Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma
9 Mayıs 2020
Bu protokolde, clusterin'in hasta kaynaklı GCSC'lerin sapı üzerindeki etkisini incelemek için koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşum testini kullanarak deneysel bir tasarım salıyoruz. Protokol, farklı CSC türlerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo fonksiyonlarını incelemek için kolayca uyarlanabilir.
Kanser kök hücreleri ilaç direnci kanser relaps metastazı karıştığı. Bu protokol kanser kök hücrelerinde anahtar genlerin işlevlerini araştırmak için etkili bir yöntem sağlar. Koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşumu tetkik kullanılarak, bu yöntem kanser kök hücrelerinin farklı türlerinde köklüğe bağlı genler üzerinde in vitro ve in vivo fonksiyonları incelemek için kolayca uyarlanmıştır.
Prosedürü gösteren, Yuting Li ve Xiangyu Tan, benim laboratuvar araştırma asistanları olacaktır. Lentivirüs parçacıkları oluşturmak için, tohum dört milyon 293T lentiviral ambalaj hücreleri 100 milimetre Petri çanak dmem 10 mililitre ile içine% 10 FBS ile desteklenmektedir. Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın, transfeksiyon gününde hücrelerin %50 ila %80 oranında etkili olduğundan emin olun.
Azaltılmış serum ortamını oda sıcaklığına getirin ve el yazması talimatlara göre A ve B tüplerini hazırlayın. Tüp A içeriğini tüp B.Mix iyi ekleyin ve lipid-DNA kompleksleri hazırlamak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tüp kuluçka. Hücre kültür çanağı orta beş mililitre çıkarın.
Sonra hücre kültürü çanak içine lipid-DNA kompleksi beş mililitre ekleyin akıllıca bırakın ve yavaşça çanak girdap. Kültür yemeğini 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra transfeksiyon ortamını dikkatlice çıkarın ve %10 FBS ile takviye edilmiş 10 mililitre önceden ısıtılmış DMEM ile değiştirin.
Hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Yaklaşık 48 saat sonra transfeksiyon, hasat 10 mililitre lentivirus supernatants içeren ve hücresel enkaz kaldırmak için 0,45 mikrometre dökmek filtre ile filtre. Tüm hücre kültürü damarları, ipuçları, filtreler ve şırıngalar lentivirus içerebilir ve imha edilmeden önce %10 çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.
Netleştirilmiş bir supernatant'ı steril bir konteynere aktarın. Lenti-X konsantratörü ekleyin ve nazik inversiyon ile karıştırın. Karışımı bir gecede 4 derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, numuneyi 1500 kez G'de 45 dakika 4 5 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin. Dikkatle alt pelet rahatsız değil dikkat, supernatant çıkarın. Peleti %10 FBS ile desteklenen bir mililitre DMEM'de yavaşça yeniden askıya alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Tohum 6 milyon mide kanseri kök hücreleri veya GCSC 100 milimetre Petri çanak içine DMEM 10 mililitre ile 10% FBS ile desteklenmektedir. Kültür 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 24 saat boyunca hücreleri. Hücreler %70 ila %80 birleştiğinde, çanaktan ortayı aspire edin ve Polibren reaktifi içeren dört milimetrelik tam DMEM ortamıyla seyreltilmiş konsantre lentiviral partikülleri ekleyin.
Hücreleri 18 saat boyunca kuvöze geri ver. Polibren etkili konsantrasyonu belirlemek için farklı koşullarda test edilmelidir, hangi mililitre başına iki ila 10 miligram aralığında genellikle. 18 saat sonra, orta yı 10 mililitre DMEM ile %10 FBS değiştirin ve hücreleri 24 saat boyunca kuvöze geri verin.
Sonra, hücre enkaz ile supernatant aspire ve taze DMEM ekleyin 10% FBS ve Puromisin mililitre başına 2.5 mikrogram ile takviye. Hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Daha sonra, taze DMEM için tekrar orta değiştirin 10% FBS ve mililitre Puromisin başına beş mikrogram ile takviye.
Başka bir 24 saat kuluçka sonra, kalsiyum ve magnezyum olmadan DPBS beş mililitre ile iki kez yapışkan GCSCs durular. Hücreleri bir mililitre önceden ısıtılmış hücre ayrıştırma çözeltisi ile ayırın ve 37 santigrat derecede 2-3 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, hücre süspansiyon taze önceden ısıtılmış GCSC tam kültür orta beş mililitre ekleyin.
Kriyopreservation için 15 mililitrelik centrifuge tüp içine bu süspansiyon üç mililitre dağıtın, ve dioksisiklin ile indüksiyon için başka bir tüp içine diğer üç mililitre. Her iki tüpü de 800 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Daha sonra, tüp B supernatant aspire ve taze önceden ısıtılmış GCSC tam kültür ortamı bir mililitre hücreleri yeniden askıya.
Yeni bir 100 milimetre petri kabına uygun sayıda hücreyi 10 mililitre taze önceden ısıtılmış GCSC tam kültür ortamı ve mililitre doksisiklin başına 2,5 mikrogram içeren tohum. Sonra, 48 saat boyunca çanak kuluçka. 10 mikrolitrelik bir hücre örneğinin yoğunluğunu belirlemek için otomatik bir hücre sayacı kullanın.
Daha sonra, mililitre başına 20.000 canlı hücre konsantrasyonu elde etmek için önceden ısıtılmış GCSC tam kültür ortamı ile hacmi ayarlayın. Yeni, ultra düşük eki 96 iyi kültür plakasının her kuyuya hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini dağıtın. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Küre oluşumu 3-10 gün içinde meydana gelmelidir. Görüntü tümör küre oluşumu her iki günde. Primer insan gastrik adenokarsinommide mide kanseri kök hücreleri serumsuz kültür ortamında kültürlendi.
Altı gün sonra hücreler fenotip gibi tek hücreli hücreden geniş kürelere doğru genişledi. GCSC'lerde clusterin'in işlevini değerlendirmek için, clusterin'e karşı kısa saç tokası RNA dizileri Tet-GV307-RFP-Puro vektörüne klonlandı. Ekspresyon vektörü ile transfected hücreler 48 saat boyunca doksisiklin ile tedavi edildi.
Daha sonra, clusterin ifadesi Batı leketarafından doğrulandı ve densitometri ile ölçüldü. GCSC'lerde doksisiklin varlığı ve kümenin yıkılması tümör küresi oluşumunu inhibe etti. Şifreli shRNA kontrolleri ile transekte olan hücrelerde tümör küresi oluşumunda inhibisyon gözlenmezken, doksisiklinin tek başına tümör küre oluşumunu engellemediğini göstermektedir.
Bu sonuçlar, kümelerin susturulmasından sonra GCSC'lerin yavaş büyüdüğünü ve tümör küreleri oluşturamayacaklarını göstermektedir. Bu verilere dayanarak, clusterin GCSCs kendi kendine yenileme aktivitesi teşvik kritik bir rol oynar, mide kanseri hastalarında kanser kök hücrelerini bastırmak için umut verici bir ilaç hedefi olabileceğini belirten. Tümör küreleri bireysel veya birleştirilmiş hücreler üzerinde katı yuvarlak yapılar olmalı, tümör küreleri olarak kabul edilmemelidir.
Ancak, bazı kanser kök hücreleri tipik tümör küre yapıları oluşturmayabilir. Bu prosedür, in vitro yenilenebilir potansiyel için kanser kök hücre incelemek için diğer yöntemler ile takip edilebilir. Örneğin, köklüğe bağlı belirteçlerin ekspresyonu incelenebilir.
Protokol, kanser kök hücrelerindeki kritik genlerin sağkalımda köklük gibi işlevlerini incelemek için genişletilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, koşullu bir silme sistemi ve adapte edilmiş bir küre oluşum testi kullanarak, hasta kaynaklı GCSC'lerin köklüğü üzerindeki clusterin etkisini incelemek için deneysel bir tasarım sunar. Bu, çeşitli kanser kök hücrelerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo çalışmaları için kolayca uyarlanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kanser Biyolojisi
- Kök Hücre Araştırması
- Gen Fonksiyon Analizi
Arka Plan
- Kanser kök hücreleri (CSC'ler) kanserin nüksetmesine ve metastazına katkıda bulunur.
- CSC'lerdeki belirli genlerin rolünü anlamak, hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- Bu protokol, clusterin genine ve köklüğe olan etkisine odaklanır.
- Yöntem, farklı kanser türlerinde esnek bir şekilde uygulanmaya izin verir.
Çalışmanın Amacı
- Hasta kaynaklı GCSC'lerin köklüğünde clusterin'in rolünü araştırmak.
- Köklüğe bağlı genleri incelemek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- CSC biyolojisi ve potansiyel terapötik hedefler hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Gen susturma için koşullu silme sistemi.
- Köklüğü değerlendirmek için adapte edilmiş küre oluşum testi.
- In vitro ve in vivo deneysel tasarımlar.
- Gen tesliminde lentiviral partiküllerin kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Lentivirüs partiküllerinin üretilmesi prosedürünü gösterdi.
- GCSC'ler üzerindeki clusterin etkileri hakkında bilgiler sağladı.
- Yöntemin çeşitli CSC türleri için uyarlanabilirliğini gösterdi.
- Köklüğe bağlı genleri incelemenin önemini vurguladı.
Sonuçlar
- Protokol, kanser kök hücrelerinde clusterin'in rolünü incelemek için etkilidir.
- Farklı kanser kök hücre türleri için uyarlanabilir.
- Bu araştırma, kanser tedavi stratejileri hakkında yeni bilgilere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of stemness-associated genes in patient-derived gastric cancer stem cells, supporting target validation in oncology discovery. By combining conditional knockdown with an adapted sphere formation assay, it provides quantitative, reproducible readouts for assessing gene function in cancer stemness pathways. The approach enhances predictive confidence in early-stage target selection and portfolio prioritization for gastric cancer therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking clusterin knockdown to reduced sphere formation, clarifying its role in GCSC self-renewal.
- Operational Value: Enables functional target validation through inducible, reversible gene silencing in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports preclinical go/no-go decisions by demonstrating that clusterin inhibition impairs tumorigenic potential in vitro.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable sphere formation metrics suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Uses lentiviral delivery and puromycin selection to ensure consistent knockdown efficiency across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, enabling parallel testing of multiple genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses patient-derived gastric cancer stem cells, maintaining phenotypic fidelity to human tumor biology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro stemness assessment with potential in vivo validation of clusterin as a therapeutic target.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic evidence to prioritize clusterin in preclinical pipelines targeting cancer stem cell-driven relapse and resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling target validation after initial hit identification and before lead optimization in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking gene knockdown to functional stemness outcomes via sphere formation.
- Screening: Generates quantitative, imaging-based readouts that can be automated for compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Enables densitometric analysis of Western blots and sphere quantification for objective comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Connects in vitro stemness phenotypes to potential in vivo models through conserved assay adaptability.
- Enterprise Reuse: The conditional knockdown-sphere formation platform is reusable across stemness-associated genes and cancer types beyond gastric cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stemness gene function through inducible, reversible knockdown in primary-derived cells.
- Operational Value: Standardizes stemness assessment via sphere formation, improving inter-lab reproducibility and assay transferability.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection by providing causal evidence linking gene suppression to loss of tumorigenic potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets like clusterin based on functional validation in patient-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral production, cell culture, and molecular biology techniques including transfection and selection.
- Depends on access to ultra-low attachment plates, automated cell counters, and Western blotting infrastructure for validation.
- Necessitates standardization of doxycycline induction and puromycin selection timing across laboratories for consistent knockdown.
- Requires optimization of polybrene concentration and lentiviral titer for efficient transduction of primary gastric cancer stem cells.
- Limited by the dependency on sphere formation as a stemness readout, which may not capture all stemness phenotypes in heterogeneous cultures.
