Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Bu protokolde, clusterin'in hasta kaynaklı GCSC'lerin sapı üzerindeki etkisini incelemek için koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşum testini kullanarak deneysel bir tasarım salıyoruz. Protokol, farklı CSC türlerinde köklüğe bağlı genlerin hem in vitro hem de in vivo fonksiyonlarını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Kanser kök hücreleri ilaç direnci kanser relaps metastazı karıştığı. Bu protokol kanser kök hücrelerinde anahtar genlerin işlevlerini araştırmak için etkili bir yöntem sağlar. Koşullu bir nakavt sistemi ve uyarlanmış küre oluşumu tetkik kullanılarak, bu yöntem kanser kök hücrelerinin farklı türlerinde köklüğe bağlı genler üzerinde in vitro ve in vivo fonksiyonları incelemek için kolayca uyarlanmıştır.

Prosedürü gösteren, Yuting Li ve Xiangyu Tan, benim laboratuvar araştırma asistanları olacaktır. Lentivirüs parçacıkları oluşturmak için, tohum dört milyon 293T lentiviral ambalaj hücreleri 100 milimetre Petri çanak dmem 10 mililitre ile içine% 10 FBS ile desteklenmektedir. Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın, transfeksiyon gününde hücrelerin %50 ila %80 oranında etkili olduğundan emin olun.

Azaltılmış serum ortamını oda sıcaklığına getirin ve el yazması talimatlara göre A ve B tüplerini hazırlayın. Tüp A içeriğini tüp B.Mix iyi ekleyin ve lipid-DNA kompleksleri hazırlamak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tüp kuluçka. Hücre kültür çanağı orta beş mililitre çıkarın.

Sonra hücre kültürü çanak içine lipid-DNA kompleksi beş mililitre ekleyin akıllıca bırakın ve yavaşça çanak girdap. Kültür yemeğini 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra transfeksiyon ortamını dikkatlice çıkarın ve %10 FBS ile takviye edilmiş 10 mililitre önceden ısıtılmış DMEM ile değiştirin.

Hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Yaklaşık 48 saat sonra transfeksiyon, hasat 10 mililitre lentivirus supernatants içeren ve hücresel enkaz kaldırmak için 0,45 mikrometre dökmek filtre ile filtre. Tüm hücre kültürü damarları, ipuçları, filtreler ve şırıngalar lentivirus içerebilir ve imha edilmeden önce %10 çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir.

Netleştirilmiş bir supernatant'ı steril bir konteynere aktarın. Lenti-X konsantratörü ekleyin ve nazik inversiyon ile karıştırın. Karışımı bir gecede 4 derecede kuluçkaya yatırın.

Ertesi gün, numuneyi 1500 kez G'de 45 dakika 4 5 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin. Dikkatle alt pelet rahatsız değil dikkat, supernatant çıkarın. Peleti %10 FBS ile desteklenen bir mililitre DMEM'de yavaşça yeniden askıya alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Tohum 6 milyon mide kanseri kök hücreleri veya GCSC 100 milimetre Petri çanak içine DMEM 10 mililitre ile 10% FBS ile desteklenmektedir. Kültür 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 24 saat boyunca hücreleri. Hücreler %70 ila %80 birleştiğinde, çanaktan ortayı aspire edin ve Polibren reaktifi içeren dört milimetrelik tam DMEM ortamıyla seyreltilmiş konsantre lentiviral partikülleri ekleyin.

Hücreleri 18 saat boyunca kuvöze geri ver. Polibren etkili konsantrasyonu belirlemek için farklı koşullarda test edilmelidir, hangi mililitre başına iki ila 10 miligram aralığında genellikle. 18 saat sonra, orta yı 10 mililitre DMEM ile %10 FBS değiştirin ve hücreleri 24 saat boyunca kuvöze geri verin.

Sonra, hücre enkaz ile supernatant aspire ve taze DMEM ekleyin 10% FBS ve Puromisin mililitre başına 2.5 mikrogram ile takviye. Hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Daha sonra, taze DMEM için tekrar orta değiştirin 10% FBS ve mililitre Puromisin başına beş mikrogram ile takviye.

Başka bir 24 saat kuluçka sonra, kalsiyum ve magnezyum olmadan DPBS beş mililitre ile iki kez yapışkan GCSCs durular. Hücreleri bir mililitre önceden ısıtılmış hücre ayrıştırma çözeltisi ile ayırın ve 37 santigrat derecede 2-3 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, hücre süspansiyon taze önceden ısıtılmış GCSC tam kültür orta beş mililitre ekleyin.

Kriyopreservation için 15 mililitrelik centrifuge tüp içine bu süspansiyon üç mililitre dağıtın, ve dioksisiklin ile indüksiyon için başka bir tüp içine diğer üç mililitre. Her iki tüpü de 800 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Daha sonra, tüp B supernatant aspire ve taze önceden ısıtılmış GCSC tam kültür ortamı bir mililitre hücreleri yeniden askıya.

Yeni bir 100 milimetre petri kabına uygun sayıda hücreyi 10 mililitre taze önceden ısıtılmış GCSC tam kültür ortamı ve mililitre doksisiklin başına 2,5 mikrogram içeren tohum. Sonra, 48 saat boyunca çanak kuluçka. 10 mikrolitrelik bir hücre örneğinin yoğunluğunu belirlemek için otomatik bir hücre sayacı kullanın.

Daha sonra, mililitre başına 20.000 canlı hücre konsantrasyonu elde etmek için önceden ısıtılmış GCSC tam kültür ortamı ile hacmi ayarlayın. Yeni, ultra düşük eki 96 iyi kültür plakasının her kuyuya hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini dağıtın. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.

Küre oluşumu 3-10 gün içinde meydana gelmelidir. Görüntü tümör küre oluşumu her iki günde. Primer insan gastrik adenokarsinommide mide kanseri kök hücreleri serumsuz kültür ortamında kültürlendi.

Altı gün sonra hücreler fenotip gibi tek hücreli hücreden geniş kürelere doğru genişledi. GCSC'lerde clusterin'in işlevini değerlendirmek için, clusterin'e karşı kısa saç tokası RNA dizileri Tet-GV307-RFP-Puro vektörüne klonlandı. Ekspresyon vektörü ile transfected hücreler 48 saat boyunca doksisiklin ile tedavi edildi.

Daha sonra, clusterin ifadesi Batı leketarafından doğrulandı ve densitometri ile ölçüldü. GCSC'lerde doksisiklin varlığı ve kümenin yıkılması tümör küresi oluşumunu inhibe etti. Şifreli shRNA kontrolleri ile transekte olan hücrelerde tümör küresi oluşumunda inhibisyon gözlenmezken, doksisiklinin tek başına tümör küre oluşumunu engellemediğini göstermektedir.

Bu sonuçlar, kümelerin susturulmasından sonra GCSC'lerin yavaş büyüdüğünü ve tümör küreleri oluşturamayacaklarını göstermektedir. Bu verilere dayanarak, clusterin GCSCs kendi kendine yenileme aktivitesi teşvik kritik bir rol oynar, mide kanseri hastalarında kanser kök hücrelerini bastırmak için umut verici bir ilaç hedefi olabileceğini belirten. Tümör küreleri bireysel veya birleştirilmiş hücreler üzerinde katı yuvarlak yapılar olmalı, tümör küreleri olarak kabul edilmemelidir.

Ancak, bazı kanser kök hücreleri tipik tümör küre yapıları oluşturmayabilir. Bu prosedür, in vitro yenilenebilir potansiyel için kanser kök hücre incelemek için diğer yöntemler ile takip edilebilir. Örneğin, köklüğe bağlı belirteçlerin ekspresyonu incelenebilir.

Protokol, kanser kök hücrelerindeki kritik genlerin sağkalımda köklük gibi işlevlerini incelemek için genişletilebilir.