Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı

Bu prosedürün genel amacı, mezotelyoma hücrelerinde RNA molekülünde bulunan belirli bir diziye bağlanan sitozolik proteini yakalamaktır. Bu yöntem, RNA biyolojisi alanında, tahmin edilen bir RNA bağlayıcı proteinin bir transkriptte adenozin veya üridin açısından zengin diziye bağlanıp bağlanamayacağı gibi anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, raportör tahlili ile değerlendirilen stabilize edici veya destabilize edici elementlerin fonksiyonel karakterizasyonunu tamamlamasıdır.

Bu tekniği gösteren, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Jelena Kresoja-Rakic olacak. Protokole başlamak için,% 80 ila 90 birleşme ile önceden hazırlanmış ACC-MESO-4 hücrelerini edinin. Ortamı aspire edin, hücreleri 15 mililitre 1X fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin.

Daha sonra, üç mililitre% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve kültür şişesini üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Yedi mililitre takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı ekleyin, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve beş dakika boyunca 200 kez g'de döndürün. Daha sonra, ortamı aspire edin ve hücre peletini 1.5 mililitre 1X PBS ile yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri beş dakika boyunca 500 kez g ve dört santigrat derecede tekrar döndürün. Döndürmeden sonra, süpernatanı atın, hücre peletini 1.5 mililitre buz gibi soğuk 1X PBS ile yeniden süspanse edin ve hücreleri üç dakika boyunca 500 kez g ve dört santigrat derecede döndürün.

Süpernatanı atın ve hücre peletini içeren tüpü 10, 20, 50 ve 100 mikrolitre 1X PBS ile 1.5 mililitrelik bir tüp ile karşılaştırarak hücre peletiyle paketlenmiş hacmi tahmin edin. İki mikrolitre 1X proteinaz inhibitörü ile desteklenmiş 200 mikrolitre buz gibi sitoplazmik ekstraksiyon reaktifi veya CER I ekleyin. Peleti 15 saniye kuvvetlice girdap haline getirin ve tüpü buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.

11 mikrolitre buz gibi sitoplazmik ekstraksiyon reaktifi II veya CER II ekleyin, beş saniye boyunca kuvvetli bir şekilde girdap yapın ve tüpü buz üzerinde bir dakika inkübe edin. Numuneyi beş saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve tüpü beş dakika boyunca 16.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı buz üzerindeki temiz, önceden soğutulmuş tüpe aktarın.

Kalan peleti, bir mikrolitre proteinaz inhibitörü ile desteklenmiş 100 mikrolitre buz gibi soğuk nükleer ekstraksiyon reaktifi veya NER içinde yeniden süspanse edin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Numuneyi buz üzerinde 40 dakika inkübe edin ve her 10 dakikada bir 15 saniye boyunca girdap yapın. Tüpü 10 dakika boyunca 16.000 kez g'de santrifüjleyin.

Nükleer protein fraksiyonu olan süpernatanı temiz, önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın. Biskinkoninik yöntemi kullanarak protein konsantrasyonunu hemen ölçün. Ardından, 25 mikrolitre sitozolik ve nükleer ekstraktlar hazırlayın.

Bu alikotları beş saniye boyunca sıvı nitrojen içine koyarak dondurun ve doğrudan eksi 80 santigrat derecede saklayın. Beş mikrolitre 10 mikromolar RNA probunu 0,5 mililitrelik, ince duvarlı mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve bunları 85 santigrat derecede bir PCR makinesinde beş dakika inkübe edin. Tüpleri hemen buzun üzerine yerleştirin.

Tek bir 30 mikrolitrelik reaksiyon için, RNA içeren tüpe 10 mikrolitre önceden hazırlanmış karışım ekleyin. Reaksiyona dikkatlice 15 mikrolitre PEG %30 ekleyin ve reaksiyonu karıştırmak için taze bir uç kullanın. Reaksiyonu gece boyunca 16 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün reaktifleri hazırlayın. RNA etiketleme reaksiyon tüplerine 70 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. 100 mikrolitre kloroform-izoamil alkol ekleyin ve kısaca girdap yapın ve numuneyi üç dakika boyunca 13.000 kez g'de döndürün.

Sadece üst fazı dikkatlice çıkarın. Alt faza dokunmaktan kaçının. Nükleaz içermeyen, 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

10 mikrolitre beş molar sodyum klorür, bir mikrolitre glikojen ve 300 mikrolitre buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin. Tüpü iki saat boyunca eksi 20 santigrat dereceye yerleştirin. İki saat sonra, 15 dakika boyunca 13.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. 300 mikrolitre buz gibi% 70 etanol ekleyin ve beş dakika boyunca 13.000 kez g ve dört santigrat derecede tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen atın ve peleti 15 dakika havayla kurutun.

Peletleri 20 mikrolitre nükleaz içermeyen suda tekrar süspanse edin. RNA'yı 90 santigrat derecede iki dakika inkübe edin ve buzun üzerine yerleştirin. Streptavidin manyetik boncuklarının bir sonraki ön yıkama adımı sırasında etiketli RNA'yı buzun üzerine yerleştirin.

50 pikomol RNA başına 50 mikrolitre streptavidin manyetik boncuk ön yıkama. Tüpü streptavidin manyetik boncuklarla 15 saniye boyunca vorteksleyin. Hızlı bir şekilde girdap yaptıktan sonra, kesilmiş pipet uçlarını kullanarak 200 mikrolitreyi temiz, 1,5 mililitrelik Safe-Lock tüpüne çıkarın.

Ardından, boncuklar tüpün yanında toplanacak şekilde tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve bir dakika bekleyin. Yeniden süspansiyon sıvısını çıkarın. Boncukları yıkamak için tüpü manyetik standdan çıkarın, 400 mikrolitre 0.1 molar sodyum hidroksit, 0.05 molar sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Tüpü manyetik standa geri yerleştirin ve bir dakika bekleyin. Ardından, süpernatanı toplayın. Boncukları 200 mikrolitre 100 milimolar sodyum klorür ile yıkayın ve süpernatanı çıkarın.

200 mikrolitre 20 milimolar tris ekleyin, boncukları pipetleyerek yeniden süspanse edin ve tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin. Bir dakika sonra süpernatanı çıkarın. Ardından, tüpü manyetik standdan çıkarın, 200 mikrolitre 1X RNA yakalama tamponu ekleyin ve streptavidin manyetik boncuklarını kısaca girdaplayarak yeniden askıya alın.

50 mikrolitre streptavidin manyetik boncuklarını çıkarın ve kesilmiş bir pipet ucu kullanarak etiketli her RNA tüpüne ekleyin. Tüpleri bir rulo üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Tüp bir dakika boyunca manyetik stand üzerinde kaldıktan sonra, süpernatanı çıkarın.

Boncuklara 50 mikrolitre 20 milimolar tris ekleyin ve tekrar süspanse edin. Ardından, tüpleri manyetik standa yerleştirin. Bir dakika sonra süpernatanı çıkarın.

Boncuklara 100 mikrolitre 1X protein RNA bağlayıcı tampon ekleyin ve tekrar süspanse edin. Ardından, tüpleri manyetik standa geri yerleştirin. Tüpler bir dakika boyunca standda kaldıktan sonra, süpernatanı toplayın.

100 mikrolitre ana karışım B ekleyin, hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının. Reaksiyon tüplerini bir silindir üzerinde dört santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Yıkama ve elüsyon adımlarına geçin.

Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, akışı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Boncukların üzerine 100 mikrolitre 1X yıkama tamponu pipetleyin, yavaşça yeniden askıya alın, tekrar standa yerleştirin, bir dakika bekleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.

Manyetik boncuklara 40 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve bir tüp çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, bir dakika bekleyin ve eluat numunesi alın. Buzun üzerine yerleştirin ve aşağı akış analizi için kullanın.

Nükleer/sitozolik fraksiyonların saflığını göstermek için, proteinler Western blot ile analiz edildi, bu da alfa-tubulinin sadece sitozolik fraksiyonda tespit edildiğini ve PARP proteininin sadece nükleer fraksiyonda tespit edildiğini gösterdi. CALB2 üç asal UTR ARE probundan gelen elüat, insan R'sinin bağlandığını gösterdi ve mutant probdan ve demire duyarlı proteini bağlayan ilgisiz RNA probundan gelen elüatta yoktu. CALB üç asal UTR ve insan R arasındaki özgüllüğü daha fazla göstermek için, zar anti-mezotelin antikoru ile incelendi ve üç elüat numunesinin tümü mezotelin varlığı göstermedi, bu da CALB2 üç asal UTR içindeki stabilize edici ARE motifinin insan R proteinini spesifik olarak bağlayabileceğini gösterdi.

Jelin Coomassie boyama, üç farklı RNA probu ile inkübe etmek için eşit miktarda protein kullanıldığını göstermektedir. Bu prosedürü takiben, hangi dizinin ona bağlandığı gibi ek soruları ele almak için belirli bir proteinin immünopresipitasyonu gibi protein merkezli ek bir yöntem gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, RNA biyolojisi alanındaki araştırmacıların belirli bir RNA'nın olası etkileşimli ortaklarını keşfetmelerinin yolunu açtı.