Name: Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Keşfedin hücre döngüsü tutuklanmış kompleks karyotipli anöploid hücrelerin üretim ve yalıtım yöntemini. Bu teknik, RPE-1 hTERT hücreleri kullanarak immün sistem etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser kısmen Koch Enstitüsü destek (çekirdek) Grant P30-CA 14051 Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından Ulusal kurumları sağlık Grant'ın (CA206157-22 ve GM118066) ve Angelika Amon Curt mermer kanser araştırma fonu tarafından desteklenmiştir. Angelika Amon da Howard Hughes tıp Enstitüsü ve Glenn Vakfı Biyomedikal Araştırma için bir dedektif olduğunu. S. S. tarafından Amerikan İtalyan kanser Vakfı (AICF), kanser araştırma Marie Curie eylemleri ve İtalyan Derneği kanser araştırma (AIRC) için bir arkadaş grubu tarafından ve bir KI Quinquennial kanser araştırma bursu tarafından desteklenmiştir. E.M. Howard Hughes tıp Enstitüsü'nden bir arkadaş grubu tarafından desteklenmiştir.

Kültür durumu
RPE-1 hTERT hücre kültürünü kültürlü Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 ile desteklenmiş orta (Tablo reçetesi) Fetal sığır Serum, 2 mM L-glutamin ve 100 U/ml penisilin/streptomisin. Hücreleri oksijen bir ortamda % 5 CO2 37 ° C'de inkübe. Aşağıda açıklanan protokol 10 cm yemekleri kullanılarak geliştirilen ve tüm teknik detayları bildirdi o yemekleri için başvurun. Farklı yemekler kullanıyorsanız, ölçek yukarı ya da buna göre aşağı.
1. senkronizasyon 1 RPE hücrelerinin
<ol><li>Tüm deneyler için 15'ten fazla pasajlar tabi tutulmuştur değil taze çözdürülen hücreler kullanın. Gün 1, çözülme ve ~2.5 - 5.0 x 105 RPE-1 hTERT hücreleri bir 10 cm doku kültürü çanak içine dağıtmak. Standart büyüme Orta 8 mL ekleyin ve gecede kuluçkaya. Standart hücre sayaç (örneğin, hemasitometre) kullanarak cep numarasını belirleyin. Not: Hücre yoğunluğu 1 RPE hücrelerinin büyüme koşullarına anlamına gelir. Büyüme koşulları farklı hücre hatları arasında değişebilir; Buna göre ayarlayarak göz önünde bulundurun.</li>
	<li>2 günde hücreleri G1/S sınır normal büyüme orta alıyorum ve 5 mM timidin içeren 8 mL orta ekleyerek eşitleyin. Not: Timidin konsantrasyon ve tedavi uzunluğunu farklı hücre hatları arasında değişebilir. Test edilecek hücre satırları için en iyi koşulları belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Timidin ekledikten sonra günde 3, 24 h orta (Adım 1.2), serbest timidin bloğundan orta alıyorum ve hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkama tarafından. 8 mL normal büyüme ortamının eklemek ve tabakları da kuluçka için dönmek.</li>
</ol>2. nesil Aneuploid Mitotik kinaz Mps1 aktivite ile girişim tarafından hücreleri
<ol><li>Günde 3, yayımlanmasından sonra 6 h timidin Block (1.3; adım hücreler mitoz girmeden önce yaklaşık 3-6 h bu), Aspire orta, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve 500 nM reversine (Mps1 inhibitörü) içeren orta ile değiştirin. Not: RPE-1 hücreler mitoz 9-12 h girin timidin wash-out10,11' den sonra. Ancak, hücre döngüsü Kinetik farklı hücre hatları arasında değişiklik gösterir. Bu nedenle, pilot deneylerde Bu kinetik tarafından kurulan yöntemleri (DNA analizi içerik üzerinden FACS ölçme tarafındanörneğin,) hücre döngüsü analizi gerçekleştirerek belirlemek çok önemlidir. Ayrıca, Mps1 inhibitörü en uygun çalışma konsantrasyonu hücre hatları arasında değişebilir. Önceki deneyler RPE1 hücreleri kullanarak bir çalışma konsantrasyonu 500 nM10,11,12reversine kullanarak başarılı olmuştur. Test edilecek hücre satırı için en uygun konsantrasyonu belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>Günde 4, 12 h reversine tedavi (yaklaşık 6 hücreler mitoz sonra h gibi) sonra reversine orta Aspire edin ve hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın. 8 mL normal büyüme orta plakasına eklemek ve hücreler için kuluçka dönmek.</li>
</ol>3. Aneuploid Bisiklete binme hücreleri ve ArCK nüfus zenginleştirme kaldırılması
<ol><li>Günde 6, hücreleri ilk mitoz girdikten sonra yaklaşık 72 h (2.2; adım yaklaşık 66 h reversine yıkama hakkında için karşılık gelen çıkış sonra bu 2-3 hücre döngüsü), Aspire orta, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve 300 nM nocodazole içeren orta ile değiştirin. Not: Son iş aneuploid karyotypes yataklık RPE-1 hücreleri genomically kararsız olan ve onların yayılması hakkında tutuklama göstermiştir ilk hatalı mitoz10sonra 2-3 hücre döngüsü. Ancak, bu Kinetik farklı hücre hatları arasında değişebilir. Bu nedenle, aneuploid Bisiklete binme hücreleri kaldırılması için uygun zamanlama belirlemek için pilot deney gerçekleştirmek çok önemlidir.</li>
	<li>Gün 7, 12 h nocodazole tedavi sonra orta Aspire edin ve 3 mL 1 x PBS için plaka ekleyin. Mitotik hücre plaka tarafında dokunarak sallamak. Mitotik hücre bile kaldırılmasına izin için her dokunun arasında plaka döndür.</li>
	<li>Mitotik hücre tümüyle kaldırılmasını sağlamak için alıyorum ve 3 mL 1 x PBS her turun arasında ekleme (3 - 5 kez önerilir), birden fazla mermi için shake-off işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Sallamak-off sonra yavaşça kapağı veya plaka kenarına yapıştırılır herhangi bir sıvı Aspire edin. Kısaca, plaka 10 X büyütme, mikroskop altında kontrol edin. Kaç Mitotik hücre gözlenir emin olun. Beşten fazla Mitotik hücre 10 X amaç altında görülürse, başka yuvarlak-in sallamak-off yineleyin. Not: Mitotik hücreler yuvarlak görünür ve shake-kapalı sonra kısmen müstakil olabilir. Nocodazole tedavi bir sonraki turda hücrelere açığa önce Mitotik hücre tümüyle kaldırılmasını sağlamak çok önemlidir. Aksi halde Mitotik hücre ölüme yol ve/veya tetraploid hücreler nesilde neden.</li>
	<li>Son sallamak-off sonra bir kez 5 mL 1 x PBS de içeren hücreleri yıkayın. 330 nM nocodazole plaka içeren 8 mL orta ekleyin ve 12 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Nocodazole tedavi/sallamak-off (Adım 3.1-3,5) her 12 h tekrarlayın kadar hiçbir Mitotik hücre kuluçka sonra gözlenir. Genellikle, 4-5 tur tedavi/sallamak-kapalı tavsiye edilir. Not: burada sağlanan bilgi RPE-1 hücrelere bakın. Tedavi/sallamak-off tur sayısını farklı hücre hatları arasında değişebilir. Nocodazole uzun süreli ve gereksiz maruz önlemek için dikkatli bir şekilde, pilot bir deneyde aneuploid Bisiklete binme hücreleri verimli ve tam kaldırılması için gerekli tur sayısını belirlemek önemlidir.</li>
	<li>4-5 tur sonra nocodazole tedavi/sallamak-off (Adım 3.1-3.6), normal büyüme orta 10 mL ekleyin ve kuluçkaya. Hücreler için 12-24 h gelecekteki manipülasyon veya tahlil kullanmadan önce dinlenmek izin verir. Not: Son sallamak kapalı sonra plaka üzerinde kalan hücreleri hücre döngüsü tutuklandı ve10, son zamanlarda görüldüğü gibi karmaşık karyotypes liman var. Bu hücreler ArCK (karmaşık karyotip ile Arrested) hücreler olarak adlandırılır. Bu deneyleri ArCK nüfus üzerinde yalıtım bir hafta içinde gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, karmaşık karyotypes tutuklandı hücrelerle yüzdesi değerlendirmek için toplamak ve standart hücre sayaç kapalı her sallamak-hücreleri saymak.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> Şekil 1: genel olarak oluşturmak ve karmaşık karyotip (ArCK) ve temsilcisi görüntüleri ile aneuploid hücreleri izole etmek için kullanılan yönteminin şematik. (A) üretimi ve yalıtım Protokolü şematik ArCK hücreleri. (B) temsilcisi görüntüleri RPE-1 hTERT hücre tedavisi her aşamasında. (Kırmızı özetlenen) son paneli izole ArCK hücreleri temsil eder. Ölçek bar 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
4. ArCK nüfus karakterizasyonu
<ol><li>ArCK nüfusunun başarılı yalıtım aşağıdaki testleri gerçekleştirerek onaylayın.<ol>
<li>Eşek beta-galaktozidaz (yaşlanma marker) Boyama ticari olarak kullanılabilir kullanarak (tablo malzemeleri görmek) kit.</li>
		<li>CCL2 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını piyasada kitleri (tablo malzemeleri görmek) istihdam ederek ölçmek.</li>
		<li>Hücre döngüsü inhibitörleri p53, p21, p16 Western Blot tarafından yüksek düzeyde onaylayın. Not: düzgün bu deneyleri denetlemek için ArCK nüfusu euploid ve aneuploid Bisiklete binme hücrelere göre olmalıdır. Eski düşük geçiş, katlanarak büyüyen yaban tipi RPE-1 hTERT hücreleri. İkinci RPE-1 hTERT kromozom mis segregasyon inducing ve sonra ilk anormal mitoz hücre 72 h hasat tarafından alınabilir. Bunu yapmak için ilk nocodazole tedavi (Adım 3.1) önce adım 1.1 ve hasat hücrelerden yukarıda açıklanan Protokolü uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Karyotip tutuklandı hücre değerlendirmek için tek hücreli sıralama gerçekleştirir. Not: Tek hücreli sıralama tek hücre düzeyi13hücre nüfus arasında kromozom ve alt kromozom değişiklikleri belirlemek için köklü bir yöntemdir. Tek hücreli sıralama gerçekleştirmeye ilişkin ayrıntılı yordamlar10başka bir yerde bulunabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li>
<li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer%3A+from+yeast+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li>
<li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li>
<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li>
<li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress%2C+senescence+and+cell+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li>
<li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668(2015).</li>
<li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754(2016).</li>
<li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).</li>
<li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li>
<li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li>
<li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Oluşturmak ve karmaşık karyotypes (ArCK) ile tutuklandı hücreler için zenginleştirmek için bu roman yöntemi birden çok kromozom kazancı veya zararı var ve bölmek ateşkes hücreleri çalışma için sağlar. Yöntem kurulum hızlı ve güvenilir bir şekilde ArCK hücre izolasyon kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Bu tahlil en kritik adımda titizlikle ilaç tedavisi kronolojisi ve en önemlisi, aneuploid Bisiklete binme hücre kaldırma kontrol ediyor. En iyi sonuçlar için nocodazole tedavi ve shake-off onlar hala yuvarlak ve Mitotik, Mitotik hücre ölümü veya kayma olasılığı G1 içine önleme iken Bisiklete binme hücreleri plaka kaldırılır emin olmak için özellikle önem zamanı, potansiyel bir tetraploid nüfus oluşturma. Sallamak-off zamanlaması önerilen 12-h nocodazole kuluçka üzerinden iki saatten fazla sapma tavsiye edilmez.
Hücreleri nasıl karmaşık karyotypes daha derin bir anlayış kolaylaştırmak için potansiyel var ArCK gelecek çalışmalar hücre fizyolojisi etkiler. Özellikle, yeni yapılan bir çalışmada bağışıklık sistemi hücrelerinin ile etkileşim edebiliyoruz ve10ArCK tetikleyici bağışıklık Gümrükleme hücreleri gösterdi. Burada açıklanan yöntemi ArCK hücreleri bağışıklık izni dönüştürülmemiş hücrelere ve nasıl oncogenic dönüştürme çalışmanın temel moleküler mekanizmaları açıklama da dahil olmak üzere, daha fazla karakterizasyonu için mükemmel bir başlangıç noktası sağlar Bu gözetim mekanizması, alan14,15dakika içinde çok önemli bir soru atlamak.

Kromozom ayrımı sürecinde hataları anöploidi, haploit tamamlayıcı1,2,3,4katı değil bir kromozom sayısı ile karakterize bir durum neden. Aneuploid daha fazla genomik istikrarsızlık5,oluşturur tetikleyicisi çoğaltma stres karyotypes6,7,8,9,10, artırır karyotip karmaşıklık ve sonuçta bir subpopulation hücre10hücre döngüsü tutuklanması yol açar. Burada sunulan yöntemin amacı oluşturmak ve hücreleri Bisiklete binme böyle bir subpopulation ayrı etmektir. Ucuz doku kültürü teknikleri kullanarak, bu iletişim kuralı yalıtım ve hücre döngüsü tutuklandı karmaşık karyotypes aneuploid hücrelerle karakterizasyonu kolaylaştırır. Bu hücreler ArCK (karmaşık karyotip ile Arrested) hücreleri ve euploid Bisiklete binme karşılıkları denetimleri olarak adlandırılır.
Bu iletişim kuralı bu amaçla kurulacak Birincisi ve yalıtım için izin verir ve daha fazla dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, onların indüklenen yaşlanma ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip (SASP), onların pro-inflamatuar ArCK satırlarının çalışma özellikleri ve bağışıklık hücreleri ile girmeye yeteneklerini. Burada sunulan yöntem dönüştürülmemiş, ölümsüzleştirdi insan hücrelerinde geliştirilmiştir ancak kanser satırlarında henüz test edilmemiştir. Bazı dönüştürülmüş hücrelerin hücre döngüsü tutuklama bir veya birden çok yolları bastırılması nedeniyle duyarsız olabilir; Bu nedenle, daha fazla doğrulama diğer hücre satırlarında gerçekleştirilmesi gerekiyor.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Timidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Kimya Şirketi</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p21 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p16 antikor</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>Yaşlanma b-Galaktosidaz Boyama</td><td>Kiti Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi&nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Profiler İnsan Sitokin Dizi Kiti&nbsp;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

Üretimi ve yalıtım karmaşık karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Kromozom mis segregasyon anöploidi, hücreleri bir dengesiz kromozom sayısı liman bir koşul için yol açar. Kanıt birkaç satırlık şiddetle o anöploidi genom istikrarsızlık, sonuçta onların yayılması tutuklamak karmaşık karyotypes içeren hücreleri üreten tetikler gösterir. Yalıtım ve karmaşık karyotypes yataklık hücrelerin karakterizasyonu bir dengesiz kromozom sayısı hücre fizyolojisi üzerinde etkisini incelemek büyük önem taşımaktadır. Bugüne kadar hiçbir yöntem güvenilir bir şekilde böyle aneuploid hücreleri izole etmek için kurulmuştur. Bu kağıt standart, ucuz doku kültürü teknikleri kullanan karmaşık karyotypes ile zenginleştirme ve aneuploid hücre analizi için bir protokol sağlar. Bu iletişim kuralı aneuploid hücrelerin çeşitli özellikler ile indüklenen yaşlanma ilişkili salgı fenotip, pro-inflamatuar özellikleri ve bağışıklık hücreleri ile etkileşim yeteneği de dahil olmak üzere karmaşık karyotypes analiz etmek için kullanılabilir. Kanser hücrelerinin kez dengesizlikler kromozom sayısı içinde liman çünkü anöploidi hem yanlısı ve anti tumorigenic etkileri ortaya çıkararak nihai hedefi ile normal hücrelerde hücre fizyolojisi nasıl etkilediğini deşifre önemlidir.

Bu yöntem bir vitro doku kültürü sistemi onların yayılması tutuklamak karmaşık karyotypes ile aneuploid hücreleri izole etmek için kullanır. Bu nüfus ArCK (Arrested karmaşık Karyotypes ile) hücreler olarak adlandırılır. Şekil 1A deney düzeni gösterir. Vahşi tipi Bisiklete binme RPE-1 hTERT hücreleri timidin G1/S sınırında eşzamanlı ve kromozom mis segregasyon ikna etmek için Mps1 inhibitörü ile tedavi. İğ zehir nocodazole hücrelere 72 h kromozom mis segregasyon indüksiyon sonra eklenir. 12 saat sonra nocodazole tedavi, hala çoğalırlar edebiliyoruz aneuploid hücreleri mitoz girin ve Mikrotubul polimerizasyonu ile girişim nedeniyle bu hücre döngüsü aşamasında sıkışıp kalırlar. Bunlar tuzağa hücreleri kolayca nazik sallamak-off tarafından kaldırıldı sonra. Sallamak-off işlem tekrarlanan 3 - 5 kere hücreleri Bisiklet tümüyle kaldırılmasını sağlamaktır. Şekil 1B 1 RPE hücrelerinin temsilcisi görüntüleri tedavinin her aşamasında gösterir.
ArCK hücreler, hücre döngüsü yavaşlatıcılar, p53, p21 ve euploid ve aneuploid hücreleri, Bisiklete binme şekil 2Agösterildiği gibi kıyasla p16 gibi daha yüksek düzeyde görüntüler. Ayrıca, şekil 2B olumlu β-galaktozidaz ile karşılaştırıldığında euploid kontrol hücreleri, ArCK hücrelerdeki hücresel yaşlanma köklü bir marker boyama gösterir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> Resim 2: ArCK hücreleri kullanan temsilcisi sonuçları. (A) Western blot değerlendirilmesi hücre döngüsü inhibitörü düzeyleri euploid, aneuploid Bisiklete binme ve ArCK hücreleri. P53, p21 ve p16 düzeyde western blot analizi ile belirlenmiştir. Aktin yükleme denetimi olarak görev yaptı. (B) β-galaktozidaz yaşlanma ArCK hücrelerdeki düzeyini değerlendirmek boyama. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz (β-Gal) faaliyet euploid hücreleri ve ArCK hücreleri tespit edilmiştir. Ölçek bar 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu hücre döngüsü tutuklama aneuploid hücreleri ile karmaşık karyotypes, önemli bir özelliği tek hücreli ArCK hücreler birden çok, görüntüler şekil 3' te, rasgele kromozom kazançları ve kayıpları sıralama temsilcisi karyotip analizi tarafından gösterildiği gibidir. Bu bulgu önceki raporları10ile tam anlaşma mevcuttur.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> Şekil 3: temsilcisi tek hücreli sıralama ArCK hücrelerinin. Karyotip altı temsilcisi ArCK hücre gösterilen segmentasyon çizer. Segmentasyon araziler (vahşi RPE-1 kadın kökenli diploit hücre kültürünü türüdür) bir günlük2 ölçekte x 1 euploid başvuru göre kromozom tüm kopya sayısını gösterir. Kromozom kazançlar kırmızı, kromozom kayıp yeşil vurgulanır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Anöploidi sonunda karmaşık karyotypes içeren hücre döngüsü tutuklandı hücreleri üreten genom istikrarsızlık yol açar. Bu kağıt aneuploid hücreleri bölmek için ateşkes karmaşık karyotypes ile izole etmek için basit ve uygun bir yöntem sağlar.

Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Bu protokolün genel amacı, karmaşık karyotiplere sahip hücre döngüsü tutuklanmış hücreleri oluşturmak ve izole etmek için basit bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, bağışıklık sisteminin anöploid hücrelerle etkileşimi gibi anöploidi araştırmaları alanındaki temel sorulara cevaplar sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yalnızca karmaşık karyotipleri barındıran bir hücre popülasyonu oluşturmasıdır.RPE-1 hTERT hücrelerinin senkronizasyonuna başlamak için, taze çözülmüş hücreleri kullanın ve bunları sekiz mililitre standart büyüme ortamı kullanarak 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına dağıtın. Ardından, hücre numarasını belirlemek için bir hemositometre kullanın. Ardından, hücreleri gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, standart büyüme ortamını beş milimolar timidin içeren ortamla değiştirin. G1S sınırındaki hücreleri senkronize etmek için 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.Daha sonra, yıkanmış hücrelere standart büyüme ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin. İlk olarak, hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, 500 nanomolar Mps1 İnhibitörü reversin içeren ortamı ekleyin.37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, standart büyüme ortamı ekleyin ve plakaları inkübatöre geri koyun.İlk anormal mitozdan yaklaşık 72 saat sonra, hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, 330 nanomolar nokodazol içeren ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin.Ertesi gün, nokodazol ortamını aspire edin. Daha sonra tabağa üç mililitre PBS ekleyin ve mitotik hücreleri sallamak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun. Mitotik hücrelerin eşit şekilde çıkarılmasını sağlamak için plakayı her musluk arasında döndürün.İlk çalkalamadan sonra, plakanın kapağına ve kenarına yapışan sıvıyı aspire edin. Ardından, plakayı mikroskop altında 10X büyütmede kontrol edin. Sonra hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın.Daha sonra, 330 nanomolar nokodazol içeren ortamı ekleyin. 37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Son çalkalamadan sonra, 10 mililitre standart büyüme ortamı ekleyin.Tahlilleri gerçekleştirmeden önce hücreleri 37 santigrat derecede 12 ila 24 saat inkübe edin. Plaka üzerinde kalan hücreler, kompleks karyotip veya ArCK hücreleri ile tutuklanmış olarak adlandırılır. Bu protokol, ArCK hücrelerini izole etmek için basit bir yöntemi tanımlar ve izolasyonlarını doğrulamak için ArCK hücrelerine özgü çeşitli özellikler analiz edilir.ArCK hücreleri, immünoblot analizinde artmış hücre döngüsü inhibitörleri p53, p21 ve p16 seviyeleri gösterirken, öploid ve anöploid döngü hücreleri göstermez. Ek olarak, ArCK hücreleri, öploid kontrol hücreleri değilken mavi-yeşile boyanan yaşlanma ile ilişkili beta-Galaktosidaz için pozitiftir. Segmentasyon grafikleri, ArCK hücrelerinin çoklu, rastgele kromozom kazanımları ve kromozom kayıpları ile karakterize edilen anöploid olduğunu ortaya koymaktadır.Segmentasyon grafikleri, bir euploid referans log iki ölçeğine göre, kromozom birden X'e kadar tek hücrelerin kopya sayısını gösterir. Bu prosedürü denerken, her sallama sırasında tüm mitotik hücreleri çıkardığınızdan emin olmak önemlidir. Bu işlem yapıldıktan sonra sitokin tahlilleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.Bu tahliller, ArCK hücrelerinin bağışıklık sistemi hücreleri ile etkileşime girme yeteneği gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Nokodazolün tehlikeli olduğunu unutmayın. Bu reaktifi kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik ArCK hücrelerini in vitro olarak verimli bir şekilde izole etmek için kullanılabilir. Bu prosedür uygun şekilde yapılırsa yedi gün içinde yapılabilir.

generation-isolation-cell-cycle-arrested-cells-with-complex

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Karyotipleme genetik değişiklikler tespit etmek için yaygın olarak kullanılan basit ve kullanışlı bir bir tekniktir. Burada bakımı, kültür bu hücrelerin kromozom durum izleme için insan embriyonik kök hücrelerin kromozom yayılmış hazırlık için adım protokol tarafından bir adım açıklanmaktadır.

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

, Hücrelerden oluşan bir nüfus hücre döngüsü konumunun belirlenmesi, ya da sinyalleri çoğalması nasıl etkilediğini anlamak, bu protokolü kullanarak flow sitometri ile kolayca ölçülebilir. Biz hücreleri boyama ve hücre döngüsü konumlarını miktarının belirlenmesi için basit bir deneysel yaklaşım raporu.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Hücre döngüsü aşamaları ilerleme ve kinetikleri izleme ince değişiklikler Propidium iyodid ile BrdU ve toplam genomik DNA boyama yöntemi ile, nükleik asit metabolik etiketlenmesi bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, dolayısıyla da hücre siklus progresyonu etkileyen non-spesifik DNA hasarına, geliştirilmesinin önlenmesi, bisiklet hücrelerin kimyasal senkronizasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir.

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Hücre döngüsünün belirli evreleriyle ilgili olayları incelemek için bir bağlam sağlayan iki hücre senkronizasyon protokolünü bildiriyoruz. Bu yaklaşımın, pertürbüssüz bir hücre döngüsünde spesifik genlerin düzenlenişini analiz etmek için veya hücre döngüsünü etkileyen maddelere maruz kaldığında yararlı olduğunu göstermektedir.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

Bu iletişim kuralı birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için santrifüj elutriation açıklar.

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Bu iletişim kuralı etiket ve canlı kromozomlar Mitotik hücre Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiket ve bir iplik kaset confocal mikroskobu sistemi kullanarak görselleştirmek için basit ve uygun bir yöntem açıklanır.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Memeli hücre HeLa hücreleri kullanarak döngüsü sırasında eğitim RNA-interactors için çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek ve deneysel yaklaşımlar mevcut. Formaldehit crosslink RNA-PKR kompleksleri ve immunoprecipitation PKR bağımlı RNA'ların zenginleştirmek için bu yöntemi kullanır. Bu RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama veya qRT-PCR ile çözümlenebilir.

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Keşfedin hücre döngüsü tutuklanmış kompleks karyotipli anöploid hücrelerin üretim ve yalıtım yöntemini. Bu teknik, RPE-1 hTERT hücreleri kullanarak immün sistem etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir protokol sunar.

Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Daha fazla video keşfet