Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı
13 Nisan 2018
Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.
Bu protokolün genel amacı, karmaşık karyotiplere sahip hücre döngüsü tutuklanmış hücreleri oluşturmak ve izole etmek için basit bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, bağışıklık sisteminin anöploid hücrelerle etkileşimi gibi anöploidi araştırmaları alanındaki temel sorulara cevaplar sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yalnızca karmaşık karyotipleri barındıran bir hücre popülasyonu oluşturmasıdır.
RPE-1 hTERT hücrelerinin senkronizasyonuna başlamak için, taze çözülmüş hücreleri kullanın ve bunları sekiz mililitre standart büyüme ortamı kullanarak 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına dağıtın. Ardından, hücre numarasını belirlemek için bir hemositometre kullanın. Ardından, hücreleri gece boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, standart büyüme ortamını beş milimolar timidin içeren ortamla değiştirin. G1S sınırındaki hücreleri senkronize etmek için 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
Daha sonra, yıkanmış hücrelere standart büyüme ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin. İlk olarak, hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, 500 nanomolar Mps1 İnhibitörü reversin içeren ortamı ekleyin.
37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, standart büyüme ortamı ekleyin ve plakaları inkübatöre geri koyun.
İlk anormal mitozdan yaklaşık 72 saat sonra, hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, 330 nanomolar nokodazol içeren ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin.
Ertesi gün, nokodazol ortamını aspire edin. Daha sonra tabağa üç mililitre PBS ekleyin ve mitotik hücreleri sallamak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun. Mitotik hücrelerin eşit şekilde çıkarılmasını sağlamak için plakayı her musluk arasında döndürün.
İlk çalkalamadan sonra, plakanın kapağına ve kenarına yapışan sıvıyı aspire edin. Ardından, plakayı mikroskop altında 10X büyütmede kontrol edin. Sonra hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra, 330 nanomolar nokodazol içeren ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Son çalkalamadan sonra, 10 mililitre standart büyüme ortamı ekleyin.
Tahlilleri gerçekleştirmeden önce hücreleri 37 santigrat derecede 12 ila 24 saat inkübe edin. Plaka üzerinde kalan hücreler, kompleks karyotip veya ArCK hücreleri ile tutuklanmış olarak adlandırılır. Bu protokol, ArCK hücrelerini izole etmek için basit bir yöntemi tanımlar ve izolasyonlarını doğrulamak için ArCK hücrelerine özgü çeşitli özellikler analiz edilir.
ArCK hücreleri, immünoblot analizinde artmış hücre döngüsü inhibitörleri p53, p21 ve p16 seviyeleri gösterirken, öploid ve anöploid döngü hücreleri göstermez. Ek olarak, ArCK hücreleri, öploid kontrol hücreleri değilken mavi-yeşile boyanan yaşlanma ile ilişkili beta-Galaktosidaz için pozitiftir. Segmentasyon grafikleri, ArCK hücrelerinin çoklu, rastgele kromozom kazanımları ve kromozom kayıpları ile karakterize edilen anöploid olduğunu ortaya koymaktadır.
Segmentasyon grafikleri, bir euploid referans log iki ölçeğine göre, kromozom birden X'e kadar tek hücrelerin kopya sayısını gösterir. Bu prosedürü denerken, her sallama sırasında tüm mitotik hücreleri çıkardığınızdan emin olmak önemlidir. Bu işlem yapıldıktan sonra sitokin tahlilleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Bu tahliller, ArCK hücrelerinin bağışıklık sistemi hücreleri ile etkileşime girme yeteneği gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Nokodazolün tehlikeli olduğunu unutmayın. Bu reaktifi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik ArCK hücrelerini in vitro olarak verimli bir şekilde izole etmek için kullanılabilir. Bu prosedür uygun şekilde yapılırsa yedi gün içinde yapılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, hücre döngüsünde durdurulmuş ve karmaşık karyotiplere sahip anöploid hücreleri izole etmek için basit bir yöntem sunmaktadır. Teknik, anöploidi ve hücresel davranış ve bağışıklık etkileşimlerindeki etkilerini anlamamızı artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Genetik
- Sinirbilim
Arka Plan
- Anöploidi, genom istikrarı ile ilişkilidir.
- Karmaşık karyotiplere sahip hücreler genellikle bölünmeyi durdurmaktadır.
- Bu hücreleri anlamak, kanser ve diğer hastalıklar hakkında bilgi sağlayabilir.
- Bu hücrelerin izole edilmesi, özellikleri hakkında daha fazla araştırmayı kolaylaştırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre döngüsünde durdurulmuş hücreler üretmek ve izole etmek için bir yöntem geliştirmek.
- Anöploid hücrelerin özelliklerini araştırmak.
- Anöploid hücreler ile bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimi araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- RPE-1 hTERT hücrelerinin timidin ve nokodazol kullanılarak senkronize edilmesi.
- Mitoz hücreleri izole etmek için hücre çalkalama tekniği.
- Hücre döngüsü inhibitörlerini değerlendirmek için immünoblot analizi.
- ArCK hücrelerinin tanımlanması için yaşlanma ile ilişkili beta-Galaktozidaz boyama.
Ana Sonuçlar
- ArCK hücreleri, hücre döngüsü inhibitörlerinin artan seviyelerini göstermektedir.
- Bu hücreler, yaşlanma ile ilişkili belirtilerle pozitiftir.
- Segmentasyon çizimleri, izole edilen hücrelerde anöploidiyi doğrulamaktadır.
- Yöntem, karmaşık karyotiplere sahip hücreleri etkili bir şekilde izole edebilmektedir.
Sonuçlar
- Protokol, anöploid hücreleri incelemek için güvenilir bir yöntem sağlamaktadır.
- İzole edilen ArCK hücreleri, bağışıklık etkileşimleri üzerinde daha fazla araştırma için kullanılabilir.
- Yöntemin doğru uygulanması, bir hafta içinde sonuçlar elde edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolating cell cycle-arrested cells with complex karyotypes enables mechanistic de-risking of aneuploidy-driven phenotypes in discovery biology. This approach supports target validation by providing a reproducible system to study chromosomal instability and its impact on cellular senescence, inflammation, and immune interactions. The method’s reliance on standard tissue culture techniques enhances scalability and cross-functional adoption in early-stage R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking aneuploidy to genome instability and pro-inflammatory phenotypes.
- Operational Value: Provides a standardized, low-cost workflow for generating ArCK cells using thymidine, reversine, and nocodazole synchronization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a defined cell population with complex karyotypes for quantitative analysis of senescence markers and cytokine secretion.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent isolation of arrested cells via shake-off and nocodazole treatment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of aneuploid cell interactions with immune cells, informing immunomodulatory target assessment.
- Operational Value: Enables downstream functional assays such as cytokine profiling and senescence-associated beta-Galactosidase staining to validate phenotypic outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic screening, particularly for mechanisms involving chromosomal instability and stress response pathways.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating cells with defined karyotypic complexity to clarify causal links between aneuploidy and cellular phenotypes.
- Screening: Enables reproducible preparation of ArCK cells for high-content analysis of cell cycle inhibitors and secretory profiles.
- Analytics: Provides quantitative outputs including immunoblot detection of p53, p21, p16 and segmentation plots for single-cell copy number variation.
- Translational Research: Connects to immune interaction studies, supporting biomarker exploration in senescence-associated secretory phenotypes.
- Enterprise Reuse: Uses accessible reagents and standard culture equipment, allowing adaptation across laboratories without specialized infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in aneuploidy research by providing a defined arrest model with complex karyotypes.
- Operational Value: Delivers a seven-day protocol with high specificity for ArCK cells, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling early assessment of aneuploidy-driven biological risks in target pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets linked to chromosomal instability and senescence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell synchronization techniques and mitotic shake-off procedures.
- Dependent on access to standard tissue culture incubators, hemocytometers, and fluorescence or brightfield microscopy for validation.
- Necessitates standardization of nocodazole handling and wash steps to ensure complete removal of mitotic cells across replicates.
- Adaptation to other cell lines may require optimization of thymidine, reversine, and nocodazole concentrations and timing.
- Limited to in vitro models; primary tissue or in vivo applicability not addressed in source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
