Name: Üretim, kristalizasyon ve insan IKK1/α yapı belirlenmesi için bir rehber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Keşfedin insan IKK1/α proteininin üretimi, kristalizasyonu ve yapı belirlenmesi için optimize edilmiş yöntemi. Böcek hücrelerinde ifade ve moleküler yer değiştirme teknikleri ile immün sinyalizasyon mekanizmalarını aydınlatın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Personel beamlines 19ID, 24ID ve 13ID kaynağında Gelişmiş foton, Lemont, IL, çeşitli kristalleri veri toplama sırasında destek için teşekkür ediyoruz. Düşük çözünürlüklü cryo-EM harita EM harita/bina, ilk IKK1 moleküler yerine arama model oluşturmak için kullanılan modeli erken aşamalarında bize alma için Dmitry Lyumkis, Salk Enstitüsü için minnettarız. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma gelen NIH hibe AI064326, CA141722 ve GM071862 GG için fon aldı. SP Şu anda bir hoş geldiniz güven DBT Hindistan ara biri.

<ol><li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+an+active+player+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li>
<li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+meets+cancer%2C+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+meets+ubiquitination%3A+the+control+of+NF-%5Bkappa%5DB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li>
<li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983155">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).</li>
<li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22435551">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li>
<li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li>
<li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li>
<li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li>
<li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+%28IKK%29+contains+two+kinase+subunits%2C+IKKalpha+and+IKKbeta%2C+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li>
<li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li>
<li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+cloning+of+NEMO%2C+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li>
<li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+%28IKK%29+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li>
<li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li>
<li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li>
<li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+IKKalpha+of+a+second%2C+evolutionary+conserved%2C+NF-kappa+B+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li>
<li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li>
<li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li>
<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
<li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+%28NIK%29+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1%2C+cIAP2%2C+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li>
<li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li>
<li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li>
<li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li>
<li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaB+kinase+complexes%3A+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1%2Falpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li>
<li>Otwinowski, Z. aM., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?he5368">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?li5010">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li>
<li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0010/8983/dem.pdf">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li>
<li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+2-amino-3%2C5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+crystallographic+model+and+data+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.

Üretim, kristalizasyon ve yapı çözüm iki ilgili IKK proteinlerin Biz IKK1/α X-ray kristal yapısı deneyimlerimiz IKK2/β protein üretim, kristalizasyon ve yapı belirlenmesi ile verilen nispeten basit bir egzersiz olacaktır kavramı ile belirlemek için yola çıktı. Ancak, biz bu iki ilgili proteinler kristalizasyon kolaylığı ile ilgili çok farklı davrandığını çok şaşırdık. Birkaç yüksek profilli laboratuvarları çabalarına rağmen yaklaşık yirmi IKK1 yapı tayini aldı. Bu büyük ölçüde birkaç anahtar performan...

Transkripsiyon dimerik transkripsiyon faktörleri NF-κB ailesinin faaliyetlerinin inflamasyon ve bağışıklık yaşam ve ölüm arasında değişen çeşitli hücresel fonksiyonları için gereklidir. Bu etkinlikler hücrelerinde ve otoimmün hastalıklar ve kanser1,2,3dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullar yönetmelik yol açar bir kayıp sıkı kontrol edilir. Bir uyarıcı yokluğunda, NF-κB faaliyetlerinin IκB (inhibitörü - κB olan) proteinler4tarafından Inhibe tutulur. IκB protein üzerinde belirli Ser kalıntılarının fosforilasyon bunları ubiquitination ve sonraki proteasomal bozulma ya da seçici işleme5için işaretler. İki son derece homolog Ser/Thr kinaz, IKK2/β ve IKK1/α, NF-κB aktiviteleri merkezi düzenleyiciler Bu fosforilasyon olaylar6,7taşıyarak hareket.
Bir ligand ve bir reseptör arasındaki etkileşimler arabulucu NF-κB faktörleri harekete geçirmek için önde gelen bir dizi sinyal transduces. NF-κB sinyal verme işlemi genel olarak iki farklı yolları-kurallı ve kanonik olmayan (alternatif)8sınıflandırılabilir. IKK2/β etkinliği öncelikle iltihaplı ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı9için esastır kurallı yolun NF-κB sinyal düzenlemektedir. IKK2/β10 içinde şimdiye kadar biyokimyasal olarak uncharacterized IKK karmaşık bir hızlı ve kısa ömürlü aktivasyon ayrı özelliğidir bu yolu — IKK1 ve IKK2 yanı sıra düzenleyici bir bileşeni, NEMO (NF-κB temel modülatör oluşan olduğu tahmin )11,12,13. İki katalitik IKK alt birimleri IKK kompleks arasında IKK2 için NF-κB ve aynı zamanda atipik bir IκB protein bağlı öncelikle sorumlu14 için prototip IκBs (α, - β ve - γ) belirli kalıntılarının fosforilasyon olduğunu NF-κB1/olan p105, bir NF-κB p50 alt birim5habercisi. Fosforilasyon ubiquitination indüklenen ve proteasomal bozulma IκB (veya p105 işlenmesi), yayın ve NF-κB dimer15belirli bir kümesi aktivasyonu yol açar. Anormal NF-κB etkinliği IKK2 yanlış düzenlenmiş fonksiyonu nedeniyle birçok kanserleri de olduğu gibi otoimmün hastalıklar2,3,16gözlenmiştir.
IKK2/β aksine, temel geliştirme ve dokunulmazlık için kanonik olmayan yolun NF-κB sinyal IKK1/α etkinlik düzenlemektedir. IKK1 NF-κB2/p100 belirli artıkları, işleme ve p52 nesil yol açar, C-terminal IκBδ kesimindeki phosphorylates. Transcriptionally etkin p52:RelB heterodimerdir oluşumu gelişimsel sinyalleri7,17,18,19,20yavaş ve sürekli yanıt başlatır. İlginçtir, merkezi NF-κB faktör p52 döngüsünün bu nesil eleştirel bir başka faktör, NF-κB Inducing kinaz (NIK)21,22, ama değil IKK2 veya NEMO bağlıdır. Resting hücrelerde, NIK düzeyini nedeniyle onun sürekli proteasome bağlı bozulma23,24,25düşük seviyede kalır. Hücreleri tarafından 'kanonik olmayan' ligandlar ve bazı kötü huylu hücrelerin uyarılması, NIK ve IKK1 etkinleştirmek için stabilize olur / α. kinaz faaliyetleri NIK ve IKK1 verimli p100 p527içine işleme için gereklidir. IKK1 ve NIK işleme ve p52 üretimi için önde gelen onun C-terminal IκBδ kesimi üzerindeki üç serines (Ser866, 870 ve 872) NF-κB2/p100 fazdan. Kanonik olmayan aktivasyonu anormal multipl miyelom26,27,28de dahil olmak üzere birçok maligniteler karıştığı olmuştur.
Hiçbiri bu kadar etkili bir ilaç olduğunu kanıtladı, ancak birkaç son derece verimli ve belirli inhibitörleri IKK2/β için bilinir. Buna ek olarak, IKK1/α-özel inhibitörleri seyrek. Bu kısmen yapısal ve biyokimyasal bilgilerini NF-κB IKK1 hücreleri ve akılcı ilaç tasarım tarafından aktivasyonu mekanik temeli anlayışımız sınırlar IKK1/α üzerinde bizim eksikliği kaynaklanıyor. IKK2/β X-ray yapılarının IKK2/β29etkinleştirme mekanizması anlayışlar sağladı; Ancak, bu yapıların ne kadar farklı ters yönde uyaranlara açığa olabilir değil tetiklemek harekete geçirmek IKK1/α veya IKK2/β NF-κB faaliyetleri 30,31farklı kümeleri düzenleyecek. IKK1/α farklı sinyal verme işlevi temel mekanik olarak anlamak ve akılcı ilaç tasarımı için bir platform oluşturmak için IKK1/α yapısını belirleme üzerinde duruldu.

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin artık üretilmiyor, yerini Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III alıyor Böcek hücre ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>SF9 hücreleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>anti-IKK1 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>Daha önce Imgenex tarafından satılıyordu</td></tr><tr><td>anti-PentaHis antikoru</td><td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Nitroselüloz da kullanılabilir</td></tr><tr><td>Ni-NTA agaroz</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Bradford tahlil reaktifi</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 sütun</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Amicon yoğunlaştırıcı</td><td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>Bileşik A</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem IKK inhibitörü XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>Hediye öğesi</td><td></td></tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran sülfat</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr> <tr><td>Dekstran sülfat</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>Bazıları SIGMA kataloğunda yeni Cat #. Sahip olduğumuz şey aslen farklı Cat # olan Fluka'dandı.</td></tr><tr><td>Kristalizasyon Ekranları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristal Ekran I ve II (Kristal Ekran HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>İndeksi HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/İyon ve PEG/Ion2 (PEG/İyon HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 ve PEGRx 2 (PEGRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 ve SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Kristal bağlar</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>Synchrotron</td><td>ABD Enerji Bakanlığı'ndaki Gelişmiş Foton Kaynağı (APS) s Argonne Ulusal Laboratuvarı</td><td>Işın Hattı 19 ID</td><td>ABD Enerji Bakanlığı'ndaki Gelişmiş Foton Kaynağı (APS) Argonne Ulusal Laboratuvarı, neredeyse tüm bilimsel disiplinlerde araştırma için ultra parlak, yüksek enerjili depolama halkası tarafından oluşturulan X-ışını ışınları sağlar.</td></tr></tbody></table>

Üretim, kristalizasyon ve insan ikk1/α yapı belirlenmesi için bir rehber

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Bir sınıf hücre dışı uyaranların bir NF-κB alt birimi, p52, onun öncü p100 işlenmesi yoluyla nesil ikna etmek için IKK1/α aktivasyonu gerektirir. bir homodimer veya başka bir NF-κB alt birimi, RelB ile heterodimerdir P52 görür. Bu dimer sırayla genler inflamasyon, hücre hayatta kalma ve hücre döngüsü dahil yüzlerce ifade düzenler. IKK1/α öncelikle üçlü bir kompleks olarak IKK2/β ve NEMO ile ilişkili olarak kalır. Ancak, küçük bir havuz da düşük molekül ağırlıklı complex(es) görülmektedir. Bilinmeyen mi p100 işleme faaliyet IKK1/α aktivasyonu içinde daha büyük veya daha küçük karmaşık havuzu tarafından tetiklenir. IKK1/α bünye faaliyet çeşitli kanserler ve inflamatuar hastalıklarda algılandı. IKK1/α aktivasyonu mekanizmasını anlamak ve bir uyuşturucu hedef olarak kullanılmasını etkinleştirmek için biz rekombinant IKK1/α E. coligibi farklı ana bilgisayar sistemleri ifade böcek ve memeli hücreleri. Biz başarılı çözünür IKK1/α baculovirus içinde ifade son derece saf protein miktarda mg alma, huzurunda inhibitörleri crystallizing ve x-ışını kristal yapısını belirleme böcek hücreleri enfekte. Burada, Rekombinant protein, onun kristalizasyon ve onun x-ışını kristal yapısı belirlenmesi üretmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır.

Klonlama ve ifade IKK1/α farklı yapıları İnsan IKK1/α baculovirus ifade vektör pFastBacHTa bir N-terminal hexa-histidin elde etmek için onun EcoRI ve NotI kısıtlama siteleri içinde içine klonlanmış tam uzunlukta IKK1 etiketli. Etiketi TEV proteaz sindirim tarafından kaldırılmış olabilir. Tam uzunlukta IKK1/α her iki ucundaki esnek bölgeleri içeren ve esnek bölgeler genellikle bir protein kristalize zor render beri IKK1/α pFastBacHTa vektör yukarıda belirtilen siteler i...

IκB kinaz 1/α (IKK1/α CHUK) hücresel etkinliklerle öncelikle NF-κB transkripsiyon faktörleri aktivasyonu sayısız ilgilenmektedir Ser/Thr protein kinaz olduğunu. Burada, üretim ve kristal yapısı bu protein tayini için gerekli ana adımları açıklar.

Üretim, kristalizasyon ve insan IKK1/α yapı belirlenmesi için bir rehber

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Bu prosedürün amacı, sinyalleme işlevinin mekanistik temelini anlamak ve rasyonel ilaç tasarımı için platformlar oluşturmak için insan IKK1-alfaüretiminin, kristalizasyonunun ve yapısal tayinine rehberlik etmektir. Bu yöntem, araştırmacıların bağışıklık sinyali alanındaki anahtar sorgulara yanıt sağlayacak IKK1'in yapısını belirlemelerine yardımcı olmalıdır. Bu teknik, kristalizasyona karşı oldukça refrakter olan IKK proteinlerinin kristallerini elde etmek ve yapıların belirlenmesinde darboğazların üstesinden gelmek için çeşitli kritik bilgiler sağlamak için düzenli bir yolu tanımlar.Genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek, çözünür miligram miktarlarda üreten, iyi beslenmiş protein, böcek hücrelerinde ifadesini gerektirir, ve kristalizasyon koşulları sadece çok dar bir pencere altında yapılabilir. IKK1'in yapısının belirlenmesinde kullanılan moleküler değiştirme prosedürü, özellikle uygun arama modelleri yokluğunda birçok IKK1 molekülünü içeren asimetrik ünitenin yerinde değil, kristallerin kötü sapma özelliği nedeniyle çok zor olabilir. Prosedürleri gösteren kyle Shumate ve Sonjiala Hotchkiss, benim laboratuvar öğrencileri olacak.İlk gün, plaka Sf9 hücreleri Sf903 böc

a-guide-to-production-crystallization-structure-determination-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

Protein-DNA kompleksleri Kristal yapısı, protein işlevi, etki mekanizması, aynı zamanda, belirli bir etkileşimin doğasını ilişkin bilgi sağlayabilir. Burada ile birlikte kristalleşme için uzunluk, sekans ve dupleks DNA uçları optimize etmek için...

SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Büyük sarmal bobin alanlarının karakterizasyonuna ve kristalizasyonuna rehberlik etmek için basit biyokimyasal ve hesaplamalı analizi içeren bir çerçeve tanımlıyoruz. Bu çerçeve, küresel proteinler için uyarlanabilir veya çeşitli yüksek verimli teknikleri içerecek şekilde genişletilebilir.

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

Protein mikro kristalleri kullanılarak X-ışını kristalografisi için bir protokol sunulmuştur. Saflaştırmadan sonra ya da selüloda in vivo büyümüş mikrokristalleri analiz eden iki örnek karşılaştırılmıştır.

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

NEMO'nun IKK-bağlayıcı alanının x-ışını kristalografisi ile yapı tayinine ilişkin protokolleri açıklıyoruz. Bu yöntemler arasında protein ekspresyonu, saflaştırma ve karakterizasyonunun yanı sıra başarılı kristal optimizasyonu ve proteinin sınırsız formunda yapı tespiti stratejileri yer almaktadır.

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

Protokol, farklı türlerden potansiyel β 2 mikroglobulin (β 2m)ikameyoluyla stabil majör histocompatibility complex (MHC) sınıfı I elde etmek için deneysel yöntemleri açıklar. MHC I'in homolog ve heterolog β2m ile stabilize edilen yapısal karşılaştırması araştırılmıştır.

Heterologöz β2-Microglobulin ile Yarasa Major Histocompatibility Complex Class I'in Stabilitesi ve Yapısı

Bu makalede, seyrek matris ekranlarda yeni kristalleşme koşulları oluşturmak için mikrotohumlama kullanarak I3C (5-amino-2,4,6-triiodoishthalic asit) ile türemiş protein kristalleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Tepsiler sıvı dağıtım robotları kullanılarak veya elle kurulabilir.

Rastgele Mikrotohum Matris Taraması Ile Protein Kristallerinin I3C ile Türevleştirilmesi

Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Keşfedin insan IKK1/α proteininin üretimi, kristalizasyonu ve yapı belirlenmesi için optimize edilmiş yöntemi. Böcek hücrelerinde ifade ve moleküler yer değiştirme teknikleri ile immün sinyalizasyon mekanizmalarını aydınlatın.

Üretim, kristalizasyon ve insan IKK1/α yapı belirlenmesi için bir rehber

Daha fazla video keşfet