Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Bu protokolün genel amacı, akut miyeloid lösemi hastalarından alınan kemik iliği örneklerinin, lösemi kök hücrelerinin miktar tayini de dahil olmak üzere ölçülebilir rezidüel hastalık için doğru bir şekilde test edilmesidir. Bu yöntem, akut miyeloid lösemi hastalarının kemik iliği örneklerinde ölçülebilir rezidüel hastalığın doğru bir değerlendirmesini sağlayabilir. Bu yaklaşımın temel avantajı, protokolün yakından takip edilmesinin yüksek oranda tekrarlanabilir, yüksek kaliteli sonuçlar vermesidir.

Bu tekniğin etkileri, hastaların tedaviye yanıtının bir okuması olarak kullanılabileceği için klinik karar vermeye kadar uzanır. Prosedürleri göstermek hematolog Jeroen Janssen, tanısal hematoloji laboratuvarı teknisyeni Gerrit Sijm ve MRD ekibinin teknisyenleri Jennifer Scheick ve Sander Snel olacak. Hasta lateral dekübit pozisyonundayken, superior posterior iliak omurgayı bir kalemle işaretleyin ve amaçlanan biyopsi alanının cildini dışa doğru dairesel bir hareketle etanol içinde% 0.5 ila 1 klorheksidin ile dezenfekte edin.

Lokal anestezi uyguladıktan sonra, proksimal ucu avuç içinde ve işaret parmağı kontrol için iğnenin metal şaftının yanına yakın olacak şekilde 15 gauge 2,8 inçlik bir iğne alın. Hafif ama sıkı bir basınç kullanarak, iğneyi uyuşturulmuş deriden iliak omurgaya doğru hızlı bir alternatif pronasyon supinasyon hareketi ile sokun. İğne posterior iliak omurga ile temas ettiğinde, stileti çıkarın ve iğneye 10 mililitrelik boş bir şırınga takın.

10 mililitreye kadar kemik iliği spikülleri toplanana kadar şırınga içinde negatif basınç oluşturmak için pistonu yavaşça geri çekin. Hemodilüsyonu önlemek için aspirat başına 10 milden fazla kemik iliği almayın. Şırıngayı çıkarın ve stileti tekrar iğnenin üzerine yerleştirin.

Ardından, yaklaşık iki mililitre iliği bir saat camına boşaltın ve heparin kaplı sekiz mililitrelik bir tüpe enjekte edilmek üzere yeterli numunenin alındığından emin olun ve tüpü hemen ters çevirin. Pıhtılaşmayı önlemek için, kemik iliği eklenir eklenmez antikoagülan içeren tüpe yatırım yapmak önemlidir. Optimum morfolojik değerlendirme için, spikülleri saat camındaki aspirattan bir cam slayta aktarmak için plastik bir spatula kullanın ve başka bir cam slaytı iliğin üzerinde dikkatlice kaydırın.

Kuruduktan sonra, ışık mikroskobu ile analiz için spikülleri May-Grunwald Giemsa ile boyayın. Kemik iliği tüpünü plastik bir tutucuya yerleştirin ve tutucuyu bir ortam jeli paketi ve doldurulmuş bir talep formu ile plastik bir kaba yerleştirin. Kemik iliğini akış sitometrisi ile analiz etmeden önce, akış sitometresini başlatın ve ileri saçılma ve yan saçılma nokta grafiği ile yeni bir deney oluşturmak için akış sitometrisi analiz yazılımını açın.

Hücrelerin boyutunun ve tanecikliğinin değerlendirilmesi için, sağlıklı bir donörden etiketlenmemiş parçalanmış periferik kan hücrelerini yükleyin ve Hücre Edinme işlevini seçin. Lenfositleri kapatın ve kapılı hücre popülasyonu için uygun ortalama hedef değerlere ulaşmak için ileri ve yan saçılma voltajlarını ayarlayın. Ardından, en az 10.000 olay için veri toplayın.

Hedef floresan kanalı foto çarpan tüp voltajlarını ayarlamak için, önce düşük akış hızında 10.000 olay elde etmek için üreticinin talimatlarına göre sekiz tepeli gökkuşağı boncuk kalibrasyon parçacıklarını kullanın. İleri ve yan saçılma nokta grafiğindeki tekli boncukları kapılayın ve ardından FITC-PE nokta grafiğindeki 7. zirveyi geçitleyin. Her florofor için elde edilen boncuk popülasyonlarını kapatın.

Sekiz tepeli gökkuşağı boncuk süspansiyonunun alımına devam edin ve üreticinin talimatlarına göre hedef MFI değerlerine ulaşmak için tüm floresan kanallarındaki PMT voltajlarını ayarlayın ve ince ayar yapın. Yaklaşık 2.000 olayın verilerini toplamak için Kaydet'i kullanın ve 7. tepe boncukları için MFI'yi kontrol edin. Daha sonra, karşılık gelen floresan tüplerindeki boncukları eksi bir kontrol ile lekelemek için her deneysel florokrom konjuge antikorun yeterli bir hacmini ekleyin ve tüpleri iyice girdaplayın.

İleri saçılma eşiğinin 5.000 olarak ayarlanmasına ve tüm flourokromların telafi değerlerinin sıfır olmasına dikkat ederek aynı telafi parametreleriyle yeni bir boş deney oluşturun. Kompanzasyon kontrollerini oluşturmak için Kompanzasyon Kontrolü Oluştur işlevini seçin ve lekesiz kontrol tüpünü yükleyin. P1 kapısını tekli boncuk popülasyonu etrafında ayarlayın ve P1 kapısının yalnızca tekli boncuklar içerdiğini onaylayın.

P1 kapısına sağ tıklayın ve Tüm Ücret Kontrollerine Uygula'yı seçin. Ardından, P2 kapısının her bir çiçeklenme histogramındaki pozitif popülasyonu kapsadığını doğrulayan tüm tek etiketli çiçeklenme tüpleri için verileri kaydedin. Akış sitometrik analizi için hücreleri boyamak için, kemik iliğini laboratuvara taşıyın, hasta çalışma numarasını ve doğum tarihini doğrulamak için istek formunu kontrol edin ve neyin boyanması gerektiğini belirleyin.

MRD için dört tüpten oluşan bir boyama paneli kullanıyoruz. Burada bir tüpten oluşan LSC panelinin boyanmasını gösteriyoruz. Hücre sayımından sonra, uygun hacimde kemik iliğini 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için deneysel hücre hacminin 10 katı kadar lizis tamponu ekleyin. Hücreleri karıştırmak ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmek için tüpü ters çevirin. Lizis periyodunun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında 15 mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre peletini santrifüjleme ile tekrar hasat edin. Bu arada, beş mililitrelik FACS tüplerinde uygun miktarda antikor kokteyli solüsyonunu pipetleyin. Burada kök hücre tüpü için panel gösterilmektedir.

Peleti yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve hücrenin süspansiyonunu karanlıkta 15 dakikalık bir inkübasyon için monoklonal antikor kokteyl solüsyonu içeren FACS tüpüne ekleyin. Daha sonra, hücreleri yıkama tamponunda yıkayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Santrifüjlemeden sonra, peleti 400 mikrolitre taze yıkama tamponunda tekrar süspanse edin.

Lösemik kök hücreleri analiz etmek için, kök hücre antikor kokteyli ile boyanmış hücre süspansiyonuna dört mikrolitre boş boncuk ekleyin. Ardından, deneysel hasta örneklerinden en az dört kez 10 ila 6. olayları elde ederek önceden ayarlanmış parametreleri kullanarak örnekleri okuyun. Akut miyeloid lösemi hastalarının yaklaşık% 90'ında gözlenen lösemi ile ilişkili immünofenotipi tanımlamak için, patlama kapılarının gösterildiği gibi uygun şekilde ayarlanması çok önemlidir.

Burada, CD34 pozitif ilkel hücreler üzerinde farklı anormallik türleri barındıran bireysel hastalardan elde edilen veri örnekleri gösterilmektedir. Bu grafiklerde, tam remisyonda kalan bir hasta ve ikinci indüksiyon tedavisi döngüsünden sonra ölçülebilir rezidüel hastalık pozitif sonuçları olduktan sonra nükseden bir hasta gözlemlenebilir, bu da numune analizinden önce doğru kapı ayarına duyulan ihtiyacın altını çizmektedir. LSC'nin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi, bu grafiklerde gösterildiği gibi, özellikle CD34 pozitif CD38 negatif blast hücreleri üzerindeki anormalliklerin ek analizini gerektirir.

Bu protokol uygulanırken kemik iliği örneklemesi, taşınması, deneysel çalışma ve bu işlemin analiz aşamaları için uzman ve yedek personelin bulunması çok önemlidir. Bu prosedür aynı zamanda, belirli hücre popülasyonları ve ilgilenilen moleküler anormallikler arasındaki korelasyon hakkında ek soruları yanıtlamak veya klinik sonucu tahmin etmek için bir hastanın risk grubunu iyileştirmek için sitogenetik ve moleküler analiz yapmak için de kullanılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, hematoloji alanındaki araştırmacıların tedaviden sonra AML hastalarında kalan hastalıkları keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, AML hastalarının kemik iliği örneklerinin toplanması ve taşınması da dahil olmak üzere akış sitometrisi kullanarak kalıntı hastalığı nasıl doğru bir şekilde tanımladığımızı ve ölçtüğümüzü iyi anlamış olmalısınız.