Kök hücre kullanarak gelişmekte olan insan beyni Vitro Zika virüs enfeksiyonu modelleme serebral Organoids türetilmiş

Bu prosedürün genel amacı, kök hücre türevli serebral organoidler kullanarak gelişmekte olan insan beyninde zika virüsü enfeksiyonunu modellemektir. Bu yöntem, biyoloji alanındaki hangi hücrelerin enfekte olabileceği ve hangi proteinlerin enfeksiyon yoluna dahil olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, erken insan enfeksiyonunu taklit etmesi, yüksek verimli testlerde kullanılabilmesi ve CRISPR gibi odak genetik tekniklerle birleştirilebilmesidir.

Bu yöntem, zika virüsü enfeksiyonunun mekanizması hakkında bilgi sağlayabilir. İlaç taramaları ve virüs psödotiplemesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Düzenli kök hücre bakım yöntemlerini kullanarak, kültürleri %50 ile %70 arasında bir birleşme noktasına getirin.

Kültürleri 10 ila 20x büyütmede parlak alan mikroskobu kullanarak inceleyin ve koloninin tespit edilebilir bir farklılaşma olmaksızın sağlıklı bir morfolojiye sahip olduğundan emin olun. Kseno içermeyen kök hücre bakım ortamını sıcak su banyosunda 37 santigrat dereceye getirin ve iki mililitre enzimatik ayırma reaktifi ve 50 mikrolitrelik bir stok kaya inhibitörü şişesini oda sıcaklığında çözün. Ardından, ultra düşük ataşmanlı bir U tabanlı 96 oyuklu plaka, çok kanallı bir p200 pipeti ve 25 mililitrelik bir reaktif rezervuarı hazırlayın.

Daha sonra, ortamın 45 mililitresini 50 mililitrelik konik bir tüpe alın. 45 mikrolitre kaya inhibitörü ekleyin ve karışımı üç katına çıkararak inhibitörü iyice karıştırın, ardından iki ila dört versiyon halinde karıştırın. Kök hücreler içeren altı oyuklu bir plakanın iki kuyusunu vakumla aspire edin ve her bir oyuğa hızlı bir şekilde bir mililitre enzim içermeyen ayrılma reaktifi ekleyin, ardından plakayı dört dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, muamele edilen kuyucukları vakumla aspire edin ve her oyuğa bir mililitre enzimatik ayırma reaktifi ekleyin. 37 santigrat derecede beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın. Toplanmış hücreleri parçalamak için plakaya hafifçe vurun.

Ardından, hücreleri mikroskop altında inceleyin. Büyük hücre kümeleri hala görülebiliyorsa, plakayı 37 santigrat derecede iki dakika daha inkübe edin. Kümeler artık çıplak gözle görülemeyene kadar adımı tekrarlayın.

Hücreler düzgün bir şekilde ayrıştıktan sonra, ayrışma enzimlerini devre dışı bırakmak için her oyuğa bir mililitre kseno içermeyen kök hücre bakım ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe çekin ve hücre sayımı için küçük bir alikot alın. Santrifüjleme sırasında, hücreleri sayın ve mililitre süspansiyon başına 60.000 hücre elde etmek için gereken yeniden süspansiyon hacmini belirleyin.

Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücreleri, kaya inhibitörü içeren ortamda mililitre başına 60.000 hücrede yeniden askıya alın. Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, düzgün bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücreleri beş ila 10 kez hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunu hemen reaktif haznesine ekleyin ve çok kanallı bir p200 pipet kullanarak 150 mikrolitreyi ultra düşük ataşmanlı bir alt 96 kuyulu plakanın her bir oyuğuna aktarın.

Ardından, plakayı bir dakika boyunca 150 x G'de santrifüjleyin ve ardından plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Plakayı 48 saat boyunca rahatsız etmeyin. İkinci günden başlayarak, 50 mililitrelik konik bir tüpte 17 mikrolitre stok kaya inhibitörü içeren 17 mililitre ortam hazırlayın.

Karışımı sıcak su banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın. Organoid plakayı inkübatörden alın ve çok kanallı bir p200 pipet kullanarak, ilk sıradaki kuyucukların kenarlarından yavaşça 75 mikrolitre ortam çekin. Ardından, gevşek hücreleri ve organoidleri çıkarmak için hızla kuyuya geri atın.

Bu dağıtma işlemini her satır için tekrarlayın. Organoidlerin her bir kuyucuğun dibine battığından emin olmak için 15 saniye bekleyin ve ardından çok kanallı p200 pipetini kullanarak her oyuktan yavaş ve dikkatli bir şekilde 75 mikrolitre ortam aspire edin ve bir atık haznesine dağıtın. Daha sonra, kaya inhibitörünü içeren ortamı bir reaktif rezervuarına aktarın, her bir organoid kuyucuğuna 150 mikrolitre ortam dağıtın ve ardından hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.

17 mililitre taze kültür ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın, bu sefer herhangi bir kaya inhibitörü olmadan. 100 mikrolitreye ayarlanmış çok kanallı bir p200 pipeti kullanarak, daha önce gösterilen dispersiyon işlemini tekrarlayın ve organoidlerin kuyucuklarının dibine battığından emin olmak için 15 saniye bekleyin. Ardından, her bir oyuktan 125 mikrolitre ortamı dikkatlice aspire edin ve 150 mikrolitre ısıtılmış ortamla değiştirin.

Plakayı 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Ortamı burada gösterilen tarife göre hazırlayın ve ardından karışık çözeltiyi 500 mililitrelik bir filtrede steril olarak süzün. Dördüncü günden hücreler yaklaşık 24. günde enfekte olana kadar, nöral indüksiyon ortamı kullanarak her gün düzenli bakım yapın.

Filtrelendikten sonra, nöral indüksiyon ortamının 17 mililitresini 37 santigrat dereceye ısıtın ve geri kalanını dört santigrat derecede saklayın. 100 mikrolitreye ayarlanmış çok kanallı bir p200 pipeti kullanarak, organoid plakanın tüm kuyucuklarını dağıtın. Organoidlerin kuyularının dibine battığından emin olmak için 15 saniye bekleyin.

Her oyuktan 125 mikrolitre besiyerini dikkatlice aspire edin ve 125 mikrolitre taze nöral indüksiyon besiyeri ile değiştirin. Organoidler zika virüsü enfeksiyonu için hazır olana kadar bu neral indüksiyon başarısını her gün tekrarlayın. Earle'ın 1x dengeli tuz çözeltisini, 1x PBS'yi ve nöral indüksiyon ortamını sıcak su banyosunda 37 santigrat dereceye getirin.

Daha sonra, 1x earle çözeltisinde bilinen bir konsantrasyondaki zika virüsünü, tipik olarak 0.1 ile 10 arasında olan hedef enfeksiyon çokluğuna seyreltin. Bir p200 pipeti kullanarak, her bir organoid kuyucuğundan tüm ortamı dikkatlice çıkarın. Ardından, organoidleri 200 mikrolitre ısıtılmış 1x PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın.

Ortamı her bir oyuktan çıkarırken, organoide dokunmamak veya pipete emmemek çok önemlidir. Bu, organoidde onarılamaz bir hasara neden olabilir. Bu olursa, organoidi atmak en iyisidir.

Daha sonra, tek kanallı bir p200 pipeti kullanarak kalan tüm sıvıyı her bir organoid kuyusundan dikkatlice çıkarın. Ardından, her bir kuyucuğa sahte bir enfeksiyon için 1x earle solüsyonu veya zika virüsü solüsyonundan 50 mikrolitre hızlı bir şekilde ekleyin. Bittiğinde her organoidin tamamen suya batırıldığından emin olun, plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre geri koyun.

Viral bir maruziyet tamamlandıktan sonra, organoidlerin her bir kuyusunu 200 mikrolitre PBS ile yıkayın. Organoidlerin 15 saniye oturmasına izin verin ve ardından tek kanallı bir p200 pipeti kullanarak PBS'yi çıkarın. Son olarak, her bir oyuğa 200 mikrolitre taze nöral indüksiyon ortamı ekleyin ve plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin.

DAPI, fosfo-vimentin, TBR2 ve MAP2 ile boyama, organoidler içinde oluşan kortikal yapıları göstermek için birleştirilebilir. Bu yapılar ventriküler bölgeyi, subventriküler bölgeyi, ara bölgeyi ve her rozet içindeki kortikal plakayı içerir. Organoidlerin 108. güne kadar kültürlenmesi, gelişimin sonraki aşamalarını gözlemlemeye izin verir.

Kortikal tabakalaşma bu tip organoidlerde o kadar belirgin olmasa da, gliogeneze doğal geçiş, in vivo olarak olduğu gibi gerçekleşir. Zika virüsü enfeksiyonundan üç gün sonra, organoid boyutunda bir fark görünür hale gelir. Bu farkın ölçeği, organoidlere uygulanan viral enfeksiyon çokluğuna bağlıdır.

Organoid boyutundaki bu fark, enfekte organoidler parçalanmaya başlayana kadar takip eden hafta boyunca artacaktır. Üç gün sonra, sahte kuyulara kıyasla enfekte kuyularda hücresel kalıntılarda da bir artış olacaktır. Bu prosedürü denerken, canlı bulaşıcı materyaller kullanıldığından güvenli laboratuvar uygulamalarını takip etmek önemlidir.

Bu prosedürü takiben, nöral gelişimsel zika virüsü enfeksiyonunda yer alan biyoloji hakkında ek soruları yanıtlamak için immünohistokimya veya RNAC gibi diğer yöntemler uygulanabilir.