesindeki otomatik pozlama simgesine tıklayın ve otomatik pozlamayı kapatın. Ardından, yerleşik mikroskop kamera LED'lerini kapatmak için otomatik pozlama simgesinin hemen sağındaki LED simgesine tıklayın.
Bitişik ayarların simgesine tıklayın ve tek renkli'yi seçin. Kontrastı en üst düzeye çıkarın ve parlaklığı ayarlayın. Sahne alanı plakası hizalama şablonunun üstüne bir çözüm yerleştirme şablonunu hizalayın ve kamera beslemesinin sol tarafındaki timelapse video kayıt simgesine tıklayın.
Saniyede bir kare hızında beş saniyelik bir kalibrasyon videosu kaydetmek için süre için beş saniye ve aralık için bir saniye girin. Senkronize solucanlardan oluşan bir tabağa 1,2 mililitre nematod büyüme ortamı tamponu eklemek için beş mililitrelik bir cam pipet kullanın ve solucanları tamponun içine yerleştirmek için plakayı hafifçe çalkalayın. Tamponu plakadan pipetleyin ve tampondaki solucanları temiz bir mikro santrifüj tüpüne dağıtın.
Solucanların dibe çökmesine izin vermek için tüpleri bir ila iki dakika bekletin. Ardından, tüplerin dibindeki toplanmış solucan peletini bozmadan tüplerden mümkün olduğunca fazla yıkama tamponunu çıkarmak için plastik bir pipet ucu kullanın. Tüpü bir mililitre temiz nematod büyüme ortamı tamponu ile doldurun ve yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın.
Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu aşamasının üzerine bir çözelti yerleştirme şablonu bantlayın. Ardından, plaka hizalama şablonunun her iki tarafına bir çift taraflı bant şeridi yerleştirin. Tahlil plakasının çevresini plaka hizalama şablonundaki daire ile hizalayın ve şablon plakanın altına yapışana kadar aşağı bastırın.
Ardından, tahlil plakası şablonu üye işaretleyicilerini, diseksiyon mikroskobu üzerindeki çözelti yerleştirme şablonu üye işaretleyicileri ile hizalayın. Ardından, her biri bir ve dördüncü çeyreklere bir mikrolitre M2 tamponu yerleştirmek için bir P13 pipeti kullanın. Her biri ikinci ve üçüncü kadranlara bir mikrolitre 10 milimolar CuCl2 çözeltisi yerleştirmek için yeni bir uç kullanın.
Çözelti damlaları agar içine tamamen emildikten sonra yıkanmış solucanları tahlil plakalarına aktarmak için bir cam pastör pipeti kullanın. Dairesel muamele görmüş bölgelerin üstündeki ve altındaki alanlara bir damla solucan yerleştirin. Dokuyu dört kez katlayın ve tahlil plakalarındaki fazla yıkama tamponunu emmek için künt kenarı kullanın.
Şablon köşelerinin numaralarını hizalayarak mikroskop kameralarının altındaki tahlil plakalarını hemen davranış odasına yerleştirin. Solucanların tahlil plakalarına alışması için iki ila üç dakika bekleyin. Ardından, kamera beslemesinin sol tarafındaki timelapse video kayıt simgesine tıklayın ve saniyede bir kare olan 10 dakikalık bir video kaydetmek için süre için 10 dakika ve aralık için bir saniye girin.
Son olarak, video kaydını başlatmak için başlat'a tıklayın. Her video karesi için, tercih dizini işlevi ilgilenilen her bölgedeki solucan piksellerinin sayısını sayar ve ilgilenilen bölgedeki toplam piksel sayısından bir pikselin yüzdesini hesaplar. Farklı genotip ve tedavi eşleşmeleri için elde edilen tercih indeksi değerleri burada gösterilmiştir.
Pozitif bir tercih indeksi değeri, tedaviye yönelik bir çekiciliği gösterirken, negatif bir tercih indeksi değeri itmeyi gösterir. M13 tampon çözeltisi hem kontrol hem de deneysel ilgi alanlarına yerleştirildiğinde 0,02'lik bir tercih indeksi elde edilir ve bu da mekansal yanlılık olmadığını gösterir. Bu grafik aynı zamanda N2 solucanlarının bakır iyonlarından güçlü bir şekilde kaçındığını ve bunun da 0.67'lik bir tercih indeksi ile sonuçlandığını göstermektedir.
Ek olarak, duyusal cillia oluşumunda kusurlu olan osm-3 ve ASH aracılı nosiseptif yanıtlarda kusurlu olan ocr-2 mutantları, bakır iyonlarına karşı azalmış kaçınma ve hatta hafif çekim göstermiştir. Bu protokolü denerken, hızlı ama aynı zamanda sorunsuz ve tutarlı bir şekilde çalışmak önemlidir. Kayıt kurulumu ve tahlil protokolü, farklı C Elegans'ın duyusal çeşitleri arasındaki etkileşimlerden kaynaklanan popülasyona dayalı davranışsal tepkileri karakterize etmek için kolayca uyarlanabilir.
Genel Bakış
Bu makale, popülasyon tabanlı bir analizde nematod Caenorhabditis elegans'ı incelemek için bir davranış kayıt düzeneği ve protokolü sunmaktadır. Yazıda, bir davranış odasının kurulumu, davranışsal analiz protokolü ve otomatik analiz için video analiz yazılımının kullanımı detaylandırılmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal Analiz
- Genetik Mutantlar
Arka Plan
- C. elegans'taki kemosensör tercihlerini anlamak, nörobiyolojiye dair içgörüler sağlayabilir.
- Otomatik analiz, daha hızlı ve daha standartlaştırılmış davranışsal değerlendirmelere olanak tanır.
- Popülasyon tabanlı assayler, aynı koşullar altında birden fazla repliğin izlenmesini sağlar.
- Bu yöntem, çözünür uyaranlara yanıt olarak gelişen zamansal dinamiklerin incelenmesini geliştirir.
Çalışmanın Amacı
- C. elegans'ın çözünür bileşiklere karşı kemosensör tercihini nicel olarak belirlemek.
- Geliştirilmiş davranışsal analiz teknikleri aracılığıyla nörobiyoloji araştırmalarını kolaylaştırmak.
- Deneyler için bir davranış odasının kurulumunu ve kullanımını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Alüminyum ekstrüzyon çubukları ve polyester levhalar kullanılarak davranış odasının kurulumu.
- Nematod davranışlarını kaydetmek için çok kameralı video görüntüleme sistemi.
- Çözünür bileşiklere verilen yanıtları nicelleştirmek için otomatik video analizi.
- Deneyler için nematod büyüme ortamı içeren analiz plakalarının hazırlanması.
Temel Sonuçlar
- Sistem, birden fazla tekrarlı örneğin eş zamanlı olarak analiz edilmesine olanak tanır.
- Otomatik analiz, davranışsal tepkiler üzerine tutarlı ve güvenilir veriler sağlar.
- Yöntem, C. elegans'ın uyaranlara verdiği tepkilerin zamansal dinamiklerini yakalar.
- Davranış haznesinin kurulum ve işletim kolaylığı kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Bu protokol, C. elegans davranış çalışmalarının verimliliğini artırır.
- Otomatik video analizi, nörobiyoloji araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Davranış odası tasarımı, çeşitli deneysel kurulumlar için pratiktir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu yöntem, C. elegans'ta popülasyon düzeyindeki kemosensör yanıtların yüksek kapasiteli ve standartlaştırılmış nicel analizini sağlayarak erken aşama hedef doğrulamayı ve fenotipik taramayı destekler. Video alımını ve analizini otomatikleştirerek deneysel değişkenliği azaltır; genetik ve bileşik tarama kampanyaları için kapasiteyi artırır. Bu yaklaşım, nöroaktif hedeflerin mekanistik risk analizini kolaylaştıran ve öncü bileşiklerin belirlenmesinde öngörülebilir güven sağlayan kantitatif tercih indeksi (PI) çıktıları sunar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tercih indeksi ölçümleri aracılığıyla çözünür bileşiklere karşı çekim veya itimin nicelleştirilmesiyle terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Gen-bileşik etkileşimlerini netleştiren, tekrarlanabilir ve popülasyon tabanlı davranışsal çıktılar yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Kaçınma veya çekim fenotiplerine dayanarak aktif ve inaktif bileşikleri ayırt ederek portföy önceliklendirmesine yardımcı olan nicel veriler üretir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Çok kuyucuklu plaka formatları ve otomatik görüntüleme sistemleri ile uyumlu, standardize edilmiş, tekrarlanabilir davranışsal analizler üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Aynı koşullar altında birden fazla tekrarlı analizin eş zamanlı olarak gerçekleştirilmesine olanak tanıyarak mutant kütüphaneleri veya bileşik koleksiyonları için tarama kapasitesini artırır.
- Çıktı Standardizasyonu: Hit seçimi ve doz-yanıt modellemesine uygun, kantitatif ve normalize edilmiş okumalar olarak tercih indeksi (PI) değerleri üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Nematod türleri arasında korunan kemosensoriyel yolların çalışılmasını kolaylaştırarak türler arası hedef doğrulamasını destekler.
- Translasyonel Süreklilik: Duyusal işleme ile bağlantılı genetik mutantların fenotipik taramasını mümkün kılarak nörolojik bozuklukların mekanistik modellerine veri sağlar.
- Öngörücü Risk Azaltma: Popülasyon yanıtlarının zamansal dinamiklerini yakalayarak akut davranışların adaptif davranışlardan ayırt edilmesine yardımcı olur ve aday optimizasyonundaki yanlış pozitifleri azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, genetik pertürbasyon ile bileşik yanıtı arasında köprü kuran kantitatif davranışsal fenotipler sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur ve standardize edilmiş, multipleks tarama yoluyla öncü bileşik belirlemesini destekler.
- Keşif Biyolojisi: Çözünür ipuçlarına karşı popülasyon düzeyindeki kaçınma veya çekilmeyi ölçerek kemosensasyonda gen fonksiyonunun hipotez testine imkan tanır.
- Tarama: Otomatik video analizi yoluyla assay standardizasyonu ve tekrarlanabilirlik sağlayarak operatör yanlılığını minimize eder ve veri güvenilirliğini artırır.
- Analitik: Genotipler, tedaviler ve zaman noktaları arasında karşılaştırmaya olanak tanıyan kantitatif çıktılar olarak tercih indeksi (PI) değerleri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Duyusal gen mutantlarını değiştirilmiş kemosensoryal yanıtlarla ilişkilendirerek gen keşfinden fenotipik doğrulamaya kadar sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Modüler tasarımı ve otomatik okuması sayesinde, birden fazla proje genelinde genetik mutantların ve kimyasal kütüphanelerin taranması için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kantitatif, popülasyon tabanlı davranışsal fenotipleme yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Otomatik video analizi ve çok kameralı paralelleştirme yoluyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirerek, manuel işlem süresini ve deneyler arası değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: Zayıf hedef etkileşimi nedeniyle geç aşamadaki kayıpları azaltan net, ölçülebilir fenotipik sonuçlar sağlayarak, öncü bileşik belirlemedeki devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Güçlü, yüksek kapasiteli davranışsal tarama verilerine dayalı olarak, bileşiklerin ve genetik hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- C. elegans yönetimi, davranışsal analiz tasarımı ve temel video analiz yazılımı kullanımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Çok kameralı mikroskopi düzeneğine, kontrollü ortam odasına ve tercih indeksi hesaplaması için görüntü analiz hatlarına bağımlıdır.
- Deneyler arası tutarlılığı sağlamak için solucan hazırlama, plaklama yoğunluğu ve aklimatizasyon süresinin standartlaştırılması gerekir.
- Diğer nematod türlerine veya duyusal modalitelere adaptasyon; arena tasarımında, stimulus iletiminde veya takip parametrelerinde düzenlemeler gerektirebilir.
- Mekansal kısıtlamalar ve popülasyona bağlı okuma nedeniyle, gradyanlarda kemotaksi çalışmalarına veya çok düşük solucan sayılarının kullanıldığı analizlere uygun değildir.
