Protein Yapılarında Hidrojen Atomlarının Modellenmesi için Nötron Kristalografisi Veri Toplama ve İşleme

Nötron kristalografisi, biyolojik makromoleküllerdeki hidrojen atomu konumlarını belirlemek için kullanılan yapısal bir tekniktir. Nötron yapıları, reaksiyon mekanizmalarını ve bağlanma etkileşimlerini aydınlatmak için protonasyon durumlarını ve su molekülü yönelimlerini ortaya çıkarır. X-ışını kırınımının aksine, nötron kırınımı tahribatsız bir teknik olma avantajına sahiptir.

Işığa duyarlı gruplara veya metalosensörlere sahip proteinler, radyasyon hasarına maruz kalmadan incelenebilir. Nötron proteini kristalografisi yapmak için, oda sıcaklığında veri toplamak için büyük kırılgan protein kristalleri kuvars kılcal damarlara monte edilir. Kristal kılcal montaj rutin olarak yapılmaz, bu da bu tekniğin gösterilmesini öğretici hale getirir.

Kristal toplama için, protein kristallerini içeren kapalı sandviç kutuyu dokuz oyuklu büyük hacimli silikonlu bir cam plakada açın ve kristalizasyon rezervuar çözeltisinden 10 ila 20 mikrolitreyi bir cam lam üzerine aktarmak için bir mikropipet kullanın. Kristalleri mikroskopla değerlendirin. Bir kristal toplamak için uygun boyutta bir mikro halka kullanın ve kristali rezervuar çözeltisinin içine yerleştirin.

Kristal montajı için, iki milimetre çapında 50 milimetre uzunluğunda bir kuvars kılcal alın, rezervuar tamponunu bir pipetle aspire edin ve kılcalın bir ucunu rezervuar tamponu ile doldurun. Kristali kuvars kılcal damar içindeki rezervuar tamponuna nazikçe yerleştirmek için bir montaj halkası kullanın. Rezervuar tamponunu ve kristali kılcal damardan aşağı doğru hareket ettirmek için tüpe dokunun ve çözeltiyi kristalin etrafından aspire etmek için uzun ince bir pipet kullanın.

Kristali dikkatlice kurutmak ve kılcal duvarları kurutmak için ince bir kağıt fitil kullanın ve kılcal damarın ucuna 20 ila 50 mikrolitre döteryumlu tampon çözeltisi ekleyin. Balmumunun bir kısmını eritmek için bir ısı çubuğu kullanın ve kılcal damarı hava geçirmez bir conta oluşana kadar erimiş balmumuna nazikçe sokun. Döteryumlu tamponu, kristal montajından sonraki iki, altı ve 10. günlerde 20 ila 50 mikrolitre taze döteryumlu tampon ile değiştirin ve gösterildiği gibi her buhar değişiminden sonra kılcal damarı taze erimiş balmumu ile yeniden kapatın.

En az iki haftalık buhar değişiminden sonra, kuvars kılcal damarı, cihaz numune aşamasına sabitlenmiş olan IMAGINE nötron difraktometre gonyometresi numune çubuğuna sabitlemek için macun kullanın ve numuneyi indirin ve nötron ışını ve dedektör alanına yapıştırın. Beamline kontrol bilgisayarında veri toplama programını açın ve veri toplama stratejisini ayarlamak için kurulum sekmesine tıklayın ve cihaz adı ve toplanacak görüntülerin adı dahil olmak üzere deney parametrelerini girin. Topla sekmesine tıklayın ve pozlama süresi ve toplanacak kare sayısı dahil olmak üzere veri toplama parametrelerini girin.

Optik grafik kullanıcı arayüzünde, veri toplama için yarı aralığı ayarlamak için minimum lambda için 2.78'e ve maksimum lambda için 4.5'e tıklayın. Veri toplamayı başlatmak için Taramayı başlat'a tıklayın. Nötron veri toplama işleminden sonra, aynı sıcaklıkta aynı kristal üzerinde karşılık gelen bir x-ışını veri seti toplayın.

Kriyo veri toplamadan önce, rezervuar çözeltisini sandviç kutusundan çıkarın ve sandviç kutusunu döteryumlu rezervuar tampon çözeltisi ile doldurun, bir hafta dengelenmesine izin verin ve üç kez tekrarlayın. Üç tur daha rezervuar çözeltisi değişiminden sonra, kristali bir mikro döngü ile hasat edin ve kristali bir kriyo kristal yuvasına bağlı bir mikro döngüye monte etmeden önce kristali iki saat boyunca bir kriyoprotektan çözeltisine daldırın. Monte edilmiş kristali ve kriyo yuvasını sıvı nitrojene daldırın.

Kristal donduğunda, kristali bir kriyo akışı ile donatılmış makromoleküler nötron difraktometresi numune aşamasına monte edin. Kristalin veri toplama için monte edildiğini ve ortalandığını doğrulayın, teklif bilgilerini doldurun ve veri toplama stratejisi tablosunu yüklemek için klasör simgesine tıklayın, ardından veri toplamayı başlatmak için gönder'e tıklayın. Kırınımlı nötronlar, MaNDi uçuş süresi dedektörleri tarafından algılandıklarında gerçek zamanlı olarak görünür hale gelecektir.

Ortak x-ışını ve nötron verilerinin iyileştirilmesi için, önce CCP4'ü açın ve nötron verilerinin R içermeyen veri bayraklarını x-ışını verilerinin bayraklarıyla eşleştirmek için genişletilmiş MTZ programını değiştirmek için dönüştürmeyi seçin. Nötron veri yansıma dosyasını MTZ formatında içe aktarın. Başka bir MTZ dosyasından ücretsiz R verilerini içe aktar'ı seçin ve x-ray MTZ dosyasını içe aktarın.

Eşleşen yeni MTZ dosyasını adlandırın ve çalıştır'a tıklayın. Ardından, Phoenix yazılım paketini açın ve iyileştirme altında hazır set'e tıklayın. Protein koordinat dosyasını yükleyin, yoksa modele hidrojen eklemeyi seçin ve değiştirilebilir sitelerde HD'yi, açılır menüden başka bir yerde H'yi seçin.

Çözücü moleküllerine döteryum ekle'yi seçin ve başlamak için çalıştır'a tıklayın. Yapı iyileştirmesi için, iyileştirme sekmesinde anka kuşunu açın. Hem X-ışını hem de nötron verilerini kullanarak arıtmayı ayarlamak için rafine etme programı.

Yapılandır sekmesinde, çözülmüş x-ışını yapısından PDB dosyasını girin. MTZ dosyasını nötron verilerinden yükleyin. MTZ dosya verilerini nötron R'de nötron verileri olarak atayın.

MTZ dosyasını x-ray verilerinden yükleyin ve x-ray verileri ve x-ray R ücretsiz olarak atayın. İyileştirme ayarları altında, standart iyileştirme stratejisinin seçildiğini onaylayın ve döngü sayısını beşe çıkarın. Tüm parametreleri, gelişmiş parametreleri ve hidrojenleri seçin.

Hidrojen arıtma modelini bireysel olarak değiştirin ve ADP'ye binen kuvveti kapatın, ardından nükleer arayın. X-HD'den nükleer mesafeleri kullanmayı seçin. İyileştirmeyi başlatmak için çalıştır'a tıklayın.

Phoenix'te model oluşturmak için Coot'ta aç'a tıklayın. Coot'ta, x-ışını elektron yoğunluğu ve nötron saçılma uzunluğu yoğunluk haritalarını görselleştirin. Görüntü yöneticisini seçin ve nötron 2FOFC nötron saçılma uzunluğu yoğunluk haritasını silin.

MTZ'yi aç'ı seçin ve MTZ'yi aç'ı seçin ve nötron verileri mtz dosyasını açın. Hem genlikler hem de fazlar için, doldurulmamış nötron saçılma uzunluğu yoğunluk haritalarını açmak için açılır menülerden no_fill_neutron verileri seçin. Modelin verilere uyup uymadığını belirlemek için kalıntıların görsel incelemesini yapın ve doğru yönlendirmeyi ve doluluğu belirlemek için hidrojen-döteryum değiştirilebilir sahalarının fark, yoğunluk haritası, tepe noktalarını analiz edin.

Su moleküllerini nötron SLD haritalarına ve hidrojen bağı etkileşimlerine göre yeniden yönlendirin. Protein kalıntısı hidrojen-döteryum değiştirilebilir bölgelerinin protonasyon durumunu ve yönünü nötron SLD haritalarına göre ayarlayın. Eksiksiz bir yapı elde etmek için daha fazla etkileşimli model oluşturma ve iyileştirme turu gerçekleştirin.

Su bazlı tamponda büyütülen hidrojene protein kristalleri yaklaşık 1.000 x 900 mikron ölçülerindedir. Kristaller, nötron kırınım verilerinin toplanmasından önce üç hafta boyunca döteryum oksit bazlı tampon ile buhar değişimi için kuvars kılcal damarlara monte edilebilir. Nötron kırınım verileri birkaç gün boyunca 2.30 angstrom çözünürlükte toplandı ve aynı kristal üzerinde bir x-ışını kırınım veri seti toplandı.

FO eksi FC nötron saçılma uzunluğu yoğunluk haritalarındaki tepe noktaları, paragin gibi kalıntıların oryantasyonu hakkında değerli bilgiler sağlar ve FO eksi FC nötron saçılma uzunluğu yoğunluk atlama haritalarındaki pozitif tepe noktaları, histidin gibi titre edilebilir gruplara sahip kalıntıların protonasyon durumlarının belirlenmesinde de çok bilgilendiricidir. Su molekülleri için elektron ve nötron saçılma uzunluğu yoğunluk haritalarının harita kaplamaları, hidrojen bağı etkileşimlerinin x-ışını verilerinden çıkarılabilmesine rağmen, nötronların bu hidrojen bağlarının konumları hakkında net bilgi sağladığını göstermektedir. Nötron saçılma uzunluk yoğunluğu atlama haritaları, hidrojen-döteryum yan zincir fonksiyonel grup yönelimlerini belirlemek için kullanılabilir.

Değiş tokuş edilemeyen hidrojen atomlarının karbona bağlandığı nötron saçılımı uzunluk yoğunluk haritaları, yoğunluk iptali nedeniyle elektron yoğunluğu haritası muadilleriyle karşılaştırıldığında eksik görünmektedir. Bu nedenle, protein omurgasının konumunu belirlemek için x-ışını verilerinin kullanılabileceği hem x-ışını hem de nötron verileriyle bir numunenin ortak bir şekilde rafine edilmesi tercih edilir. Nötron proteini kristalografisi büyük kristaller gerektirir.

Kristallerin taşınması ve montajı sırasında, kolayca çatlayabilecek ve veri kalitesinden ödün verebilecek kristallere zarar vermemek için dikkatli olunmalıdır. Nötron protein kristalografisi, protein reaksiyon mekanizması hakkında bilgi sağlar ve potansiyel olarak rolü kinetik, mutajenez veya spektroskopi ile daha fazla araştırılabilen katalitik olarak ilgili kalıntıları veya su moleküllerini ortaya çıkarır.