Name: Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Öğrenin, fare CD8 T hücrelerini yüksek verimli transdüksiyon ile genişletme yöntemini. Bu teknik, otoimmün hastalıklar ve kanser tedavisinde fonksiyonel antijen-spesifik hücre üretimi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B ve SRA-2-S-2018-648-S-B, Diyabet Eğitim ve Eylem Ödülü ve Baylor College of Medicine'de Moleküler Tıp Araştırma Caroline Wiess Hukuk Fonu tarafından desteklenmiştir. Hücre sıralama nih (S10RR024574 ve P30CA125123) finansmanı ile Baylor Tıp Koleji'nde Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdek tarafından desteklendi. Tüm peptid-MHC tetramerleri NIH Tetramer Çekirdek Tesisi'nden elde edilmiştir.

<ol><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li>
<li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove%3A+theory+becomes+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li>
<li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li>
<li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4%2B+T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected%2C+weak+binding+register%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II%3Apeptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li>
<li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li>
<li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li>
<li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li>
<li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnstone%2C+A+%22Immunochemistry+in+practice%22">Immunochemistry in practice</a>. , 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).</li>
<li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRowland-Jones%2C+SL+%22Lymphocytes%3A+a+practical+approach%22">Lymphocytes: a practical approach</a>. , 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li>
<li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li>
<li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701(2013).</li>
<li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li>
<li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li>
<li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li>
<li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li>
<li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+%28DELFIA%29+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunoassay+%26+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li>
</ol>

MAb287 ve türevleri 2014 yılında çıkarılan bir ABD patenti ile korunmaktadır.

Bu protokol retroviral transdüksiyon ile antijene özgü CD8 CAR-T hücreleri üretmek için etkili bir yöntem açıklar. Protokolümüzün transdüksiyon verimliliği genellikle yüksektir ve CAR'ın sağlam ifadesi genellikle gözlenir. Genişletilmiş CAR T hücreleri üst-aktive T hücrelerinin temel özelliklerini korumak, ve antikor özgüllüğü, ve in vitro ve in vivo kullanım için hem uygundur. Biz NOD farelerde Tip 1 Diyabet yeniden programlanmasında Ab-CAR CD8 T hücreleri uyguladık7.
...

İstenmeyen hedef dışı etkilerin olası azaltılmış risk göz önüne alındığında, antijene özgü immün tedaviler (ASI) T1D gibi otoimmün hastalıklar için umut verici tedaviler vardır. Kanıt birikmesi( prepro)insülin immün yanıtların T1D 1'de özellikle önemli olabileceğini düşündürmektedir. Son on yılda, bizimki de dahil olmak üzere birden fazla gruptan yapılan çalışmalar, belirli MHC sınıf II molekülleri (B:9-23/MHCII) tarafından 9 ila 23 arasında insülin B zinciri amino asitleriçeren bir epitopun sunumunun T1D'nin gelişiminde önemli bir rol oynadığını kuvvetle göstermektedir. fareler ve insanlar2,3,4,5. Seçici B:9-23/MHCII kompleksi hedef için, biz bir monoklonal antikor üretti, mAb287 adlı, hormon insülin veya kompleksleri diğer peptidler içeren çapraz reaktivite vardır6. MAb287 bloklar antijen sunum in vitro, ve pre-diyabetik NOD fareler için mAb287 haftalık uygulama tedavi farelerin% 35 T1D gelişimini geciktirdi6. In vivo antijen sunumengellemek için, sık enjeksiyonları genellikle yüksek sirkülasyon konsantrasyonu korumak için gereklidir. Biz t hücreleri yeniden programlamak için Ab287 yüksek özgüllük yararlanarak bu zorluğun üstesinden gelebilir hipotez, böylece T1D için geliştirilmiş bir antijen-spesifik T hücre tedavisi sağlayan7.
Sitotoksik T hücrelerinin biliş likörlerinin tek bir kopyası bile8,9,10olarak ifade edilirse hedeflerini öldürebildiği bildirilir. Böylece, B:9-23/MHCII spesifik CD8 T hücrelerinin, etkisini uygulamak için aynı APC'de birden fazla komplekse bağlanması gereken ana antikordan daha istenmeyen antijen sunumunu ortadan kaldırmada daha yüksek verimliliğe sahip olması beklenmektedir. CAR T hücreleri birden fazla insan kanseri tedavisinde kullanılmıştır11,12,13, ve aynı zamanda otoimmünite etkili olabilir14. Ancak, patojenik peptid-MHC kompleksleri için özgüllüğü olan CAR-T hücreleri şimdiye kadar T1D ilerlemesini değiştirmek için kullanılmamıştır. Aşağıda açıklanan en iyi şekilde optimize edilmiş CD8 T hücre transdüksiyon tekniğini kullanarak, son zamanlarda bunun gerçekten uygulanabilir bir yaklaşımı temsil ettiğini nispatinin kanıtını gösterdik7.
Bu protokolde, verimli ve modern bir transdüksiyon ve genişletme yöntemini özetliyoruz. Protokolümüz yüksek verimlilikte fare CD8 CAR T hücrelerinin oluşumunu gerektiren diğer çalışmalar için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol (50mM)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>50 & mu; M</td></tr><tr><td>5' RACE PCR</td><td>Clontech</td><td>634859</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare CD28 antikorları</td><td>eBioscience</td><td>14-0281-86</td><td>1 & mikro'da son konsantrasyon; g / ml</td></tr><tr><td>anti-fare CD3e antikoru</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>1 & mikro'da son konsantrasyon; g/ml</td></tr><tr><td>Biotin Sıçan Anti-Fare IFN-&gama;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td>0,5 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; g/ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Endo-free Maxi-Prep kiti</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>Final 50 & mikro; g/ml'dir.</td></tr><tr><td>Isı ile etkisiz hale getirilmiş FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.03</td><td>Final %10 FCS</td></tr><tr><td>HEPES (100X)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>1X</td></tr><tr><td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td><td>NIH tetramer Tesisi Emory'de</td><td>onay başına</td><td>6 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; g/ml</td></tr><tr><td>IAg7-insülin P8E tetramer-BV421</td><td>NIH tetramer Tesisi,</td><td>onay başına</td><td>Emory'deki Tesis, 6 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; g / ml</td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum-Etanolamin (ITS 100x)</td> <td>ThermoFisher</td><td>51500056</td><td>Son konsantrasyon 1x</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Ayırma Tamponu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Fare CD8a+ T Hücre İzolasyon Kiti</td><td>Miletenyi Biotec Inc</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Fare CD8a+ T Hücre İzolasyon Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM orta</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (5000U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15070063</td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td>Phoenix-ECO hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>pMIG II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-GFP II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare IFN-&gama;</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td>3 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; g / ml</td></tr><tr><td>Kırmızı hücre lizis tamponu</td><td>Sigma</td><td>R7767</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin</td><td>Takara</td><td>T100A</td><td>50 & mikro'da çalışma konsantrasyonu; PBS rhIL-2'de g / ml</td></tr><tr><td>(stok konsantrasyonu 105 IU / ul)</td> <td>Peprotech</td><td>200-02</td><td>200 IU / ml</td></tr><tr><td>rmIL-7'de nihai konsantrasyon (stok konsantrasyonu 50ng / ul)</td> <td>R & D</td><td>407-ML-005</td><td>0.5ng / ml RPM'de nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril Hücre Süzgeçleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Tryple</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr></tbody></table>

otoimmün diyabet modelinde fonksiyonel testler için antijene Özgü primer fare sitotoksik t hücrelerinin yüksek verimli Üretimi

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Tip 1 Diyabet (T1D) beta hücre yıkımı ve insülin üretiminin mutlak kaybına yol açan adacık spesifik otoimmünite ile karakterizedir. Spontan obez olmayan diyabet (NOD) fare modelinde, insülin birincil hedeftir ve tek bir anahtar insülin epitop kaldırmak için bu hayvanların genetik manipülasyon hastalığı önler. Bu nedenle, bu patojenik epitop taşıyan profesyonel antijen sunan hücrelerin seçici ortadan kaldırılması (AKO'lar) istenmeyen insülin spesifik otoimmün yanıtları inhibe etmek için bir yaklaşımdır, ve büyük olasılıkla daha büyük çeviri potansiyeline sahiptir.
Şimerik antijen reseptörleri (CAR) seçici hastalık neden antijenleri hedef T hücreleri yönlendirebilirsiniz. Bu teknik, birden fazla kanser tedavisinde benimseyen hücre tedavisi için hücresel mühendislik kullanmak için son girişimleri için temeldir. Bu protokolde, düşük sayıda naif hücreden başlayarak yüksek sayıda fonksiyonel antijene özgü CD8 CAR-T hücresi üreten optimize edilmiş bir T-hücre retrovirüsü (RV) transdüksiyonu ve in vitro genleşme protokolünü açıklıyoruz. Daha önce birden fazla CAR-T hücre protokolü tanımlanmıştır, ancak genellikle transdüksiyon sonrası nispeten düşük transdüksiyon verimliliği ve hücre canlılığı ile. Buna karşılık, protokolümüz %90'a kadar transdüksiyon verimliliği sağlar ve üretilen hücreler iki haftadan fazla invivo hayatta kalabilir ve tek bir infüzyon dan sonra hastalığı önemli ölçüde geciktirebilir. Kritik adımların kolayca izleilebilmeleri için hücre bakım ve transdüksiyon protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Birincil hücre yalıtımından CAR ifadesine kadar tüm işlem 14 gün içinde gerçekleştirilebilir. Genel yöntem, hedefin bilindiği herhangi bir fare hastalığı modeline uygulanabilir. Benzer şekilde, spesifik uygulama (patojenik peptid/MHC sınıf II kompleksini hedeflemek) önemli bir kompleksin tanımlandığı diğer otoimmün hastalık modelleri için de geçerlidir.

Genellikle, bu protokolü kullanarak transdüksiyon verimliliği ~ 60-90%. Şekil3'te gösterilen deneyde, sıralamadan önce, CD8 T hücrelerinin yaklaşık p'i GFP ile birlikte ifade edilir. Ayrıca CD28 ve CD3 (Şekil3C)ile birlikte ifade edilirler. Daha da önemlisi, tüm "test" GFP+ hücreleri de IAg7-B:R3 tetramer ile eş-lekeli, ancak kontrol tetramer ile değil (Şekil4). Benzer şekilde, ...

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Bu protokol, otoimmün hastalıkların tedavisinde istenilen güvenli bir yaklaşım olan fonksiyonel antijene özgü T hücrelerinin çok sayıda oluşturmanızı sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, size çok verimli bir transdüksiyon süreci ve çok sayıda fonksiyonel T hücresi sağlamasıdır. Bu teknik tip 1 diyabet ve antijenlerin bilindiği diğer otoimmün hastalıkların tedavisinde genişletilebilir.Ayrıca, CAR T hücreleri kanser belirli türleri için umut verici bir tedavi olabilir. Bu yöntem, diğer CAR ifade bağışıklık hücreleri oluşturmak için kullanılabilir. İyi kabul edilen bir teknik olması, tüm protokolü okuması ve tüm denemeyi önceden planlaması önemlidir.Bu iki haftalık uzun protokol mini adımlar içerir ve başarı her adımın uygun performansbağlıdır. Bu yöntemin görsel gösterimleri, öğrencilerin doğru şekilde izlemeleri için çok önemlidir. Makalede açıklandığı gibi transfeksiyon için Phoenix hücreleri hazırlayın.Hücrelerin uçmasını en aza indirmek için ortamın eklendiği ve kaldırılacağı yan duvarı işaretlemek iyi bir uygulamadır. Gün sıfır hücrelerden supernatant aspire ve PBS beş mililitre ile yıkayın. Dikkatlice plakayan duvara azaltılmış serum orta damla yedi mililitre ekleyin ve kuvöz geri hücreleri aktarın.İki 14 milimetre yuvarlak alt polipropilen tüpler için azaltılmış serum orta 1,5 mililitre ekleyin. Tüplerden birine 40 mikrometre transfeksiyon reaktifi ve 15 mikrogram antikor yönlendirilmiş CAR plazmidini ve beş mikrogram ambalaj plazmidini diğerine ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın ve sonra plazmid tüpüne transfeksiyon reaktifi ekleyin.Çözeltiyi üç kez yukarı ve aşağı boruyla hafifçe karıştırın ve en az 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Phoenix hücrelerine karışımın üç mililitre ekleyin ve bir doku kültürü kuluçka yerleştirin. Dört ila beş saat sonra hücrelere fcs bir mililitre ekleyin ve kültür onları bir gecede 37 santigrat derece.Ertesi gün, hücrelerden supernatant çıkarın ve taze önceden ısıtılmış kültür ortamı dört mililitre ekleyin. Phoenix hücrelerinden orta içeren virüs toplayarak ve artık hücre enkaz kaldırmak için filtreleme tarafından ikinci gün virüs Hasat. Mililitre başına 200 uluslararası birim son konsantrasyon için virüse rekombinant insan IL-2 stok ekleyin ve transdüksiyon için hemen kullanabilirsiniz.Phoenix hücrelerine dört mililitre taze ortam ekleyin ve bir gecede kuvöze yerleştirin. İkinci bir transdüksiyon için ertesi gün virüs toplama tekrarlayın ve hücreleri atın. Bir gün önce murine CD8 T hücreleri tohumlama, bir anti-fare CD3 ve CD28 antikorların karışımı bir mililitre ekleyin 24 iyi plaka her iyi ve dört derece Santigrat gecede plaka kuluçka.Gün sıfır, hasat fare dalak ve buz üzerinde bir hücre kültürü çanak PBS 10 mililitre sırılsıklam bir hücre süzgeci üzerine koyun. Bir hücre kültürü başlık olarak, üç ila beş parçaya her dalak kesilmiş ve tel örgü ile doku basın için bir şırınga steril bir piston kullanın. Splenositleri 1-4 seyreltilmiş kırmızı hücre lisis tamponunda yeniden sulandırarak ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatarak kırmızı kan hücrelerini nazikçe çıkarın ve hücre sayımı için Trypan Blue ile hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini seyreltin.Ve yedi dakika boyunca 350 kez g santrifüj ederek hücrelerin geri kalanı pelet. CD8 T hücrelerini zenginleştirmek ve hücre peletlerini 400 mikrolitre tamponda, 100 mikrolitre biotin antikor kokteyli ile bir kere10'dan sekizinci hücrelere kadar askıya almak için bir fare CD8 T hücre izolasyon kiti kullanın. Hücre süspansiyonuna iyice karıştırın ve antikor bağlanmasıiçin dört santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra etiketleme tampon 300 mikrolitre ve 8 hücreleri için bir kez 10 başına Anti-Biotin MicroBeads 200 mikrolitre ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve 4 santigrat derecede 10 dakika daha kuluçkaya yatırın. Bu arada, ayırıcı üzerinde bir ayırma sütunu ayarlayın ve etiketleme arabellek üç mililitre ile yıkayın.Bir sütunun üstüne 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci koyun ve bir mililitre boncuk ve hücre karışımını süzgeçten ayırma sütununa geçirin. Önceden itil 15 mililitrelik bir tüp içine akışı toplamak ve aynı tüp içine atık toplama, üreticinin talimatlarına göre sütun yıkayın. Hücreleri sayın ve beş dakika boyunca 350 kez g santrifüj ile toplayın.Tekrar t hücreli orta ve santrifüj iki mililitre ile yıkayın. Daha sonra mililitre başına 250, 000 ila 500, 000 hücre konsantrasyonu ile önceden ısıtılmış T hücre orta onları yeniden askıya. Önceden hazırlanmış CD3 ve CD28 antikor kaplı plakaları bir mililitre steril PBS ile üç kez yıkayın ve her kuyuya iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Hücreleri eşit olarak dağıtmak için dönen bir hareket kullanın. Bir kontrol olarak, plaka tek bir kaplamasız kuyu içine CD8 T hücreleri aynı sayıda plaka plaka ve 48 saat boyunca% 10 karbondioksit gaz tankı kuluçka 37 derece santigrat hücreleri kuluçka. İlk gün, 24 kuyulu bir plakanın kuyularına 0,5 mililitre fibronektin ekleyerek ve gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatarak insan fibronektin parçalı kaplamalı plakalar hazırlayın.Ertesi gün, fibronektin çözeltisi kaldırmak ve iyi başına% 2 BSA ve PBS bir mililitre ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın ve tedavi edilen kuyuları bir mililitre steril PBS ile yıkayın. Plaka yıkama çözeltisi çıkardıktan sonra kullanıma hazırdır.Trypan Blue kullanarak etkinleştirilen CD8 T hücrelerini sayın. Santrifüj ile toplayın. Ve onları mililitre başına 5 milyon canlı hücrede yeniden uzaklaştırArak transdüksiyon için.Fibronectin kaplı plakanın her kuyuya aktif CD8 hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra orta içeren daha önce hazırlanmış virüs 1,5 ila iki mililitre ekleyin ve eşit hücreleri dağıtmak için dönen bir hareket kullanarak karıştırın. Plakayı Ziploc çantasına kapatın ve 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca 2,000 kez g'de santrifüj edin.Plakayı santrifüjden çıkarın ve biyolojik bir güvenlik kabinine götürün. Plastik poşeti dikkatlice çıkarın ve plakanın dışının orta ile kirlenmediğinden emin olun. Plakayı 37 santigrat derece karbondioksit kuvöze aktarın.Dört saat sonra, her kuyudan bir mililitre orta yıkın, önceden ısıtılmış tam T hücreli ortamın bir mililitresini değiştirin ve plakayı kuvöze geri koyun. Bu protokolün kritik yönleri yüksek bir titre virüs, sağlıklı aktif T hücreleri ve uygun transdüksiyon yöntemidir. Hücreler, akım sitometrik analizi için PE boyutu yedi konjuge anti-CD8, AF647 konjuge anti-CD3 ve BV 421 konjuge anti-CD28 ile birlikte boyandı.Yaklaşık olarak, CD8 T hücrelerinin yaklaşık %70'i CAR ekspresyonunu gösteren GFP'yi birlikte ifade eder. Ayrıca CD28 ve CD3'ün ortak ifadesini de verdiler. Daha da önemlisi, test GFP pozitif hücrelerin tüm i-Ag7 insülin BR3 tetramerleri ile eş-lekeli hücre yüzeyinde CAR ifade gösterir ama kontrol tetramer ile değil.Ayrıca, sıralanmış test ve kontrol CAR T hücreleri her transduced hücrelerin bir CD8 efektörü T hücre fenotip ana antikorların hedefe yönelik olduğunu doğrulayan onların cognate ligands ifade hedef hücreleri ile coculture sonra interferon gama yüksek düzeyde salgılanan. Virüs üretici hücrelerinin transdüksiyonu, birincil CD8 T hücrelerinin izole edilmesi ve bu T hücrelerinin aktivasyonu bu deneyin en önemli adımlarıdır. Sağlıklı aktive T hücrelerinin olması ve uygun reaktifler ile bu T hücrelerinin transdüksiyon olumlu sonuçlar sağlar.Bu yöntem diğer T hücrelerini nakletmek için kullanılabilir, ancak belirli T hücre türü için özelleştirilmelidir. Bu protokol antijene özgü şimerik antijen reseptör T hücre tedavisi ile tip 1 diyabetin önlenmesi için önünü açar.

high-efficiency-generation-antigen-specific-primary-mouse-cytotoxic-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Fonksiyonel T-hücre deneylerinde antijen kaynağı olarak kullanılacak insan doku özleri hazırlamak için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku-türetilmiş antijenleri ile T-hücresi yanıtı ölçülmesine imkan...

Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı

Video, sitotoksik T lenfositlerinde veya CTL yanıtlarında immünodominansı test etmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Enjekte edilen floresan hedef hücreler, immünojenik epitoplara karşılık gelen değişen floresan sergiler. Dalak sonrası toplama ve sınıflandırma, yüksek yoğunluklu floresan hücrelerde bir azalma olduğunu ortaya koyarak CTL yanıtlarında immünodominansı doğrular.

Sitotoksik T Lenfosit Yanıtlarında İmmün Baskınlığı Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu video, retroviral transdüksiyon yoluyla antijene özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için bir tekniği göstermektedir. Aktive edilmiş murin CD8 + T hücreleri, rekombinant fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir mikrokuyu plakasına eklenir. Antijene özgü bir kimerik antijen reseptörünü (CAR) kodlayan transgenik RNA içeren retroviral vektörler daha sonra sokulur ve transdüksiyonu kolaylaştırmak için plaka santrifüjlenir. İnkübasyondan sonra, transdüksiyon hücreleri...

Antijene Özgü CAR T Hücrelerinin Üretilmesi için Bir Teknik

Bu videoda, obez olmayan diyabetik immün yetmezliği olan bir fareye nakledilen lusiferaz eksprese eden beta hücrelerini görselleştirmek için görüntüleme tabanlı bir yöntem gösterilmektedir. Diyabetik bir fareden splenositlerin eklenmesi, substrat girişinden sonra azalan lüminesans ile görsel olarak doğrulanan ilerleyici beta hücre yıkımına yol açar.

Diyabetik Splenositlerle Mücadele Edilen İmmün Yetmezliği Olan Bir Farede Transgenik Beta Hücrelerinin Görüntülenmesi

Biz adacık antigen spesifik primer CD4 + T-hücrelerinin adoptif transfer yoluyla, iki hafta içinde farenin tip 1 diyabet (tip 1 diyabetin) ikna etmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.

Diyabetojenik CD4 Kabul edilmiş Transfer ile Farelerde Hızlandırılmış Tip 1 Diyabet İndüksiyon + T Hücreleri

Burada, bir murin modelinde otoimmün artritin immünoterapisi için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) fonksiyonel antijene (Ag) özgü düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) geliştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Açıklanan antijenik liposomal nano tanecikleri ve kullanımları uyarıcı B-hücre harekete geçirmek vitro ve in vivohazırlıktır. Tutarlı ve güçlü antikor yanıt-e doğru yeni bir fıstık alerjisi model gelişmesine yol açtı. Antijenik lipozomlar oluşturmak için protokol farklı antijenleri ve bağışıklama modeller için genişletilebilir.

Antijenik lipozomlar hastalığa özgü antikorların üretimi için

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Bu protokol, spontan diyabetik NOD farelerinden saflaştırılmış splenositlerle mücadele eden obez olmayan diyabetik (NOD)-şiddetli kombine immün yetmezlikli farelerde NIT-1 hücrelerinin nakli ve görüntülenmesi için basit ve minimal invaziv bir yöntemi tanımlamaktadır.

Farelerde Otoimmün Diyabetin Evlat Edinilen Transfer Modelinde Greft Sağkalımının Biyolüminesan İzlenmesi

Öğrenin, fare CD8 T hücrelerini yüksek verimli transdüksiyon ile genişletme yöntemini. Bu teknik, otoimmün hastalıklar ve kanser tedavisinde fonksiyonel antijen-spesifik hücre üretimi için kullanılır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Daha fazla video keşfet