Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Bu deneyin genel amacı, DNA'yı ilişkili proteinlere kovalent olarak çapraz bağlayarak ve ardından serbest DNA'nın saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi yoluyla bir genetik lokusun kromatin erişilebilirliğini belirlemektir. Bu yöntem, tedavi edilmemiş hücrelerde ve ayrıca kromatin yeniden şekillenmesi geçiren hücrelerde hücre tipine bakılmaksızın DNA erişilebilirliği belirlenebildiğinden, kromatin alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, her deney ortamı için titre edilmesi gereken DNA'yı veya antikorları parçalamak için enzimlerin kullanılmasını gerektirmemesidir.

Bu protokol, Sonikatör dışında herhangi bir özel ekipman gerektirmemesi gibi ek bir avantaja sahiptir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora öğrencileri olan Olesja Ritter ve Tabea Riedlinger olacak. Protokole başlamak için, hacimce %1'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için bir gün önce tohumlanan hücrelerin büyüme ortamına doğrudan formaldehit ekleyin.

Ortamı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve plakaları her iki dakikada bir manuel olarak çevirin. Daha sonra, formaldehiti söndürmek için 0.125 molar nihai konsantrasyona glisin ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin ve her iki dakikada bir öldürün.

Ortamı aspire edin ve ardından hücreleri yıkamak için tabağın yan tarafına dikkatlice buz gibi soğuk PBS ekleyin. Ortamı aspire edin ve yıkamayı iki kez dikkatlice tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri bir mililitre buz gibi soğuk PBS'de tekrar süspanse edin ve gerekirse hücreleri ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Bunları buz üzerinde 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Hücreleri soğutulmuş bir masa üstü santrifüjde 300 g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın.

Birkaç kez dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini bir mililitre FAIRE lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, çapraz bağlı DNA'yı ortalama 200 ila 300 baz çifti boyutuna paylaşmak için sonikasyon yapın ve numunenin ısınmasını önlemek için sonikasyon sırasında numuneleri soğutun.

DNA'nın parçalanması bu deney için kritik öneme sahiptir, çünkü parçaların boyutu tüm tekniğin çözeltisinin hassasiyetini etkiler, bu nedenle sonikasyon koşullarını önceden dikkatlice belirlemek ve her bir deneyde kromatin parçalarının boyutunu kontrol etmek önemlidir. Numuneyi dört santigrat derecede 15 dakika ve 13.000 g santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın.

Numuneleri 100 mikrolitrelik alikotlara bölün. Çapraz bağı tersine çevirmek ve toplam DNA için referans olarak kullanmak için 100 mikrolitrelik bir alikot kullanın. 10 mikrolitre RNase A ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Daha sonra, 10 mikrolitre proteinaz K ekleyin. Proteinleri parçalamak ve çapraz bağları tersine çevirmek için numuneyi 37 santigrat derecede dört saat ve ardından 65 santigrat derecede altı saat inkübe etmek için programlanabilir bir termoblok kullanın. Yeni, 100 mikrolitrelik bir alikot elde edin, 10 mikrolitre RNase A ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, çapraz bağlanmamış numune ve önceki bölümden çapraz bağlı olmayan numune ile paralel olarak devam edin.

300 mikrolitrelik son hacme ulaşmak için H2O ekleyin. Ardından, bir davlumbaza 300 mikrolitre fenol kloroform izoamil alkol ekleyin ve kuvvetlice girdap yapın. Numuneleri 13.000g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra, üst sulu fazın 280 mikrolitresini dikkatlice yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Protein de içeren ara fazdan herhangi bir kalıntı almadığınızdan emin olun ve kalan alt fazı organik çözücü atığı olarak atın. İşlemi tekrarlayın ve üst sulu fazın 270 mikrolitresini dikkatlice yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın.

Bir davlumbaza 270 mikrolitre kloroform ekleyin ve kuvvetlice girdaplayın. Numuneyi santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, üst sulu fazın 250 mikrolitresini dikkatlice yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın ve interfazdan herhangi bir kalıntı taşımamaya dikkat edin.

Kalan numuneyi organik çözücü atığı olarak atın. Daha sonra, 25 mikrolitre beş molar sodyum klorür, 250 mikrolitre izopropanol ekleyin ve DNA taşıyıcısı olarak beş mikrolitre glikojen ekleyin. Tüpleri ters çevirin ve oda sıcaklığında inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, DNA'yı çökeltmek için numuneyi santrifüjleyin. Daha sonra, DNA peletini hacimce %70 hacimce 400 mikrolitre etanol ile yıkayın ve numuneyi santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve peletin oda sıcaklığında 10 dakika kurumasını bekleyin.

Pelet kuruduktan sonra, 100 mikrolitre TE tamponunda tekrar süspanse edin. DNA'lar arası çapraz bağları çıkarmak için çapraz bağlanmamış serbest DNA örneğini 65 santigrat derecede dört saat inkübe edin. Son olarak, bir spektrofotometre kullanarak DNA miktarını ölçün ve ağırlıkça %2'lik bir agaroz jel üzerindeki parça boyutunu kontrol etmek için küçük bir alikot çalıştırın.

HeLA hücreleri bir saat boyunca TNF ile uyarıldı ve FAIRE ile analiz edildi. Serbest ve toplam DNA arasındaki oran, beta-aktin ve pozitif kontrolü kodlayan gen, Kromozom 12 üzerinde bir heterokromatin bölgesi, negatif kontrol ve IL8-Promotör olan ACTB'nin promotörü için belirlendi. Farklı sonikasyon sürelerine sahip bir etidyum bromür lekeli jel üretildi ve 20 dakikalık sonikasyondan sonra 200 ila 300 baz çiftinin optimal kromatin boyutunun elde edildiğini gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, kromatin erişilebilirliğini genom çapında bir düzeyde belirlemek için derin dizileme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Formaldehit ve fenol kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve çeker ocakta çalışmak, eldiven giymek ve atıkların uygun şekilde bertaraf edilmesi gibi önlemlerin bu prosedür uygulanarak sağlanması gerektiğini unutmayın.