Name: Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Öğrenin, desthiobiotin-streptavidin arıtma yöntemiyle mezotelyoma hücrelerindeki RNA bağlayıcı proteinleri nasıl yakalayacağınızı. Bu teknik, RNA biyolojisi ve protein etkileşimleri araştırmalarında güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung ve Zürih Krebsliga tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması sitozolik ve nükleer Protein fraksiyonu
<ol><li>Plaka 4 x 106 ACC-MESO-4 hücreleri RPMI - 1640 orta yetiştirilen bir T150 hücre kültür şişeye %10 FBS, 1 x penisilin/streptomisin (100 x) ve 2 mM L-glutamin (200 mM) ile desteklenmiştir. Hücrelerin % 80-90 (~5-5.5 x 106 hücreler) bir izdiham ulaştığınızda, nükleer ve sitozolik kesir protein çıkarılması ile devam edin. Not: ACC-MESO-4 hücre kültürünü RIKEN BioResource Merkezi11' den elde edildi.</li>
	<li>Orta Aspire edin, hücreleri 15 mL 1 x PBS ekleyerek yıkama, plaka birkaç kez hafifçe eğimli ve 1 x PBS Aspire edin. 3 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA ve kültür şişesi 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Not: dekolmanı için mikroskop altında hücreleri bakın; Eğer hala dokunun bağlı 3 avucunun karşı şişeye kez.</li>
	<li>%10 FBS, 1 x penisilin/streptomisin (100 x) ve 2 mM L-glutamin (200 mM) ile RPMI-1640 Orta 7 mL ekleyin, bir 15 mL tüp hücrelerde toplamak ve spin aşağı 200 x g 5 min için de.</li>
	<li>Orta Aspire edin ve hücre Pelet 1,5 mL 1 x PBS ile resuspend sonra hücreleri 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Spin aşağı vasıl 500 x g ve 4 ° C 5 dk. atma süpernatant. Not: Bu adım ileriye doğru 4 ° C'de tüm Santrifüjü adımlarını gerçekleştirin ve buz üzerinde tüm reaktifler tutmak.</li>
	<li>Hücre Pelet buz gibi 1.5 mL 1 x PBS ile resuspend ve 500 x g ve 4 ° C'de 3 dakika süreyle hücreleri aşağı spin süpernatant atın. Not: Ben, CER II ve NER Kimyasalları 10, 0,55 ve 5 cilt cilt, sırasıyla Paketli tahmini hücre Pelet CER gerekli miktarda vardır; Aşağıdaki protokol 20 µL hacmi varsayar. Biz sadece reaktif CER gerekli miktarda hazırlanması tavsiye ben.</li>
	<li>Buz gibi sitoplazmik ayıklama reaktif 200 µL ekleyin (CER ben) 1 x İndinavir inhibitörü, örneğin, 2 µL ile takıma proteaz inhibitörü (EDTA içermeyen) 1 tablet 500 µL 100 x hisse senedi almak için su içinde seyreltik. Bu miktar reaktif CER ben da birim Paketli bir hücre Pelet 20 µL koşullar için yeterlidir.<ol>
<li>Hücre Paketli Pelet birim tahmin etmek için 1 x PBS 10, 20, 50 veya 100 µL ile dolu 1.5 mL tüp ile hücre Pelet içeren tüp karşılaştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre pelet tarafından şiddetle vortexing 15 için tüp resuspend s ve buz için 10 dk. 11 eklemek µL buz gibi sitoplazmik ayıklama reaktif II (CER II) tüp, 5 için şiddetle girdap tüp kuluçkaya s ve 1dk buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Şiddetle için 5 s ve santrifüj tüpü 16.000 g x, girdap ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle Transfer süpernatant temiz önceden soğutulmuş tüp buz üzerinde. Daha fazla sitoplazmik kesir süpernatant olduğunu RNA-açılan deneyde kullanılan.</li>
	<li>1 µL İndinavir inhibitörü (100 x) ve şiddetle 15 için girdap ile takıma kalan Pelet 100 µL buz gibi nükleer ayıklama reaktif (NER) içinde resuspend s. Proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş NER reaktif yalnızca gerekli miktarda hazırlanması tavsiye ediyoruz.</li>
	<li>Örnek zaman zaman vortexing 15 ile 40 dakika buz üzerinde kuluçkaya s (her 10 min).</li>
	<li>Tüp 16. 000 x g 10 dk. Transfer için de (bu nükleer protein fraksiyonu) süpernatant temiz bir önceden soğutulmuş tüp santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hemen bicinchoninic (BCA) yöntemini kullanarak protein konsantrasyonu ölçerek devam ( Tablo malzemelerigörmek). Her kesir protein saflık için denetlemek için α-tübülin (sitozolik kesir pozitif algılamasını sadece) ve poli ADP-riboz polimeraz - PARP (nükleer kesir pozitif algılamasını sadece) karşı immunoblotting (şekil 1) gerçekleştirin. Protein görselleştirme için 4 bölümüne bakın.</li>
	<li>Protein etkinlik ve yerel durumlarına tutmak için aliquots sitozolik ve nükleer özler 25 µL hazırlayın. Ek-bu aliquots donma 5 s ve-80 ° C'de doğrudan mağaza için sıvı azot yerleştirerek</li>
</ol>2. RNA Desthiobiotin ile etiketleme
<ol><li>Ticari olarak sentezlenmiş RNA probları ve saf HPLC hakkına sahiptir. Nükleaz ücretsiz su 10 µM ile resuspend. Not: Sonda dizileri Tablo 1' de listelenmiştir.</li>
	<li>RNA, RNA-açılan tepki başına 50 pmol kullanın. Çözülme ve tüm reaktifler için % 30, etiket 3' terminus için RNA oligo, kullanılan PEG dışında buz üzerinde tutun.</li>
	<li>CALB2 3' UTR (vardır) etiketli 10 µM RNA probları 5 µL transfer, CALB2 3' UTR (mtARE) ve ilgisiz-RNA (IRE), 0,5 mL ince duvar microcentrifuge içine borular ve PCR makinesi 85 ° C'de 5 dk. yerleştirmek için tüpler hemen buz üzerinde kuluçkaya. Not: gevşeme ve etiketleme için RNA sonda erişilebilirliğini teşvik gibi bu adım önemlidir.</li>
	<li>Bir tek 30 µL tepki için aşağıdaki 10 µL karıştırmak için RNA içeren tüp ekleyin: nükleaz boş su 3 µL, 10 RNA ligaz tepki arabellek, RNase inhibitörü 1 µL x 3 µL (40 U/µL), Desthiobiotinylated sitidin Bisphosphate (1 mM) 1 µL ve T4 RNA ligaz (20 U/µL) 2 µL. Not: Ana mix A aşırı (3.2) 3 örnekleri hazırlamak için 9.6 µL nükleaz, ücretsiz su, 10 RNA ligaz tepki arabellek, RNase inhibitörü 3.2 µL x 9,6 µL mix (40 U/µL), 3.2 µL Desthiobiotinylated sitidin Bisphosphate (1 mM) ve T4 RNA ligaz (20 U/µL) 6.4 µL.</li>
	<li>Dikkatle 15 µL PEG tepki için % 30 ekleyin. Başka bir ipucu tepki karıştırmak için kullanın. Gecede 16 ° C'de tepki kuluçkaya</li>
	<li>Ertesi gün, aşağıdaki hazırlamak: 5 M NaCl (taze/nükleaz-free), kloroform: 24:1 oranında (örneğin, tepki - 96 µL kloroform ve izoamil alkol 4 µL başına), izoamil alkol buz gibi % 100 etanol ve buz gibi % 70 etanol.</li>
	<li>Nükleaz ücretsiz su 70 µL RNA etiketleme tepki tüpler için ekleyin. Kloroform 100 µL ekleyin: izoamil alkol ve girdap kısaca. Spin aşağı de 13.000 x g 3 dk. dikkatli bir şekilde çıkarın için yalnızca üst aşaması ve aktarımı için yeni bir 1,5 mL nükleaz ücretsiz tüp; daha düşük faz dokunmaktan kaçının.</li>
	<li>5 M NaCl, glikojen 1 µL ve buz gibi % 100 etanol 300 µL 10 µL ekleyin. -20 ° c 2 h için tüpü yerleştirin. Not: Bu adımda, ertesi gün deneme devam edilebilir.</li>
	<li>13.000 g x ve 4 ° C de 15 dakika süreyle santrifüj dikkatli atmak süpernatant Pelet bozmadan. Buz gibi % 70 etanol ve santrifüj 13.000 x g ve 4 ° C tekrar 5 min için 300 µL ekleyin.</li>
	<li>Tamamen süpernatant atın ve Pelet (15 dk) kuruması. Pelet nükleaz ücretsiz su 20 µL içinde resuspend. Not: Aynı gün RNA-açılan ile devam edin.</li>
	<li>2 dk 90 ° C'de RNA kuluçkaya ve Buza koyun. Etiketli RNA streptavidin manyetik boncuklar ön yıkama aşağıdaki adımı sırasında Buza koyun. Not: Daha uzun bir kuluçka süresi RNA sonda zarar verebilir.</li>
</ol>3. RNA-Protein açılan
<ol><li>
Streptavidin manyetik boncuklar ve kuluçka desthiobiotin-RNA ile ön yıkama
	<ol>
<li>Streptavidin manyetik boncuklar 50 pmol RNA başına 50 µL kullanın. Ancak, bu deney bağlı olarak optimize edilmelidir.</li>
		<li>Girdap 15 s ve hızlı bir şekilde temiz 1.5 mL kullanarak güvenli kilit tüp içine Kaldır 200 µL (ana mix; 3 + 1 reaksiyonlar için yeterli) için streptavidin manyetik boncuklar ile tüp pipet ipuçları kesmek. Tüp manyetik bir stand üzerine boncuk tüp tarafında toplamak ve 1 dk. Kaldır resuspension sıvı bekleyin yerleştirin.</li>
		<li>Boncuk yıkamak için manyetik standından tüpü çıkarması, 0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl çözüm ve hafifçe yukarı ve aşağı birkaç kez damlalıklı 400 µL ekleyin. Tüp manyetik sandalyesine koyun. 1 dk bekleyin ve süpernatant toplamak. Yine bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Boncuk 200 µL 100 mm NaCl ile yıkayın. Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>200 µL 20 mm Tris (pH 7.5), boncuk pipetting tarafından resuspend, tüp manyetik kürsüye getirin, için 1 dakika bekleyin ve süpernatant kaldırmak ekleyin. Adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Manyetik standından tüpü çıkarması, RNA yakalama arabelleğinin x 1 200 µL eklemek ve streptavidin manyetik boncuklar kısaca vortexing tarafından resuspend. Streptavidin manyetik boncuklar 50 µL kaldırın ve her etiketli-RNA tüp kesme pipet ucu kullanarak ekleyin. Tüpler, oda sıcaklığında bir rulo üzerinde 30 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bağlayıcı protein RNA
	<ol>
<li>Tüpler manyetik bir stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant kaldırın.</li>
		<li>20 mm Tris (pH 7.5) 50 µL için boncuk ekleyin ve pipetting tarafından resuspend. Tüpler manyetik bir stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant kaldırın. Bu adımı yineleyin.</li>
		<li>1 Protein-RNA bağlama arabellek x 100 µL için boncuk ekleyin ve pipetting tarafından resuspend.</li>
		<li>Bu arada, aşağıdaki karışımı hazırlayın: 10 x Protein-RNA bağlama arabellek, % 50 gliserol 30 µL, 50 µg sitoplazmik proteinlerin ve nükleaz ücretsiz 10 µL su 100 µL. Not: Ana mix B aşırı (3,3) 3 örnekleri aşağıdaki gibi hazırlamak: 10 Protein-RNA bağlama arabellek x 33 µL, 99 µL % 50 gliserol, sitoplazmik protein ve nükleaz ücretsiz su kadar 330 µL. 165 µg tutmak ana mix B buz üzerinde tüp.</li>
		<li>Tüpler manyetik stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant toplamak. Ana Mix B 100 µL eklemek, yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Reaksiyon tüpler bir rulo üzerinde 4 ° C'de 60 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çamaşır ve elüsyon
	<ol>
<li>Tüpler manyetik bir stand içine yerleştirin, (bu akışı - FT) süpernatant toplamak ve yeni bir tüp içine aktarın. Not: Bu FT daha sonraki analizler için buz üzerinde tutun.</li>
		<li>1 yıkama arabellek boncukları üzerinde x 100 µL pipet, hafifçe resuspend, manyetik stand içine koy, 1 dk bekleyin ve süpernatant atmak. Bu 2 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix ve 30 dk bir tüp shaker (950 devir/dakika) olarak 37 ° C'de kuluçkaya elüsyon arabelleği 40 µL manyetik boncuklar ekleyin.</li>
		<li>Tüpler manyetik bir stand içine yerleştirin, 1 dk bekleyin ve (Bu eluate - E) eluted örnek toplamak. Buz üzerinde ve aşağı akım analizi için kullanın. Not: Bu adımda, her test RNA sonda bir akışı aracılığıyla (FT) ve eluate (E) örnek oluşur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. polyacrylamide Elektroforez ve Western Blot analizi
Not: Bu bölümde kullanılan arabellekleri için yemek tarifleri için Tablo 2 bakın. Gerçekleştirmek bir Western blot Laemmli yöntemi12göre.
<ol><li>Handcast % 12 SDS-sayfa jelleri (10-wells, 1.5 mm rondela, 66 µL). Çalışan bir jel karışım hazırlamak: 4 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide stok çözeltisi, alt Tris 2.4 mL tampon, dH2O, TEMED, 96 µL % 10 amonyum persülfat çözüm (APS) 9.6 µL 3.2 mL. Yığın jel karışımı hazırlayın: 3.25 mL dH2O, % 30 Akrilamid - bisacrylamide hisse senedi çözüm, üst Tris arabelleği 1.3 mL 0.5 mL, TEMED, 20 µL % 10 10 µL APS.</li>
	<li>6 x Laemmli arabelleği 16.6 µL ekleyin (örneğin, 14 mL (üst Tris arabellek) Tris/HCl/SDS pH 6.8, SDS, DTT, 6 mL gliserol ve %0.012 bromophenol mavi; 1.86 g, 2 g-20 ° C'de depolanan) FT örnek ve 6 x Laemmli arabellek içine E örnek 6.6 µL içine. Örnekleri 95 ° C'de 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>(20 µL FT ve bütün Elute ~ 40 µL) örnekleri yüklemek ve 30 dk 60 V, gecede 20 V ile devam için çalıştırabilirsiniz.</li>
	<li>Yarı kuru electroblotting sistemiyle, proteinler için 80 dk 15 V PVDF membran üzerine aktarın. Not: PVDF membran protein transferi yapmadan önce etkinleştirilmesi gerekir. % 100 metanol için 1 dakika, 2 dk kuluçka ultrasaf su ardından membran kuluçkaya.</li>
	<li>Protein transferden sonra SDS-sayfa jel ile Coomassie çözüm, her 30 dk ultrasaf su ile yıkama üç numaralı adımları takip 3 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Protein aktarımı sonunda 4.5 adımda gösterildiği gibi membran 1 h. yeniden etkinleştirmek için Kuru PVDF membran izin. Membran 1 x TTBS %5 BSA ile 1 h blok.</li>
	<li>Membran ile ilk antikor kuluçkaya: HuR veya mesothelin, her ikisi de seyreltilmiş 1: 1000 1 x TTBS 4 h oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de % 5 BSA içinde</li>
	<li>7 dk. için üç kez membran 1 x TTBS yıkama ve tavşan Anti-fare horseradish peroksidaz (HRP) kuluçkaya-konjüge ikincil antikor seyreltilmiş %5 BSA, 1 x TTBS 1:10,000.</li>
	<li>Proteinler gelişmiş Kemiluminesan ve dijital görüntüleyici kullanarak görselleştirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%27+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
<li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress%3A+a+matter+of+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li>
<li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AREsite2%3A+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU%2FGU%2FU-rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li>
<li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+Uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013).</li>
<li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis%2Ftransport+of+nuclear+ferritin+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li>
<li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5%27+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li>
<li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22201738">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li>
<li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+regulatory+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li>
<li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Kodlamayan genom3' e 3' UTRs ait ve onların işlev7uygulamak için tüm kodlamayan RNA'ların proteinler ile etkileşim kurabilir. Ne zaman memeli genom pervasively transkripsiyonu için kurmak ve uzun kodlamayan RNA'ların16önemli bir kısmını üretilen, delillerin ortaya çıkan bu uzun kodlamayan RNA'ların ile etkileşimde bulunan gen ifadesinin düzenlenmesine çalışması gösterdi kompleksleri17Kromatin remodeling. Bu bilgi RNA-açılan ta...

Gen ekspresyonu ve gen ürünü son seviyesi sıkıca mRNA kararlılığı ve mRNA çeviri hızı1etkileyen tarafından düzenlenmiş. Çoğu yasal mekanizmaların kodlamayan RNA ve/veya RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) etkileşimleri ile hedeflenen mRNA aracılığıyla sarf. Bu genellikle 3' Çevrilmeyen mRNA (3' UTR - genom2kodlamayan bölümüne ait) belirli CISiçeren bölgedir- transtarafından tanınan düzenleyici elemanlarının (CRE),-miRNA ya da RBPs gibi faktörler rol 3. en çok çalışılmış CIS-içinde 3' UTR, öğedir belirli AU bağlanıcı proteinler (AUBP) tarafından ve sırayla tanınır, adenin-zengini eleman (vardır) motifi neden olmaktadır ya mRNA bozulması/deadenylation (ARE-aracılı decay) veya mRNA sabitleme4.
Boyutu olduğunu 3' UTR'nin calretinin, mRNA (CALB2) 573 bp uzun ve AREsite2, bir bioinformatic araç5tarafından tahmin ettiği gibi sözde AUUUA pentamer içerir. Bir sözde olan motif varlığı ile tutarlı, pmirGLO vektör-muhabir tahlil bir istikrar rol CALB2 mRNA6içinde bu öğesinin gösterdi. Son olarak, vitro RNA-açılan calretinin stabilize AUBP tanımlamak için kullanılan olan motif aracılığıyla mRNA.
Tüm kodlamayan RNA'ların proteinler7ile etkileşim, vitro RNA-açılan bir iyi yolu ve RNA-interactors tanımlamak için seçim ilk tahlil moleküler mekanizmaları çözmekte yardımcı olmak için çünkü. Bu RNA-açılan yönteminde biotin (desthiobiotin) 3' terminus RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formla etiketli, ticari olarak sentezlenmiş RNA probları kullanılmıştır. RNA-desthiobiotin ile özellikle ilgi bağlı-RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Böyle RNA bağlı proteinler manyetik boncuklar, % 12'si SDS-sayfa jel çalıştırmak, bir membran transfer ve farklı antikorlar ile probed üzerinden eluted.
Standart streptavidin-biotin benzeşme arıtma yordam, sert denatürasyon koşulları ilişkili proteinler8, elute için güçlü geri dönüşü olmayan biotin streptavidin bağ bozmak için gerekli olan ayrılma neden olabilir protein kompleksleri. Biotin, aksine desthiobiotin ters streptavidin için bağlar ve rekabetçi biotin için protein elüsyon nazik bırakılınca koşar ve doğal olarak biotinylated molekülleri9yalıtım kaçınarak, tamponlu bir çözüm ile yerlerinden olduğunu, Teknik yerli protein kompleksleri yerel koşullar altında yalıtmak için ideal olduğunu düşündüren.
Tuz konsantrasyonu, azalan bakiyeli ajanlar ve deterjan yüzde tarafından belirlenir, vitro bağlayıcı koşulları ve sıkılık, yakın bu hücresel bağlamda mevcut gerçek vivo içinde etkileşimleri tanımlamak için olması gerekir. Burada uygulanan bağlama koşulları daha önce bir AU-bağlayıcı protein10Hur kimliği için uygun olarak gösterilmiştir. Uygun ciltleme koşullardan en iyi duruma getirme zaman alıcı ve zor olabilir bu yana bu yaklaşım zaman kazanmak. Buna ek olarak, bu yöntem bir başlangıç iletişim kuralı olarak herhangi bir RNA-açılan deneme için kullanılan ve yavaş yavaş tuzları ve deterjanlar konsantrasyon değiştirme gliserol yüzdesini değiştirerek ve diğer tuzları ekleyerek optimize edilebilir. Ayrıca, biz bile bir kısa 25-nükleotit RNA-bir pentamer yataklık sonda vardır-motif belirli bir AUBP ile etkileşim göstermek için kullanılabileceğini gösterdi.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Nükleer ve sitoplazmik ekstraksiyon kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Proteaz İnhibitör Tabletleri, EDTA içermeyen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Manyetik RNA-protein Pull-Down Kiti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Manyetik boncuklar içerir ve bu nedenle kitin 4 ° C'de saklanması gerekir; C</td></tr><tr><td>Pierce RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>Kit, "Pierce Manyetik RNA-protein Pull-Down Kit"in bir parçasıdır ve -20 °C'de saklanması gerekir; C, aşağı çekme kitinden farklı olarak (4 > C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&nbsp; manyetik stand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anti - HuR (MOUSE) monoklonal antikoru</td><td>Thermo Fisher</td> <td>Scientific-Antikor</td><td>, Pierce Manyetik RNA-protein Pull-Down Kitine dahildir&nbsp; - 1:1000 in %5 BSA 1x TTBS - tavşan anti-fare ikincil antikoru 1:10.000 in %5 BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &alpha; - tübülin (MOUSE) monoklonal antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 in %5 BSA 1x TTBS - tavşan anti-fare ikincil antikoru 1:10.000 in %5 BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (TAVŞAN) Poliklonal antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9542</td><td>1:1000 in %5 BSA 1x TTBS - keçi anti-tavşan ikincil antikoru 1:10.000 in %5 BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mezotelin (MOUSE) Monoklonal Antikor&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>İkincil keçi anti-tavşan antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>İkincil tavşan anti-fare antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Filtrelenmiş Sığır Serumu</td><td>Pan Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin - streptomisin (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin çözeltisi (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>%0,25 Tripsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life teknolojileri&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Hücreli</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Sistem Cam Plakalar&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 1,5 mm entegre ara parçalı Ara Plakalar</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tarak, 10 kuyulu, 1,5 mm, 66 & L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Hücre Döküm Modülleri</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dekontaminasyon</td><td>Çözeltisi Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese jel 30 - 37.5:1 oranında sulu %30 akrilamid ve bisakrilamid stok çözeltisi</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>%20 SDS&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF transfer membranı&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Saf metanolde 1 dakika inkübe edildikten sonra 2 dakika suda yıkanarak aktive edilmesi gerekir;</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD yarı kuru transfer hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Batı ECL Substrat</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp; Dijital Görüntüleyici</td><td>Vilber-RNA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>oligo sentezi</td><td>Mycrosynth AG,</td> <td>İsviçre-sentez</td> <td>ölçeği - 0.04 & mol - HPLC saflaştırılmış</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Saf 1 M Tris, pH 7.5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>-20 ° C'de saklanacak %50 steril alikotlar; C</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin manyetik boncuklar ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Lütfen bu manyetik boncukların ortalama çapının 1 & mikro olduğunu unutmayın; m (0,5 - 1,5 & mikro aralığında; Ayrıca, homojen boyutu 2.8 ve mikro olan Dynabeads-M280 Streptavidin; m, RNA pulldown'da da kullanılır, ancak bunun saflaştırma sürecini etkileyebileceğini unutmayın.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyumsülfat-(14-18)-hidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>orto-fosforik asit&nbsp;</td><td>Uygulama</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki rna etkileşim proteinlerin aracılı

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Vitro RNA-açılan özel RNA yapıları ve motifleri tanımak RNA bağlanıcı proteinler belirlenmesi amaçlı iletişim kurallarının ilk adımda hala büyük ölçüde kullanılır. Bu RNA-açılan iletişim kuralında, biotin, desthiobiotin, 3' terminus streptavidin için geri döndürülebilir olarak bağlar ve böylece daha fazla altında proteinlerin elüsyon sağlayan RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formu ile ticari olarak sentezlenmiş RNA probları etiketlenir fizyolojik koşullar. RNA-desthiobiotin ile özellikle faiz RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Burada anlatılan yöntem bilinen RNA proteinler ve bir faiz dizisini içeren 25-nükleotit (nt) uzun RNA prob arasındaki etkileşimi algılamaya uygulanır. Bu sabitleme veya öğeleri RNA molekülleri bir muhabir vektör tahlil kullanılarak elde mevcut istikrarsızlaştırıcı fonksiyonel karakterizasyonu tamamlamak yararlıdır.

Bu deneyde, calretinin 3' UTR barındıran ARE motifi (CALB2 3' UTR (vardır) 25-nt) 25-nt uzun parçası özellikle insan-antijen R (HuR) protein için bilinen bir mRNA sabitleyici bağlar olup olmadığını test etmek için kullanılmıştır. ARE öğesi, bir 25-nt RNA özgüllük test etmek için daha önce olan motif sabitleme etkisini ortadan kaldırmak için gösterildi, ARE-motif mutasyon içeren CALB2 3' UTR (mtARE) kullanılan6yoklamaydı. Üçüncü RNA sonda 28 nt olan negatif kontrol ...

Desthiobiotin bir adenin-zengini eleman (vardır) motifi içeren bir sentetik 25-nükleotit RNA oligo, etiketleme sitozolik vardır-bağlayıcı proteinin belirli bağlantı verir.

Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Bu prosedürün genel amacı, mezotelyoma hücrelerinde RNA molekülünde bulunan belirli bir diziye bağlanan sitozolik proteini yakalamaktır. Bu yöntem, RNA biyolojisi alanında, tahmin edilen bir RNA bağlayıcı proteinin bir transkriptte adenozin veya üridin açısından zengin diziye bağlanıp bağlanamayacağı gibi anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, raportör tahlili ile değerlendirilen stabilize edici veya destabilize edici elementlerin fonksiyonel karakterizasyonunu tamamlamasıdır.Bu tekniği gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Jelena Kresoja-Rakic olacak. Protokole başlamak için,% 80 ila 90 birleşme ile önceden hazırlanmış ACC-MESO-4 hücrelerini edinin. Ortamı aspire edin, hücreleri 15 mililitre 1X fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin.Daha sonra, üç mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve kültür şişesini üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Yedi mililitre takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı ekleyin, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve beş dakika boyunca 200 kez g'de döndürün. Daha sonra, ortamı aspire edin ve hücre peletini 1.5 mililitre 1X PBS ile yeniden süspanse edin.Daha sonra hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri beş dakika boyunca 500 kez g ve dört santigrat derecede tekrar döndürün. Döndürmeden sonra, süpernatanı atın, hücre peletini 1.5 mililitre buz gibi soğuk 1X PBS ile yeniden süspanse edin ve hücreleri üç dakika boyunca 500 kez g ve dört santigrat derecede döndürün.Süpernatanı atın ve hücre peletini içeren tüpü 10, 20, 50 ve 100 mikrolitre 1X PBS ile 1.5 mililitrelik bir tüp ile karşılaştırarak hücre peletiyle paketlenmiş hacmi tahmin edin. İki mikrolitre 1X proteinaz inhibitörü ile desteklenmiş 200 mikrolitre buz gibi sitoplazmik ekstraksiyon reaktifi veya CER I ekleyin. Peleti 15 saniye kuvvetlice girdap haline getirin ve tüpü buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.11 mikrolitre buz gibi sitoplazmik ekstraksiyon reaktifi II veya CER II ekleyin, beş saniye boyunca kuvvetli bir şekilde girdap yapın ve tüpü buz üzerinde bir dakika inkübe edin. Numuneyi beş saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve tüpü beş dakika boyunca 16.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı buz üzerindeki temiz, önceden soğutulmuş tüpe aktarın.Kalan peleti, bir mikrolitre proteinaz inhibitörü ile desteklenmiş 100 mikrolitre buz gibi soğuk nükleer ekstraksiyon reaktifi veya NER içinde yeniden süspanse edin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Numuneyi buz üzerinde 40 dakika inkübe edin ve her 10 dakikada bir 15 saniye boyunca girdap yapın. Tüpü 10 dakika boyunca 16.000 kez g'de santrifüjleyin.Nükleer protein fraksiyonu olan süpernatanı temiz, önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın. Biskinkoninik yöntemi kullanarak protein konsantrasyonunu hemen ölçün. Ardından, 25 mikrolitre sitozolik ve nükleer ekstraktlar hazırlayın.Bu alikotları beş saniye boyunca sıvı nitrojen içine koyarak dondurun ve doğrudan eksi 80 santigrat derecede saklayın. Beş mikrolitre 10 mikromolar RNA probunu 0,5 mililitrelik, ince duvarlı mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve bunları 85 santigrat derecede bir PCR makinesinde beş dakika inkübe edin. Tüpleri hemen buzun üzerine yerleştirin.Tek bir 30 mikrolitrelik reaksiyon için, RNA içeren tüpe 10 mikrolitre önceden hazırlanmış karışım ekleyin. Reaksiyona dikkatlice 15 mikrolitre PEG %30 ekleyin ve reaksiyonu karıştırmak için taze bir uç kullanın. Reaksiyonu gece boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün reaktifleri hazırlayın. RNA etiketleme reaksiyon tüplerine 70 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. 100 mikrolitre kloroform-izoamil alkol ekleyin ve kısaca girdap yapın ve numuneyi üç dakika boyunca 13.000 kez g'de döndürün.Sadece üst fazı dikkatlice çıkarın. Alt faza dokunmaktan kaçının. Nükleaz içermeyen, 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.10 mikrolitre beş molar sodyum klorür, bir mikrolitre glikojen ve 300 mikrolitre buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin. Tüpü iki saat boyunca eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin. İki saat sonra, 15 dakika boyunca 13.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. 300 mikrolitre buz gibi% 70 etanol ekleyin ve beş dakika boyunca 13.000 kez g ve dört santigrat derecede tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen atın ve peleti 15 dakika havayla kurutun.Peletleri 20 mikrolitre nükleaz içermeyen suda tekrar süspanse edin. RNA'yı 90 santigrat derecede iki dakika inkübe edin ve buzun üzerine yerleştirin. Streptavidin manyetik boncuklarının bir sonraki ön yıkama adımı sırasında etiketli RNA'yı buzun üzerine yerleştirin.50 pikomol RNA başına 50 mikrolitre streptavidin manyetik boncuk ön yıkama. Tüpü streptavidin manyetik boncuklarla 15 saniye boyunca vorteksleyin. Hızlı bir şekilde girdap yaptıktan sonra, kesilmiş pipet uçlarını kullanarak 200 mikrolitreyi temiz, 1,5 mililitrelik Safe-Lock tüpüne çıkarın.Ardından, boncuklar tüpün yanında toplanacak şekilde tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve bir dakika bekleyin. Yeniden süspansiyon sıvısını çıkarın. Boncukları yıkamak için tüpü manyetik standdan çıkarın, 400 mikrolitre 0.1 molar sodyum hidroksit, 0.05 molar sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.Tüpü manyetik standa geri yerleştirin ve bir dakika bekleyin. Ardından, süpernatanı toplayın. Boncukları 200 mikrolitre 100 milimolar sodyum klorür ile yıkayın ve süpernatanı çıkarın.200 mikrolitre 20 milimolar tris ekleyin, boncukları pipetleyerek yeniden süspanse edin ve tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin. Bir dakika sonra süpernatanı çıkarın. Ardından, tüpü manyetik standdan çıkarın, 200 mikrolitre 1X RNA yakalama tamponu ekleyin ve streptavidin manyetik boncuklarını kısaca girdaplayarak yeniden askıya alın.50 mikrolitre streptavidin manyetik boncuklarını çıkarın ve kesilmiş bir pipet ucu kullanarak etiketli her RNA tüpüne ekleyin. Tüpleri bir rulo üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tüp bir dakika boyunca manyetik stand üzerinde kaldıktan sonra, süpernatanı çıkarın.Boncuklara 50 mikrolitre 20 milimolar tris ekleyin ve tekrar süspanse edin. Ardından, tüpleri manyetik standa yerleştirin. Bir dakika sonra süpernatanı çıkarın.Boncuklara 100 mikrolitre 1X protein RNA bağlayıcı tampon ekleyin ve tekrar süspanse edin. Ardından, tüpleri manyetik standa geri yerleştirin. Tüpler bir dakika boyunca standda kaldıktan sonra, süpernatanı toplayın.100 mikrolitre ana karışım B ekleyin, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının. Reaksiyon tüplerini bir silindir üzerinde dört santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Yıkama ve elüsyon adımlarına geçin.Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, akışı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Boncukların üzerine 100 mikrolitre 1X yıkama tamponu pipetleyin, yavaşça yeniden askıya alın, tekrar standa yerleştirin, bir dakika bekleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.Manyetik boncuklara 40 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve bir tüp çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, bir dakika bekleyin ve eluat numunesi alın. Buzun üzerine yerleştirin ve aşağı akış analizi için kullanın.Nükleer/sitozolik fraksiyonların saflığını göstermek için, proteinler Western blot ile analiz edildi, bu da alfa-tubulinin sadece sitozolik fraksiyonda tespit edildiğini ve PARP proteininin sadece nükleer fraksiyonda tespit edildiğini gösterdi. CALB2 üç asal UTR ARE probundan gelen elüat, insan R'sinin bağlandığını gösterdi ve mutant probdan ve demire duyarlı proteini bağlayan ilgisiz RNA probundan gelen elüatta yoktu. CALB üç asal UTR ve insan R arasındaki özgüllüğü daha fazla göstermek için, zar anti-mezotelin antikoru ile incelendi ve üç elüat numunesinin tümü mezotelin varlığı göstermedi, bu da CALB2 üç asal UTR içindeki stabilize edici ARE motifinin insan R proteinini spesifik olarak bağlayabileceğini gösterdi.Jelin Coomassie boyama, üç farklı RNA probu ile inkübe etmek için eşit miktarda protein kullanıldığını göstermektedir. Bu prosedürü takiben, hangi dizinin ona bağlandığı gibi ek soruları ele almak için belirli bir proteinin immünopresipitasyonu gibi protein merkezli ek bir yöntem gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, RNA biyolojisi alanındaki araştırmacıların belirli bir RNA'nın olası etkileşimli ortaklarını keşfetmelerinin yolunu açtı.

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan epitel hücrelerini izole etmek için modifiye bir yoğunluk santrifüj gradyan tabanlı metodoloji kullanıldı. Yüzeye bağlı proteinler, biyotinlenmiş ve streptavidin manyetik boncuklarla arıtılmış uygulamalarda kullanılmak üzere saflaştırılmıştır.

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

RNA/protein kompleksleri Botin-streptavidin strateji kullanarak saf ve daha fazla fonksiyonel analiz için uygun olmayan bir biçimde denaturing koşullarda çözüm için eluted. Burada, yerel ve tamamen işlevsel RNA/protein kompleksleri verimli bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA ve nazik bir UV-elüsyon adım kullanır bu stratejinin bir değişiklik açıklar.

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

Burada sunulan, protein-nüklik asit etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak uygulanabilir olan biotin etiketlerini kullanarak in vitro biyokimyasal kurallara yönelik protokollerdir.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.

Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme

Burada, insan hücrelerinden toplam protein ekstraktını, biyotinile RNA ile kaplanmış streptavidin boncuklarını ve kütle spektrometri analizini kullanarak, spesifik RNA dizilerinin protein interaktörlerini ortaya çıkarmak, ölçmek ve doğrulamak için optimize edilmiş bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

Öğrenin, desthiobiotin-streptavidin arıtma yöntemiyle mezotelyoma hücrelerindeki RNA bağlayıcı proteinleri nasıl yakalayacağınızı. Bu teknik, RNA biyolojisi ve protein etkileşimleri araştırmalarında güvenilir bir yaklaşım sunar.

Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı

Daha fazla video keşfet