Name: Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Öğrenin fare birincil oligodendrositlerinin hızlı ve spesifik immünomanyetik izolasyon yöntemini. Bu teknik, miyelinasyon ve demiyelinizan hastalıkların in vitro araştırmalarında yüksek saflıkta hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada hibe Ulusal multipl skleroz Derneği (RG4591A1/2) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R03NS06740402) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr. Ivan Hernandez ve laboratuvar üyeleri laboratuvar alanı, ekipman ve tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Bu çalışmada kullanılan fareler için SUNY eyalet Tıp Merkezi bölümü, laboratuvar hayvan kaynakları (DLAR) protokol numarası 15-10492 kurallarına göre bakım.
Not: Birincil oligodendrocytes yenidoğan (P5-P7 vahşi tipli C57Bl/6N) izole edildi fareler. Bu aşamada, yüksek hücresel verim sağlamak kemirgen beyaz madde % 80'den fazla olgunlaşmamış OLs oluşturmaktadır. Tüm arabellek ve reaktif kompozisyon Malzemeler tablosonunda mevcuttur.
1. Coverslips hazırlık
Not: Poly-D-lizin (PDL) / kaplı laminin coverslips OL yalıtım önce hazırlanmış.
<ol><li>Yer #1 Alman cam coverslips 50 mL konik tüp içine ve %70 35 mL ekleyin alkol onları temizlemek için.</li>
	<li>Tüp kapatmak, bir nutating Mikser yerleştirin ve hafifçe sallanır sırasında oda sıcaklığında en az 30 dk için kuluçkaya. Coverslips gecede inkübe.</li>
	<li>% 70 alkol atın.</li>
	<li>Coverslips 3 kez deiyonize su ile yıkamak, su vakum aspirasyon ile her zaman kaldır.</li>
	<li>30-35 mL PDL 50 µg/mL coverslips kapsayacak şekilde 50 mL Tüp, yeterince coverslips için ekleyin.</li>
	<li>Coverslips bir nutating Mikser üzerinde içeren 50 mL tüp yerleştirin ve hafifçe sallanır sırasında oda sıcaklığında en az 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Coverslips vakum aspirasyon ile her zaman su kaldırma 3 kez deiyonize suyla yıkayın.</li>
	<li>Coverslips 60 mm Petri deiyonize su içeren yemekleri aktarın.</li>
	<li>P200 pipet ucu coverslips Petri kabına tüm yüzeyini örten bir katman olarak düzenlemek için kullanın.</li>
	<li>Dikkatle, su yemekleri vakum aspirasyon ile kaldırın.</li>
	<li>Coverslips etrafında su fazlalığı kaldırmak ve onlara gecede açık kapaklı ve UV mahallede ışığı altında kuru. Not: PDL kaplı cam coverslips steril Petri yemeklerinde 4 ° C'de üç aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Coverslips 24-şey levha, her şey, iyi forseps kullanarak bir tane yerleştirin.</li>
	<li>Coverslips de yapma kenarları kuyu duvarı dokunmayın emin merkezine hareket.</li>
	<li>B27NBMA içinde seyreltilmiş 10 µg/mL laminin 100 µL ekleyin ( Tablo reçetesigörmek) her coverslip ortasında başlayan ve tüm alanı kapsayacak şekilde kenar kısımlara doğru dairesel şekilde hareket. Not: laminin OL bakım ilgilenmektedir ve farklılaşma olgun OLs içine teşvik, vitro kültür41,42,43,44için önemli bir OL hayatta kalma faktörü çünkü.</li>
	<li>Bir 37 ° C kuluçka OLs kaplama hazır olana veya en az 1 h için % 5 CO2 plaka kuluçkaya.</li>
</ol>2. fare beyin korteksi ayrılma
<ol><li>Doğum sonrası 5-7 günlük eski C57Bl/6N fare pups hızlı işten çıkarma tarafından daha önce % 70 etanol içinde temizlenmiş makas ile kurban. Not: serebral cortices 5-6 yenidoğan fare pups üzerinden her hazırlık için kullanılmıştır. Ortalama olarak, bir fare beyin 1-1.5 x 106 OLs verir.</li>
	<li>Kafa derisi deri orta çizgi boyunca küçük parçalara makasla kesme ve kafatası ortaya çıkarmak için geri çek.</li>
	<li>Kafatası dikkatle arkasında kafatasının ön alan beyin zarar görmesini önlemek için makasla yukarı kaldırarak doğru açılmasını başlayarak orta çizgi boyunca kesin. Sonra kafatasının arkasına açılış kullanarak her göz çukuru kafatasının boyunca doğru kesti.</li>
	<li>İyi forseps yavaşça orta uzak cortices alay ve B27NBMA 7 mL içeren 60 mm doku kültürü yemek için aktarmak için kullanın. 2.2 2.4 ile disseke cortices havuzu her beyin için yineleyin.</li>
	<li>Cortices 5 mL ayrılma arabellek de içeren yeni bir 60 mm doku kültürü tabak transfer (B27NBMA, 20-30 U/mL Papain ve 2500 U DNaz ben).</li>
	<li>#15 neşter bıçak kullanarak yaklaşık 1 mm3 küçük parçalar halinde cortices zar ve 20 dk bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için kuluçkaya.</li>
	<li>1 mL sığır büyüme serum (BGS enzimatik reaksiyon durdurmak için) ekleyin.</li>
	<li>Cortices ayrışma media ile birlikte bir 15 mL konik tüp 10 mL serolojik damlalıklı kullanarak aktarın.</li>
	<li>Yavaşça yavaşça yukarı pipetting tarafından beyin dokusundan ayırmak başlar ve 10 mL serolojik damlalıklı 6 - 8 kez kullanarak aşağı kullanarak bakım baloncuklar en aza indirmek.</li>
	<li>2-3 dakika için yerleşmek ve süpernatant temiz bir tüp aktarmak doku parçaları izin.</li>
	<li>B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS/2500 U DNaz ben doku için cips.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting sırasında beyin dokusundan ayırmak için 5 mL serolojik pipet kullanın 6 - 8 kez. Baloncuklar en aza indirmek için dikkatli olun.</li>
	<li>Doku parçaları 2-3 dakika için yerleşmek izin verir.</li>
	<li>Süpernatant temiz bir tüp aktarın. B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS/DNaz ben doku için cips.</li>
	<li>Yavaşça P1000 damlalıklı bahşiş medya karışımı pipetting kullanarak beyin dokusu ayırmak ve beyin dokusu yukarı ve aşağı. Tekrar adımları 2,13 ve 2.14 doku yok büyük boyutta kalıncaya kadar veya B27NBMA kadar % 10 içeren BGS/DNaz yorgun, hangisi ilk olursa. Baloncuklar en aza indirmek için dikkatli olun.</li>
	<li>Havuzu hücre süspansiyon ile önceki supernatants.</li>
	<li>50 mL tüp yer 70 µm hücre süzgeç. 10 mL serolojik damlalıklı kullanarak, havuza alınan hücre süspansiyon yavaşça 70 µm hücre süzgeç geçmek.</li>
	<li>B27NBMA %10 içeren 1 mL ekleyerek hücre süzgeç yıkama BGS/DNaz ben.</li>
	<li>Hücre süzgeç atmak. 30-%10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS/DNaz ben.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için iki 15 mL konik tüp aktarın. Hücre süspansiyon için 200 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant hücreleri havaya maruz bırakmadan kaldırmak. Süpernatant hücre artıkları nedeniyle bulutlu olacak. B27NBMA %3 10 içeren mL ekleyin BGS Pelet için.</li>
	<li>Dikkatle P1000 damlalıklı kullanarak hücre Pelet ayırmak. %15 10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon bir taze 40 µm hücre süzgeç geçmek.</li>
	<li>B27NBMA %10 içeren 1 mL ekleyerek hücre süzgeç yıkama BGS. Hücre süzgeç atmak.</li>
	<li>%30 10 içeren mL için B27NBMA ile ses getirmek BGS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon için 2 x 15 mL konik tüpler aktarın. Hücre süspansiyon için 200 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Çoğu süpernatant hücreleri havaya maruz bırakmadan kaldırmak. Hücre topakları buz soğuk manyetik hücre (MCS) arabellek sıralama 5 mL resuspend.</li>
</ol>3. hücre sayımı ve Viabilite tespiti
<ol><li>Hücre süspansiyon 100 µL Trypan mavi çözüm 400 µL 1:5 seyreltme %0,4 (w/v) elde etmek için bir 1.5 mL microcentrifuge tüp ile sulandırmak.</li>
	<li>Bir cam bir hemasitometre odası ve dolgu üzerinde 10 µL P10 pipet kullanarak ve kaçınarak hücre seyreltme ile iki odaları bantlayın ortalayın. Çözüm kılcal eylem tarafından kapak cam altında geçecek.</li>
	<li>Hemasitometre mikroskop sahnesinde yerini ve 40 X büyütme kullanarak odağı ayarlayın. Not: Bir el karşı her beş kareler (dört köşe ve bir merkezi) kullanarak hücre sayısı kaydedilir. Yalnızca uygun olmayan hücreleri boya emer ve mavi, canlı iken görünür ve sağlıklı hücreler yuvarlak ve Refraktif görünür ve bırakmak mililitre başına uygulanabilir ve toplam hücre sayısı tayini için mavi renkli boya absorbe değil.</li>
</ol>4. yalıtım O4+ Oligodendrocytes
<ol><li>Hücre süspansiyon vasıl 200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant vakum aspirasyon, hücrelerin havaya maruz kaçınarak kullanarak atmak.</li>
	<li>Pelet 90 µL MCS arabelleği başına 1 x 107 toplam hücreleri anti-O4 boncuk 1 x 107 hücre başına 10 µL eklenmesiyle takip resuspend.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ve boncuk hafifçe parmak ile 15 mL konik tüp 4 - 5 kez flicking tarafından karıştırın.</li>
	<li>4-5 timesevery 15 mL konik tüp parmak ile flicking 4 ° C'de 15 dakika karışımı kuluçkaya 5 dak.</li>
	<li>Karışımı yavaşça tüp 2 mL 1 x 107 hücre başına MCS arabellek ekleyerek yıkayın. 200 x g 10 dk at mix santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant dikkatli vakum aspirasyon, hücrelerin havaya maruz kaçınarak kullanarak atmak. Hücre Pelet MCS arabelleği her 1 x 107 hücreler için 500 µL resuspend.</li>
	<li>Manyetik ayırıcı bir manyetik ayırıcı standına bağlayın. Manyetik ayırıcı için bir seçim sütununu ekleyin ve bir 40 µm hücre süzgeç sütun üstüne yerleştirin. İki 15 mL veya bir 50 mL konik tüp aracılığıyla akış toplamak için ayırma sütununun altında yerleştirin.</li>
	<li>40-µm hücre süzgeç ve ayırma sütun MCS arabellek 3 mL ile ön durulama ve arabellek sütunu boyunca kuru izin olmadan çalıştırmak izin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon ve boncuk hücre süzgeç ve seçim sütununu içine ekleyin.</li>
	<li>40 µm hücre süzgeç MCS arabelleği 1 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Hücre süzgeç atın ve hücreleri, boncuk ve arabellek sütunu boyunca kuru izin olmadan çalıştırmak izin.</li>
	<li>3 kez ile 3 mL MCS arabellek ayırma sütun ve 1 saat OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya ile yıkayın.</li>
	<li>Ayrılık sütun manyetik ayırıcıyı kaldırmak, hızlı bir şekilde 15 mL konik tüp içine yerleştirin ve hemen OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya 5 mL ekleyin.</li>
	<li>Üstünde tepe-in belgili tanımlık sütun ve sıkıca bas 15 mL konik tüp etiketli hücrelere dışarı floş için lavabo pompası yerleştirin.</li>
	<li>Hücre sayımı ve canlılığı Trypan mavi ve hemasitometre madde 3 te belirtildiği şekilde kullanarak belirlemek için hücre süspansiyon, 100 µL kaldırın. Not: Hücre canlılığı % 80'i yukarıda OLs kültürü ile devam etmek için kabul edilebilir olarak kabul edilir, ancak canlılığı 90 %'den büyük en uygunudur.</li>
</ol>5. kaplama izole O4+ Oligodendrocytes
<ol><li>Hücre süspansiyon için yoğunluğu (coverslip başına 5 x 105 hücre) kaplama desire seyreltik OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya kullanımı. Not: devam etmeden önce bir doku kültürü mikroskop kullanarak uygun hücre yoğunluğu onaylanması bu yüzden yoğunluğu tohum OL çok önemlidir. Yoğunluk 10.000 hücre/coverslips aşağıda tohum zavallı hücre yaşam için neden olabilir. Yoğunluk için 10.000 25.000, OL, kaplama morfolojik farklılaşma yavaş45yaşında. Hücre hayatta kalmasını sağlamak için en az 50.000 hücreleri/coverslips tohum bir yoğunluk OLs plaka.</li>
	<li>Doku kültürü hood için kuluçka makinesi üzerinden laminin kaplanmış coverslips içeren 24-şey plaka taşımak.</li>
	<li>Laminin her coverslip kaldırın ve OL süspansiyon 100 µL ile değiştirin.</li>
	<li>37 °C/5% CO2 kuluçka en fazla OL yapışma sağlar coverslips tanıtmak için 45 dk OLs kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra 24-iyi tabaklar da kuluçka kaldırın. Her sel de, 500 µL OL nükleer silahların yayılmasına karşı medya ile 24-şey plaka.</li>
	<li>OLs 37 °C/5% CO2 kuluçka ek 24 h için geri koyun.</li>
	<li>OLs, kaplama sonra 24 h nükleer silahların yayılmasına karşı medyayı çıkarın ve farklılaşma ikna etmek için OL farklılaşma medya ile yerine.</li>
	<li>OLs da kuluçka makinesine koyun ve hücreleri fiksasyon için hazır olana çıkarmak değil. Not: pH değişiklikleri OLs için zararlıdır ve hücre canlılığı azaltmak, bu nedenle gereksiz kuluçka makinesi OLs kültürler kaldırılması-meli var olmak kaçmak.</li>
</ol>6. ayirt boyama
<ol><li>Hücre tespiti için yüzey işaretleyicileri (NG2, O1 ve O4) kuyulardan medyayı çıkarın.</li>
	<li>Fare Hibridoma supernatants (saf) O113 ve O4 (saf)13 karşı birincil antikor içeren 250 µL ekleyin ve NG2 karşı poliklonal tavşan (1:150 B27NBMA içinde seyreltilmiş). Not: ticari olarak mevcut anti-O1 ve anti-O4 antikorları kullanılacak ise, üretici tarafından önerilen dilutions kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>45 dk 37 °C/5% CO2 kuluçka makinesine maksimum için birincil antikor hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>İle iki kez % 0.05 Ara-20/1 X PBS yıkayın. %4 paraformaldehyde ile hücreleri tamir (%4 PFA) Oda sıcaklığında 10 dakika için.</li>
	<li>Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.</li>
	<li>Alexa 488 Birleşik keçi Anti-fare IgM ya da anti-tavşan IgG ikincil antikor (1: 400) B27NBMA içinde oranında seyreltin.</li>
	<li>% 0.05 Ara-20/1 X PBS coverslips kaldırın. Karanlık oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.</li>
	<li>Çift Kişilik iç işaretçileri (GFAP'nin) algılama için boyama için % 0.05 Ara-20/1 X PBS ve blok/permeabilize hücre bloğu/permeabilization arabellek oda sıcaklığında 15 dakika ile kaldırma. Aksi takdirde 6.17 adıma geçin.</li>
	<li>Blok/permeabilization arabellek kaldırın ve 250 µL tavuk anti-blok/permeabilization arabellekte seyreltilmiş GFAP'nin (1: 100) ekleyin.</li>
	<li>Anti-GFAP'nin oda sıcaklığında 1 h için hücrelerle kuluçkaya. Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.</li>
	<li>Alexa 594 Birleşik keçi Anti-tavuk IgG ikincil antikor (1: 400) B27NBMA içinde sulandırmak.</li>
	<li>% 0.05 Ara-20/1 X PBS coverslips kaldırın. Karanlık oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor hücrelerle kuluçkaya.</li>
	<li>Üç kez % 0.05 ile her 5 min için ara-20/1 X PBS yıkayın.</li>
	<li>4' ile 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstain ve hücreleri DAPI içeren ortam takma antifade ile monte edin.</li>
	<li>Coverslips gecede karanlık oda sıcaklığında tedavi edelim.</li>
	<li>Lekeli hücreleri bir epifluorescence mikroskopla görüntü. Not: Bu protokol için tek tip çekim hızı kullanarak 40 X büyütme oranında hücreleri görüntüsü.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Bu iletişim, biz son derece saf olgunlaşmamış fare oligodendrocyte kültürler verimli yalıtım için bir yöntem mevcut. Daha önce yayımlanmış protokolleri39,40' a göre bu yöntem GFAP'nin pozitif astrocytes çok daha düşük düzeyde ve sigara ile karakterize diğer hücrelerin çok düşük bir yüzde ile daha yüksek bir saflık vermiştir. Bu olgunlaşmamış OLs zaten oligodendroglial soy kararlı olduğunu işaret etmek önemlidir. Böylece, bu hücreler farklılaşma erken aşamalarında...

Oligodendrocytes (OLs) merkezi sinir sistemi (MSS)1myelinating hücrelerdir. Yalıtım ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir ortamda birincil oligodendrocytes kültür olduğunu oligodendroglia gelişimi yanı sıra multipl skleroz2 gibi hastalıkların demiyelinizan biyoloji vitro incelenmesi için değerli bir araç . Bu bir verimli ve sağlam oligodendrocyte yalıtım ve kültür Yöntem3gerektirir. Bu çalışmada, biz hızlı ve belirli bir değiştirilmiş yalıtım tekniği uygulamak için bir ayırt edici oligodendrocyte hücre yüzey marker ifadesi kullandı.
Dört farklı aşamaları oligodendrocyte olgunlaşma tespit edilmiştir, farklı hücre yüzey işaretleyicileri ifade her gelişim aşaması (Şekil 1) için her karakterize. Bu hücre yüzey işaretleyicileri belirli antikor4,5tarafından tanınır ve belirli aşamalarında OLs yalıtmak için kullanılabilir. İlk aşamada, oligodendrocyte öncü hücreleri (OPCs) çoğalırlar, göç ve özellikle hızlı trombosit-türevi büyüme faktörü reseptör (PDGF-Rα)6, gangliosid A2B5, proteoglikan NG27,8 kapasitesine sahiptir. , polysialic asit sinir hücre adezyon molekülü9 ve yağ asidi bağlayıcı protein 7 (FABP7)10. OPCs birkaç kısa işlemler sinirsel öncül hücreleri11karakteristik olan hücre vücudun karşıt direkleri yayılan iki kutuplu morfoloji var.
<img alt="Oligodendrosit olgunlaşma diyagramı; işaretleyicili aşamalar: OPC, Preoligodendrosit, Olgunlaşmamış, Olgun." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Oligodendrosit olgunlaşma diyagramı; işaretleyicili aşamalar: OPC, Preoligodendrosit, Olgunlaşmamış, Olgun."> Şekil 1: fare oligodendrocyte geliştirme sırasında hücre yüzey işaretlerinin ifade. A2B5, GalC (O1) NG2 O4 ve PDGF Rα özellikle oligodendrocytes belirli antikorları kullanarak belirli gelişimsel aşamada yalıtmak için kullanılabilir gibi OLs yüzey işaretleyicileri hücre.   <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
İkinci aşamada, OPCs preoligodendrocytes için ortaya çıkmasına ve hücre zarı hızlı sadece OPC işaretleri, aynı zamanda O4 antikor12,13ve GPR17 protein14, tarafından tanınan sulfatide (sülfürlü galactolipid) Hangi kadar olgunlaşmamış oligodendrocyte (OL) sahne devam ederse. Bu aşamada preoligodendrocytes multipolar kısa işlemler genişletir. Preoligodendrocytes büyük OL sahne olgunlaşmamış OLs15küçük bir nüfusa sahip fare ve fare serebral beyaz madde postnatal gün 2 (P2) bulunmaktadır.
Üçüncü aşamada, olgunlaşmamış OLs O4 hızlı, ifade A2B5 ve NG2 işaretlerinin kaybetmek ve galactocerebroside C16hızlı başlar devam ediyor. Bu aşamada OLs oligodendroglial soy işlenir ve uzun ramified dalları17,18ile sonrası Mitotik hücre olur. Olgunlaşmamış OL teşkil P7, kemirgen beyaz madde % 80'den fazla ve şu anda15,19,20,21ilk MBP+ hücreler gözlenir. Bu nedenle, izolasyon P7, OLs yüksek hücresel verim sağlamak.
OL geliştirme son ve dördüncü aşamada olgun OLs myelinating proteinler (miyelin temel protein (MBP), proteolipid protein (PIP), ilişkili miyelin glikoprotein (MAG) ve miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG)22,23 hızlı. ,24,25,26. Bu aşamada olgun OLs Membran Kaplamalar aksonlar çevresinde enwrapping bu formu kompakt genişletmek ve myelinate için edebiliyoruz. Bu fare ve fare beyninde MBP+ hücreleri P1419,20,21, giderek bol olmak gözlem ile örtüşmektedir.
Oligodendrocyte Fewster ve 196727meslektaşları tarafından ilk yalıtım beri kemirgen CNS OLs, izolasyon için çeşitli yöntemler de dahil olmak üzere immunopanning28,29,30hayata geçirdik, floresans aktif hücre hücre yüzey özgü antijenlere28,31, farklı degrade Santrifüjü32,33,34,35 istismar (FACS) sıralama ve farklı CNS glia36,37fark bağlılık dayalı sallayarak yöntemi. Ancak, mevcut kültür yöntemleri kısıtlamaları, saflık, verim ve38yordamları gerçekleştirmek için gereken süre açısından özellikle bulunmaktadır. Bu nedenle, daha verimli izolasyon yöntemleri oligodendrocytes için gereklidir.
Bu yazıda, biz basit bir mevcut ve verimli seçimi yöntemi immunomagnetic izolasyonu için sahne üç O4+ preoligodendrocytes hücrelerden yenidoğan fare pups. Bu yöntem Emery vd tarafından bildirilen teknikleri bir değişiklik olduğunu 39 ve Dincman vd. 40

<table><tbody><tr><td>10ml serolojik pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>10ml şırınga Luer-Loc ucu</td><td>BD, Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15ml konik tüpler</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&micro; m hücreli süzgeç</td><td>Fisher Scientific</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>50ml konik tüpler</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5ml serolojik pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>60mm doku kültürü plakaları</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70&mikro; m hücreli süzgeç</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG (H+L) ikincil antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgM (H+L) ikincil antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgM (H+L) ikincil antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-tavuk IgG (H + L) ikincil antikor</td><td>Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>Anti-O4 boncuk- Anti-O4MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin insan</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Autofil komple şişe üstü filtre tertibatı, 0.22um filtre, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1101</td><td></td></tr><tr><td>Autofil komple şişe üstü filtre montaj, 0.22um filtre, 250ml</td><td>ABD Bilimsel</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Sigma</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Büyüme Serumu (BGS)</td> <td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Desoksiribonükleaz I (DNAse I)</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Olympus DP70 kameralı epifloresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>Tüy tek kullanımlık neşterler</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Alman cam lameller, # 1 kalınlık, 12mm çaplı yuvarlak</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antikoru</td><td>Aves</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>İnvitrojen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik ayırıcı stand - MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik ayırıcı-MiniMACS ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0.22 & mikro; m filtre ünitesi</td><td>Millipore SLG033RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı - DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil-sistein (NAC)</td> <td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr> ile Prolong Gold Doğal <tr><td>fare laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal Orta A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Nörotrofin-3 (NT-3)</td> <td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>NG2 antikoru</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Ca2 + ve Mg2 + </td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putresin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Seçim sütunu-LS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Selenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Eser elementler B</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Triiyodotironin (T3)</td> <td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379 B27NBMA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>487.75 mL nörobazal ortam A; 10 mL B27 takviyesi; 1 mL Primosin; 1.25 mL Glutamaks; Filtre, sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın; Kullanana kadar C.</td></tr><tr><td>B27NBMA +% 10 BGS</td><td></td><td></td><td>27 mL B27NBMA; 3 mL Sığır büyüme serumu</td></tr><tr><td>CNTF çözelti stoğu (10 & mikro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Peprotech'ten sipariş verin (450-50). Üreticiye göre 0,1 ila 1 mg / ml'de makyaj yapın s talimatı (partiden partiye değişebilir) tamponda (örn. DPBS +% 0.2 BSA). -80 ° C. 'de saklayın Çalışma çözümü (10 & mikro; g/ml, 1000X) 1. DPBS solüsyonunda% 0.2 BSA (Fisher scientific BP-1600-100) yapın ve filtre sterilize edin. 2. Ana stok alikotunu 10 & mikroya seyreltin; steril g/ml, soğutulmuş %0.2 BSA/DPBS. 3. Aliquot (20&mikro; L / tüp) ve sıvı nitrojen içinde dondurun. 4. Alikotları -80 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>d-Biotin stok çözeltisi (50 & mikro; g/ml; 5000X)</td><td></td><td></td> <td>d-Biotin'i (Sigma-B4639) 50 & mikro'da çift damıtılmış H2O'da yeniden süspanse edin; g / ml (ör. 50 ml ddH2O'da 2.5 mg). Yeniden süspansiyon, makul miktarda ajitasyon / girdap veya 37 ° C'de kısa bir süre hafif ısınma alabilir. D-Biotin hala çözünmüyorsa, daha az konsantre (örn. 10 & mikro; g/ml) ve B27NBMA daha yüksek bir hacim eklemek için (1/5000 yerine 1/1000). 4 derece / C'de saklayın.</td></tr><tr><td>DNase I stok çözeltisi</td><td></td><td></td><td>1. Buz üzerinde soğutulmuş HBSS'de 12.500 U Deoksiribonükleaz I / ml'de çözün. 2. Filtre buzda sterilize 3. Aliquot 200 &mikro'da; l ve gece boyunca -20 ° C. 4'te dondurun. Alikotları -20 ila -30 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (Ca2 + ve Mg2 + olmadan)</td><td></td><td></td> <td>Torbayı 1 Litre suda çözün ve 1 litre ortam başına 9.6 gram toz elde edin. 2-8 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Forskolin stok çözeltisi (4.2 mg / ml; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>Şişedeki 50 mg Forskolin'e (Sigma-F6886) 1 ml steril DMSO ekleyin ve tekrar süspanse olana kadar pipetleyin. 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4.2 mg / ml'ye getirmek için 11 ml steril DMSO ekleyin. Alikot (örn. 20 & mikro; l) ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Hank' Dengeli tuzlar (HBSS) (Sigma</td><td></td><td></td><td>1. 900 ml su ölçün (sıcaklık 15-20 ° C; C) bir silindirde ve hafifçe karıştırın. 2. Gücü ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. 3. Tozun tüm kalıntılarını gidermek için orijinal ambalajını az miktarda su ile durulayın. 4. Adım 2. 5'teki çözüme ekleyin. Son hacmin her litresi için 0,35 gr sodyum bikarbonat (%7,5 a/h) ekleyin. 6. Eriyene kadar karıştırmaya devam edin. 7. Karıştırırken tamponun pH'ını, filtrasyon sırasında yükselebileceğinden, pH= 7.4'ün 0.1-0.3 birim altına ayarlayın. pH. 8'i ayarlamak için 1N HCl veya 1N NaOH kullanılması önerilir. Son hacmi 1L. 9'a getirmek için ilave su ekleyin. 0.22 mikron. 10 gözenekliliğe sahip bir membran kullanarak filtrasyon yoluyla sterilize edin. 2-8 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>İnsülin stok çözeltisi (4000 & mikro; g / ml)</td><td></td><td></td> <td>Şişeyi çözdürün ve alikot 25 &mikro; Mikrosantrifüj tüpü başına l ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Laminin çözeltisi</td><td></td><td></td><td>Laminini soğukta yavaşça çözün (2 derece; C ila 8&derece; C) jel oluşumunu önlemek için. Ardından, polipropilen tüplere alikot. 5 ° C'de saklayın; C ila -20 derece; Alikotlarda C (örn. 20 &mikro; l) ve tekrar tekrar donmayın/çözmeyin. Laminin bu sıcaklıklarda altı aya kadar saklanabilir.</td></tr><tr><td>Manyetik Hücre Sıralama (MCS) Tamponu</td><td></td><td></td><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.2 ve% 0.5 sığır serum albümini (BSA), 0.5 mM EDTA, 5 ve mikro içeren çözeltiyi hazırlayın; g/ml İnsülin, 1 g/L Glikoz. Tamponu 0.22 & mikrodan geçirerek filtreleyerek sterilize edin ve gazdan arındırın; m Millex filtresi. Tamponu 4 ° C'de saklayın; </td></tr><tr><td>N-Asetil-L-sistein (NAC) stok çözeltisi (5mg / ml; 1000X)</td> kullanana kadar C) <td></td><td></td><td>N-Asetil-L-sisteini (Sigma-A8199) DMEM'de 5 mg / ml'de çözün (ör. 10 ml B27NBMA'de 50 mg NAC). Filtre sterilize eder ve alikot (örn. 20 & l). -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>NT3 stok çözeltisi (1 & mikro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Ana stok: < / > Peprotech'ten sipariş verin (450-03). Üreticiye göre 0,1 ila 1 mg / ml'de makyaj yapın s talimatları (partiden partiye değişebilir), tamponda (ör. DPBS +% 0.2 BSA). -80 ° C. Depolama stoğu (1 & mikro; g/ml; 1000X): 1. DPBS çözeltisinde% 0.2 BSA yapın ve filtre sterilize edin. 2. Ana stok alikotunu 1 &mikroya seyreltin; steril g/ml, soğutulmuş %0.2 BSA/DPBS. 3. Aliquot (örn. 20&mikro; L / tüp) ve sıvı nitrojen içinde dondurun. 4. Alikotları -80 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>PDGF stok çözeltisi (10 & mikro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>Ana stok: < / > Peprotech'ten sipariş verin (100-13A). Üreticiye göre 0,1 ila 1 mg / ml'de makyaj yapın s talimatları (partiden partiye değişebilir) tamponda (örn. DPBS) + %0.2 BSA). -80 ° C. Depolama stoğu (1 & mikro; g/ml; 1000X): 1. DPBS çözeltisinde% 0.2 BSA yapın ve filtre sterilize edin. 2. Ana stok alikotunu 1 & mikroya seyreltin; steril g/ml, soğutulmuş %0.2 BSA/DPBS. 3. Aliquot (örn. 20&mikro; L / tüp) ve sıvı nitrojen içinde dondurun. 4. Alikotları -80 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin (1 mg / ml; 100X)</td><td></td><td></td> <td>Poli-D-lizin, moleküler ağırlık 70-150 kD (Sigma P6407) 0.15M borik asit pH 8.4'te 0.5 mg / ml'de (ör. 50 ml borat tamponunda 50 mg). Filtre sterilize eder ve alikot (örn. 100 & mikro; l/tüp). Kullanmadan önce 100X stoğunu (1mg/ml) 50 &°C'de saklayın; steril suda g / ml.</td></tr><tr><td>Oligodendrosit proliferasyon ortamı</td><td></td><td></td><td>bakınız <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Ek Tablo 1</a></td></tr><tr><td>Oligodendrosit farklılaşma ortamı</td><td></td><td></td><td>bakınız <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Ek Tablo 1</a></td></tr><tr><td>Sato eki (100X)</td><td></td><td></td><td>bakınız <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Ek Tablo 1</a></td></tr><tr><td>Referanslar: reaktiflerin ve tariflerin listesi, daha önce Emery ve ark. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Oligodendrosit soy hücrelerinin fare kortekslerinden immünopanning ile saflaştırılması. Soğuk Bahar Harb Protokolü. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) ve Dincman et. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Kortikal fare oligodendrosit öncü hücrelerinin izolasyonu. J Neurosci Yöntemleri. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare birincil oligodendrocytes hızlı ve spesifik immunomagnetic izolasyonu

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Verimli ve sağlam yalıtım ve birincil oligodendrocytes (OLs) kültür olduğunu oligodendroglia gelişimi yanı sıra, multipl skleroz gibi hastalıkların demiyelinizan biyoloji vitro incelenmesi için değerli bir araç ve Pelizaeus-Merzbacher-gibi hastalığı (PMLD). İşte, biz basit bir mevcut ve verimli seçimi yöntemi immunomagnetic izolasyonu için sahne üç O4+ preoligodendrocytes hücrelerden yenidoğan fare pups. Olgunlaşmamış OL teşkil beri fazla bu yalıtım Yöntem sadece sağlar yüksek hücresel verim % 80 Doğum sonrası gün 7, kemirgen-beyin beyaz maddenin (P7), aynı zamanda zaten oligodendroglial soy taahhüt OLs belirli yalıtım, azalan astrocytes gibi bulaşıcı hücreleri ve diğer hücrelerden fare beyin izole imkanı. Bu yöntem daha önce rapor teknikleri bir değişiklik olduğunu ve oligodendrocyte hazırlık saflık yaklaşık 4 h % 80 oranında yukarıda sağlar.

Bu çalışmada O4 için geliştirilmiş yalıtım yöntemini kurmak oldu+ hedef hücreleri en olası manipülasyon gerektiren birincil fare oligodendrocytes. Kaplama coverslips hücrelerinin tüm yordamına ötenazi ve yavrularını üzerinden yaklaşık 4 h alır ve burada gösterilen veriler üç bağımsız deneyler temsil eder. Doku ayrılma sonra ortalama 4.3 ± 0,46 x 107 hücre her bağımsız deneme için % 91'i ± %5,6 canlılığı ile izole edildi. Anti-O4 kullanarak immunomagnetic yalıtım many...

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Bu tekniğin genel amacı, in vitro kültür analizleri için yenidoğan fare yavrularından O4 pozitif oligodendrositleri seçmek için immünomanyetik izolasyon kullanmaktır. Bu yöntem, miyelin ve miyelinasyonu etkileyen hastalıkların incelenmesi ile ilgili sinir bilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yaklaşık bir saatlik saatlerde% 80'den daha büyük bir saflıkta nihai oligodendrosit kültürünün hazırlanmasını kolaylaştırmasıdır.Doğum sonrası beş ila yedi günlük bir farenin kafa derisinin orta hattı boyunca cildi kesmek için küçük diseksiyon makası kullanarak başlayın. Kafatasını ortaya çıkarmak için deri kanadını geri çekin ve kafatasını orta hat boyunca arkadaki açıklıktan ön bölgeye kadar dikkatlice kesin. Kafatasının arkasındaki açıklıktan, kemiğin tabanı boyunca her bir göz yuvasına doğru kesin ve korteksleri orta beyinden nazikçe uzaklaştırmak için ince forseps kullanın.Daha sonra korteksleri yedi mililitre B-27 Neurobazal A Medium içeren 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. Tüm beyinler toplandığında, korteksleri beş mililitre ayrışma tamponu içeren 60 milimetrelik yeni bir doku kültürü kabına aktarın ve korteksleri bir küp milimetrelik parçalara ayırmak için 15 numaralı bir neşter bıçağı kullanın. Beyin parçalarını 37 derece Santigrat derece% 5 CO2 inkübatörde 20 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, enzimatik reaksiyonu durdurmak için bir mililitre Sığır Büyüme Serumu ekleyin. 10 mililitrelik bir Serolojik Pipet kullanarak, doku bulamacını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beyin dokusunu pipetleme ile altı ila sekiz kez nazikçe ayırın. Ayrışmış doku parçalarının iki ila üç dakika oturmasına izin verin.Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, dokulara Sığır Büyüme Serumu ve DNaz I ile takviye edilmiş üç mililitre Nörobazal A Ortamı ekleyin ve dokuları daha fazla pipetleme ile nazikçe ayırmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Gördüğünüz gibi, yüksek canlı hücre verimi sağlamak için uygun pipetleme kuvveti çok önemlidir.Pipetleme çok zorsa, uygulanabilirlik düşük olabilir. Pipetleme çok nazikse, hücresel verim düşük olabilir. Doku parçalarının iki ila üç dakika daha oturmasına izin verin.Daha sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve dokuya Sığır Büyüme Serumu ve DNaz I ile desteklenmiş üç mililitre taze Nörobazal A Ortamı ekleyin. Beyin dokusunu bir P-1000 pipet ucuyla büyük bir doku parçası kalmayana kadar nazikçe ayırın ve kabarcıkları önlemeye dikkat edin. Hücre çözeltisini 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe süzmek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve tek hücreli süspansiyonun son hacmini, Sığır Büyüme Serumu ve DNaz I ile desteklenmiş taze Neurobazal A Ortamı ile 30 mililitreye getirin. Hücre süspansiyonunu iki adet 15 mililitrelik konik tüpe bölün, ve nöral hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.Son beş ila 10 mikrolitre bulutlu süpernatant hariç hepsini çıkarın ve hücrelere Sığır Büyüme Serumu ile takviye edilmiş üç mililitre Neurobazal A Ortamı ekleyin. Hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın ve %10 Sığır Büyüme Serumu içeren taze Neurobazal A Ortamı ile son hacmi 15 mililitreye getirin. Hücre çözeltisini 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe süzün ve son hacmi %10 Sığır Büyüme Serumu içeren taze Neurobazal A Ortamı ile 30 mililitreye getirin.Ardından, filtrelenmiş hücre süspansiyonunu santrifüjleme için iki adet 15 mililitrelik konik tüp arasında bölün. ve hücreleri bir araya getirmeden önce peletleri 2,5 mililitre buz gibi soğuk Manyetik Hücre Sıralama Tamponunda yeniden askıya alın. Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti yedi hücreye bir kez 10 kez 90 mikrolitre taze Manyetik Hücre Sıralama Tamponunda yeniden süspanse edin.Daha sonra, yedi hücreye bir kez 10 kez 10 mikrolitre anti-04 boncuk ekleyin ve hücre çözeltisini hafifçe hafifçe vurarak karıştırın. Dört santigrat derecede 15 dakika sonra, her beş dakikada bir hafifçe vurarak, santrifüjleme ile yıkamak için yedi hücreye bir kez 10'da iki mililitre Manyetik Hücre Sıralama Tamponu ekleyin ve süpernatanı dikkatli bir vakum aspirasyonu ile atın. Peletleri, her bir kez 10 ila yedi hücre için 500 mikrolitre taze Manyetik Hücre Sıralama Tamponunda yeniden askıya alın ve uygun boyutta bir manyetik boncuk sıralama sütununu karşılık gelen manyetik ayırıcısına yerleştirin.Kolonun üzerine 40 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve süzgeci üç mililitre Manyetik Hücre Sıralama Tamponu ile önceden durulayın, kolonun kurumasına izin vermeden tamponun kolondan geçmesine izin verin. Hücreleri süzgecin içine ekleyin, ardından Manyetik Hücre Sıralama Tamponu ile bir mililitrelik yıkama yapın. Kolonu yıkama başına üç mililitre Manyetik Hücre Sıralama Tamponu ile üç kez ve bir kez Oligodendrosit Proliferasyon Ortamı ile yıkayın.Ardından, sütunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve pistonu hemen beş mililitre taze Oligodendrosit Proliferasyon Ortamını kolondan akıtmak için kullanın. Saydıktan sonra, hücreleri uygun bir kaplama yoğunluğuna seyreltin ve laminini, 24 oyuklu bir plakada önceden kaplanmış örtü fişlerinden 100 mikrolitre Oligodendrosit Proliferasyon Ortamı ile değiştirin. Oligodendrositlerin kapak fişlerine yapışmasını teşvik etmek için oligodendrositleri 37 santigrat derecede ve% 5 CO2'de 45 dakikadan daha uzun süre inkübe edin.Ardından, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğunu, 24 saatlik bir inkübasyon için 500 mikrolitre Oligodendrosit Proliferasyon Ortamı ile doldurun. Ertesi gün, süpernatanları Oligodendrosit Farklılaşma Ortamı ile değiştirin ve hücreleri fiksasyon için hazır olana kadar inkübatöre geri koyun. Kaplamadan 24 saat sonra, hücreler, erken evre proliferatif oligodendrositin karakteristik bir özelliği olan Faz Kontrast Mikroskobu altında bipolar veya tripolar görünür.İmmünofloresan Boyama, kaplamadan 24 saat sonra, bu pre-oligodendrositlerin çoğunun ayrıca NG2 ve O4 etiketlemesi gösterdiğini, GFAP ve anti-01 antikoru ile etiketlemenin çok daha az yaygın olduğunu gösterir, bu da hücrelerin çoğunun bu aşamada az sayıda olgunlaşmamış veya olgun oligodendrosit içeren pre-oligodendrositler. 72 saatte, oligodendrosit morfolojisi 24 saatten daha karmaşık görünmektedir ve erken oligodendrosit belirteci NG2 için pozitif çok daha düşük bir hücre frekansı vardır. Ayrıca, çoğu hücre O4 etiketlemesi gösterir ve hücrelerin neredeyse yarısı bu aşamada 01 antikoru için boyanır, bu da hücrelerin daha olgun bir fenotipe farklılaştığını düşündürür.Özellikle, astrositlerin varlığı son derece düşük kalmaktadır. Bu sonuçlar, zamanla, immüno-manyetik olarak izole edilmiş oligodendrositlerin, astrositler gibi diğer hücre tiplerinin çok az kontaminasyonu ile in vitro olarak olgunlaşmanın Üçüncü Aşamasına farklılaşabildiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, immünomanyetik izolasyon kullanarak yenidoğan fare yavrularından primer oligodendrositlerin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde tamamlanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde iyi şanslar.

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması kullanarak fare yavrusu beyinlerinden mikroglia da dahil olmak üzere CD11b hücrelerini izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin dokuları, anti-CD11b antikor kaplı mikro boncuklarla inkübe edilen tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için homojenize edilir, ardından CD11b+ hücre popülasyonunu saflaştırmak için manyetik sütun bazlı bir ayırma yapılır.

Mikroglia'nın Fare Yavrusu Beyinlerinden Manyetik İzolasyonu

Bu video, fare yavrusu beyin korteksinden oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir tekniği göstermektedir.

Fare Yavrusu Beyin Korteksinden Oligodendrosit Öncü Hücrelerinin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Bu video, manyetik ayırma kullanılarak bir fare yavrusundan elde edilen bir nöral hücre süspansiyonundan birincil oligodendrosit hücrelerini izole etmek için bir yöntemi göstermektedir. Teknik, oligodendrosit antijenlerine özgü antikorlarla kaplanmış manyetik boncuklar kullanır ve bu hücrelerin seçici izolasyonunu sağlar.

Murin Primer Oligodendrositlerinin İmmünomanyetik Boncuklar Kullanılarak İzole Edilmesi

Bu video, manyetik hücre sıralama kullanarak fare beyinlerindeki demiyelinizan lezyonlardan mikroglial hücrelerin çıkarılması için bir protokolü göstermektedir. Protokol, mikroglial hücreler içeren lezyonlu beyin dokusunun diseksiyonunu, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için dokunun spesifik enzimlerle tedavi edilmesini ve mikroglial hücreleri izole etmek için mikroglial reseptöre özgü manyetik boncukların kullanılmasını içerir.

Manyetik Aktif Hücre Sıralaması Kullanılarak Fare Beyni Demiyelinizan Lezyonlarından Mikroglia'nın İzole Edilmesi

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Öğrenin fare birincil oligodendrositlerinin hızlı ve spesifik immünomanyetik izolasyon yöntemini. Bu teknik, miyelinasyon ve demiyelinizan hastalıkların in vitro araştırmalarında yüksek saflıkta hücre elde edilmesini sağlar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Daha fazla video keşfet