Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Bu tekniğin genel amacı, in vitro kültür analizleri için yenidoğan fare yavrularından O4 pozitif oligodendrositleri seçmek için immünomanyetik izolasyon kullanmaktır. Bu yöntem, miyelin ve miyelinasyonu etkileyen hastalıkların incelenmesi ile ilgili sinir bilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yaklaşık bir saatlik saatlerde% 80'den daha büyük bir saflıkta nihai oligodendrosit kültürünün hazırlanmasını kolaylaştırmasıdır.

Doğum sonrası beş ila yedi günlük bir farenin kafa derisinin orta hattı boyunca cildi kesmek için küçük diseksiyon makası kullanarak başlayın. Kafatasını ortaya çıkarmak için deri kanadını geri çekin ve kafatasını orta hat boyunca arkadaki açıklıktan ön bölgeye kadar dikkatlice kesin. Kafatasının arkasındaki açıklıktan, kemiğin tabanı boyunca her bir göz yuvasına doğru kesin ve korteksleri orta beyinden nazikçe uzaklaştırmak için ince forseps kullanın.

Daha sonra korteksleri yedi mililitre B-27 Neurobazal A Medium içeren 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Tüm beyinler toplandığında, korteksleri beş mililitre ayrışma tamponu içeren 60 milimetrelik yeni bir doku kültürü kabına aktarın ve korteksleri bir küp milimetrelik parçalara ayırmak için 15 numaralı bir neşter bıçağı kullanın. Beyin parçalarını 37 derece Santigrat derece% 5 CO2 inkübatörde 20 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, enzimatik reaksiyonu durdurmak için bir mililitre Sığır Büyüme Serumu ekleyin. 10 mililitrelik bir Serolojik Pipet kullanarak, doku bulamacını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beyin dokusunu pipetleme ile altı ila sekiz kez nazikçe ayırın. Ayrışmış doku parçalarının iki ila üç dakika oturmasına izin verin.

Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, dokulara Sığır Büyüme Serumu ve DNaz I ile takviye edilmiş üç mililitre Nörobazal A Ortamı ekleyin ve dokuları daha fazla pipetleme ile nazikçe ayırmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Gördüğünüz gibi, yüksek canlı hücre verimi sağlamak için uygun pipetleme kuvveti çok önemlidir.

Pipetleme çok zorsa, uygulanabilirlik düşük olabilir. Pipetleme çok nazikse, hücresel verim düşük olabilir. Doku parçalarının iki ila üç dakika daha oturmasına izin verin.

Daha sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve dokuya Sığır Büyüme Serumu ve DNaz I ile desteklenmiş üç mililitre taze Nörobazal A Ortamı ekleyin. Beyin dokusunu bir P-1000 pipet ucuyla büyük bir doku parçası kalmayana kadar nazikçe ayırın ve kabarcıkları önlemeye dikkat edin. Hücre çözeltisini 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve tek hücreli süspansiyonun son hacmini, Sığır Büyüme Serumu ve DNaz I ile desteklenmiş taze Neurobazal A Ortamı ile 30 mililitreye getirin. Hücre süspansiyonunu iki adet 15 mililitrelik konik tüpe bölün, ve nöral hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.

Son beş ila 10 mikrolitre bulutlu süpernatant hariç hepsini çıkarın ve hücrelere Sığır Büyüme Serumu ile takviye edilmiş üç mililitre Neurobazal A Ortamı ekleyin. Hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın ve %10 Sığır Büyüme Serumu içeren taze Neurobazal A Ortamı ile son hacmi 15 mililitreye getirin. Hücre çözeltisini 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe süzün ve son hacmi %10 Sığır Büyüme Serumu içeren taze Neurobazal A Ortamı ile 30 mililitreye getirin.

Ardından, filtrelenmiş hücre süspansiyonunu santrifüjleme için iki adet 15 mililitrelik konik tüp arasında bölün. ve hücreleri bir araya getirmeden önce peletleri 2,5 mililitre buz gibi soğuk Manyetik Hücre Sıralama Tamponunda yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti yedi hücreye bir kez 10 kez 90 mikrolitre taze Manyetik Hücre Sıralama Tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra, yedi hücreye bir kez 10 kez 10 mikrolitre anti-04 boncuk ekleyin ve hücre çözeltisini hafifçe hafifçe vurarak karıştırın. Dört santigrat derecede 15 dakika sonra, her beş dakikada bir hafifçe vurarak, santrifüjleme ile yıkamak için yedi hücreye bir kez 10'da iki mililitre Manyetik Hücre Sıralama Tamponu ekleyin ve süpernatanı dikkatli bir vakum aspirasyonu ile atın. Peletleri, her bir kez 10 ila yedi hücre için 500 mikrolitre taze Manyetik Hücre Sıralama Tamponunda yeniden askıya alın ve uygun boyutta bir manyetik boncuk sıralama sütununu karşılık gelen manyetik ayırıcısına yerleştirin.

Kolonun üzerine 40 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve süzgeci üç mililitre Manyetik Hücre Sıralama Tamponu ile önceden durulayın, kolonun kurumasına izin vermeden tamponun kolondan geçmesine izin verin. Hücreleri süzgecin içine ekleyin, ardından Manyetik Hücre Sıralama Tamponu ile bir mililitrelik yıkama yapın. Kolonu yıkama başına üç mililitre Manyetik Hücre Sıralama Tamponu ile üç kez ve bir kez Oligodendrosit Proliferasyon Ortamı ile yıkayın.

Ardından, sütunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve pistonu hemen beş mililitre taze Oligodendrosit Proliferasyon Ortamını kolondan akıtmak için kullanın. Saydıktan sonra, hücreleri uygun bir kaplama yoğunluğuna seyreltin ve laminini, 24 oyuklu bir plakada önceden kaplanmış örtü fişlerinden 100 mikrolitre Oligodendrosit Proliferasyon Ortamı ile değiştirin. Oligodendrositlerin kapak fişlerine yapışmasını teşvik etmek için oligodendrositleri 37 santigrat derecede ve% 5 CO2'de 45 dakikadan daha uzun süre inkübe edin.

Ardından, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğunu, 24 saatlik bir inkübasyon için 500 mikrolitre Oligodendrosit Proliferasyon Ortamı ile doldurun. Ertesi gün, süpernatanları Oligodendrosit Farklılaşma Ortamı ile değiştirin ve hücreleri fiksasyon için hazır olana kadar inkübatöre geri koyun. Kaplamadan 24 saat sonra, hücreler, erken evre proliferatif oligodendrositin karakteristik bir özelliği olan Faz Kontrast Mikroskobu altında bipolar veya tripolar görünür.

İmmünofloresan Boyama, kaplamadan 24 saat sonra, bu pre-oligodendrositlerin çoğunun ayrıca NG2 ve O4 etiketlemesi gösterdiğini, GFAP ve anti-01 antikoru ile etiketlemenin çok daha az yaygın olduğunu gösterir, bu da hücrelerin çoğunun bu aşamada az sayıda olgunlaşmamış veya olgun oligodendrosit içeren pre-oligodendrositler. 72 saatte, oligodendrosit morfolojisi 24 saatten daha karmaşık görünmektedir ve erken oligodendrosit belirteci NG2 için pozitif çok daha düşük bir hücre frekansı vardır. Ayrıca, çoğu hücre O4 etiketlemesi gösterir ve hücrelerin neredeyse yarısı bu aşamada 01 antikoru için boyanır, bu da hücrelerin daha olgun bir fenotipe farklılaştığını düşündürür.

Özellikle, astrositlerin varlığı son derece düşük kalmaktadır. Bu sonuçlar, zamanla, immüno-manyetik olarak izole edilmiş oligodendrositlerin, astrositler gibi diğer hücre tiplerinin çok az kontaminasyonu ile in vitro olarak olgunlaşmanın Üçüncü Aşamasına farklılaşabildiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, immünomanyetik izolasyon kullanarak yenidoğan fare yavrularından primer oligodendrositlerin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde tamamlanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde iyi şanslar.