Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Bu protokolün genel amacı, karmaşık karyotiplere sahip hücre döngüsü tutuklanmış hücreleri oluşturmak ve izole etmek için basit bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, bağışıklık sisteminin anöploid hücrelerle etkileşimi gibi anöploidi araştırmaları alanındaki temel sorulara cevaplar sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yalnızca karmaşık karyotipleri barındıran bir hücre popülasyonu oluşturmasıdır.

RPE-1 hTERT hücrelerinin senkronizasyonuna başlamak için, taze çözülmüş hücreleri kullanın ve bunları sekiz mililitre standart büyüme ortamı kullanarak 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına dağıtın. Ardından, hücre numarasını belirlemek için bir hemositometre kullanın. Ardından, hücreleri gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, standart büyüme ortamını beş milimolar timidin içeren ortamla değiştirin. G1S sınırındaki hücreleri senkronize etmek için 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, yıkanmış hücrelere standart büyüme ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin. İlk olarak, hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, 500 nanomolar Mps1 İnhibitörü reversin içeren ortamı ekleyin.

37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, standart büyüme ortamı ekleyin ve plakaları inkübatöre geri koyun.

İlk anormal mitozdan yaklaşık 72 saat sonra, hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, 330 nanomolar nokodazol içeren ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin.

Ertesi gün, nokodazol ortamını aspire edin. Daha sonra tabağa üç mililitre PBS ekleyin ve mitotik hücreleri sallamak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun. Mitotik hücrelerin eşit şekilde çıkarılmasını sağlamak için plakayı her musluk arasında döndürün.

İlk çalkalamadan sonra, plakanın kapağına ve kenarına yapışan sıvıyı aspire edin. Ardından, plakayı mikroskop altında 10X büyütmede kontrol edin. Sonra hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın.

Daha sonra, 330 nanomolar nokodazol içeren ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Son çalkalamadan sonra, 10 mililitre standart büyüme ortamı ekleyin.

Tahlilleri gerçekleştirmeden önce hücreleri 37 santigrat derecede 12 ila 24 saat inkübe edin. Plaka üzerinde kalan hücreler, kompleks karyotip veya ArCK hücreleri ile tutuklanmış olarak adlandırılır. Bu protokol, ArCK hücrelerini izole etmek için basit bir yöntemi tanımlar ve izolasyonlarını doğrulamak için ArCK hücrelerine özgü çeşitli özellikler analiz edilir.

ArCK hücreleri, immünoblot analizinde artmış hücre döngüsü inhibitörleri p53, p21 ve p16 seviyeleri gösterirken, öploid ve anöploid döngü hücreleri göstermez. Ek olarak, ArCK hücreleri, öploid kontrol hücreleri değilken mavi-yeşile boyanan yaşlanma ile ilişkili beta-Galaktosidaz için pozitiftir. Segmentasyon grafikleri, ArCK hücrelerinin çoklu, rastgele kromozom kazanımları ve kromozom kayıpları ile karakterize edilen anöploid olduğunu ortaya koymaktadır.

Segmentasyon grafikleri, bir euploid referans log iki ölçeğine göre, kromozom birden X'e kadar tek hücrelerin kopya sayısını gösterir. Bu prosedürü denerken, her sallama sırasında tüm mitotik hücreleri çıkardığınızdan emin olmak önemlidir. Bu işlem yapıldıktan sonra sitokin tahlilleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu tahliller, ArCK hücrelerinin bağışıklık sistemi hücreleri ile etkileşime girme yeteneği gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Nokodazolün tehlikeli olduğunu unutmayın. Bu reaktifi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik ArCK hücrelerini in vitro olarak verimli bir şekilde izole etmek için kullanılabilir. Bu prosedür uygun şekilde yapılırsa yedi gün içinde yapılabilir.