Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Konakla ilişkili mikroplar, görüntülemenin anlaşılmasını gerektiren bu çok karmaşık ekosistemi oluşturuyor. Ve bu parçacık sayesinde, size boyama sürecinden nasıl geçeceğinizi ve konak mikrobiyom arayüzünün görselleştirilmesini nasıl elde edeceğinizi göstereceğiz. Konakla ilişkili bakterilerin biyolojisini anlamak, mikro ortamlarda lokalizasyonlarının anlaşılmasını gerektirir.

Ve bu teknik, konak ortamlarında ve diğer bakteriler bağlamında bireysel takson görselleştirmemizi sağlayacaktır. Bu teknik sayesinde, konak dokusundan hangi bakterinin nüfuz etmiş olabileceğini belirlemek ve konak mukus gibi temel özelliklerin tükenip tükenmediğini belirlemek mümkün olacaktır. %60 mutlak metanol, %30 kloroform ve %10 buzul asetik asit içeren uyumlu bir kapta taze metanonda hazırlayın.

Keskin ve temiz aletler kullanarak, görüntüleme için farelerden bağırsak parçalarını kesin. Numuneyi mümkün olduğunca rahatsız etmeyi en aza indirin ve görüntüleme alanını etkilememek için bölümleri sırtlarından idare edin. Bozulmayı önlemek için diseksiyondan sonra örneği mümkün olan en kısa sürede düzeltin.

Bağırsak bölümlerini, dokunun bir kenarını cımbızla hassas bir şekilde tutarak histoloji kasetlerine yerleştirin. Kaseti kapatın ve taze metakarn çözeltisine tamamen batırın, kasetin daldırmasından sonra çözeltinin birkaç saatten daha eski olmamasını sağlayın. Duman kaputuna erişimi olmayan bir klinik süitte toplanacak klinik örnekler için, histoloji kasetlerinin geçişine izin verecek kapağı kesilmiş bir polietilen saklama kabı kullanın.

Zehirli dumanların kaçmasını önlemek için numuneleri geçirmediğinizde bu kapağı kapatın. Parafin ısıya dayanıklı bir kaba yerleştirin ve bir gecede 60 santigrat derecede bir fırında eritin. Sıvıyı uygun atık hazneye dökerek ve metin el yazmasında açıklandığı gibi mutlak metanol, mutlak etanol ve ksilen olarak ardışık olarak inkübe ederek dokuyu yıkayın.

Çift eldiven veya cımbız kullanarak doku segmentlerini kaybetmeden parafin girmesini sağlamak için kasetleri hafifçe açın. Kasetleri eritilmiş parafin kabına batırın ve kapatın. Kabı tekrar 60 santigrat derece fırına yerleştirin, kasetlerin parafinle doldurulmasını ve büyük hava kabarcıklarının kalmamasını sağlayın.

İki saat kuluçkadan sonra kabı fırından çıkarın. Yaban arılarını kullanarak kasetleri dikkatlice çıkarın. Fırını 60 santigrat dereceye ısıtın ve bir Coplin kavanozu önceden ısıtın.

Bir cam şişeye kavanozdaki cam slaytları iki kez kaplayacak kadar xylene ekleyin ve ksilenlerin buharlaşmasını önlemek için kapağın etrafına parafilm yerleştirin. Ksilenlerin sıcaklığının 60 santigrat dereceye ulaşmasına izin verin. Metin el yazmasında belirtildiği gibi FISH hibridizasyon çözümünü hazırlayın.

Slaytları Coplin kavanozuna yerleştirin, bölümlerin diğer slaytlarla veya kavanozla temas etmediğine emin olarak ve slaytları 60 santigrat derecede 10 dakika pişirin. Duman kaputunda, Coplin kavanozunu fırından önceden ısıtılmış ksilenlerle doldurun, doğrudan numunelerin üzerine dökmemeye ve dokuları potansiyel olarak yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Coplin kavanozu 60 derece fırına geri yerleştirin.

Kullanılmış ksilenleri uygun bir atık kabına dökün, cam slaytlardaki doku bölümlerini rahatsız etmemeye dikkat edin ve slaytların Coplin kavanozundan düşmesini önlemek için bir çift asa kullanarak. Coplin kavanozunu kalan ksilenlerle doldurun ve duman kaputunda oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslayın. Bölümleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 99,5 etanolde kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, slaytları Coplin kavanozundan çıkarın. Slaytların arkasını bir laboratuvar mendili veya kağıt havlu üzerinde silin ve etanol damlacıkları gidene kadar kısa bir süre hava kurulayın. Melezleme çözeltisi tarafından kaplanması gereken genişleme alanını sınırlamak için bir sıvı engelleyici veya PAP kalemi kullanarak her doku bölümünün etrafında çok yakın daireler oluşturun ve bölümle mürekkep temasını önleyin.

Hibridizasyon çözeltisini hazırlayın ve kullanılan çözeltinin her 50 mikrolitresi için 0,5 mikrogram prob ekleyin. Çözeltiyi slayttaki bölümlere pipetleyin. Bölümü esnek plastik kapaklarla kaplayın, kullanılan sıvı hacminin tüm bölümü kapsamasını sağlayın.

Nem sağlamak için aşırı hibridizasyon çözeltisi veya PBS ile ıslatılmış mendil veya kağıt havlulu pipet ucu kutusu ile nemli bir oda oluşturun. Buharlaşmayı azaltmak için ayarlanan proba bağlı olarak, slaydı nemli haznede 45 ila 50 santigrat derecede en az üç saat kuluçkaya yatırın. Plastik kapakları çıkarın ve her ikisi de önceden 50 santigrat dereceye kadar ısınmış bir Coplin kavanozunda FISH yıkama tamponundaki slaytları kuluçkaya yatırın.

Coplin kavanozu 10 ila 20 dakika boyunca 50 santigrat derece fırına geri yerleştirin. FISH yıkama tamponu çıkarın ve Coplin kavanozunda PBS ile değiştirin. Coplin kavanozu PBS ile doldurduktan hemen sonra PBS'yi boşaltın.

Pipet ucu ile dokuya dokunmamaya dikkat ederken, tüm bölümün üstündeki kontrtain'i kavanozdan ve pipetten çıkarın. 45 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Lekeleri taze PBS ile üç kez hızlı bir şekilde yıkayın.

Slaytların arkasını bir mendile veya kağıt havluya karşı silin ve PBS'nin çoğunun pipet ucuna bağlı bir vakum hattının yardımıyla bölümleri buharlaştırmasına izin verin. Bölümleri bir montaj ortamı kullanarak monte edin. Kapak cilasının kenarlarını şeffaf oje ile boyayarak, slaydın kenarından uzak durmaya özen göstererek kapak kapaklarını slayda yapıştırın.

Oda sıcaklığında ayarlasın. Muribaculum intestinale ile mono-kolonize fare distal kolon ve Muribaculum intestinale ve Bacteroides tetaiotaomicron ile ikiye ikiye kolonize edilmiş görüntüleri burada gösterilmiştir. Örnekler, Muribaculum izolat için etiketlenmiş üç asal siyanin-3 balık sondası ile boyandı ve ayrıca rhodamine bağlı lektin UEA-1 ve DAPI ile karşı konuldu.

Siyanin-3 FISH, DAPI ve kombine siyanin-3 FISH ve DAPI kanalları ile lekelenmiş bölümlerin görüntüleri Muribaculum intestinale lokalizasyonunu göstermektedir. Tüm bakteri şeklindeki ve bakteri boyutunda DAPI sinyalleri mono-kolonizasyon durumunda siyanin-3 ile etiketlenmiştir. İki kolonizasyon durumunda, bu siyanin-3 ve DAPI çift pozitif hücrelere ek olarak, beklendiği gibi siyanin-3 negatif olan DAPI lekeli bakteri hücreleri vardır.

Daha uzun filamentli bakteriler hariç, daha büyük DAPI pozitif yapılar bitki malzemesi veya konak hücrelerden çekirdeklerdir. Lümenin yanı sıra epitelin boyuna görünümlerini sağlayan bir derinlikte bölümlenmiş bir bağırsak segmenti ve sadece mahzenlerin kesitlerini ortaya çıkaran sığ bir kesit segmenti ve sabit mukus tabakası veya bakteri olmaması, sığ kesitlerin bağırsağın ışık dilimlerini sağlamayacağını kanıtlamaktadır. Düzensiz doku veya kapak kaplaması bulanık ve düzensiz aydınlatılmış karo taramaları ile sonuçlanır.

Normal arka plan ve yüksek arka plan örneği de burada gösterilmiştir. Mikrobiyota hakkında daha fazla bilgi edindikçe, sıralama gibi toplu tahlillerin farklı mikrobiyal türler arasında ne olduğunu ve birlikte nasıl etkileşime girdiklerini gerçekten belirlemek için yeterli olmadığı gerçekten açık hale geldi. Ve bunun için gerçekten görüntülemeye ihtiyacımız var.

Bu tür bir teknik, örneğin, diyetten lif yoksunluğunun, Martins grubundan yapılan çalışmalar gibi patojenler tarafından mukus tabakasının incelmesine ve potansiyel olarak enfeksiyona neden olduğu gibi, ozmotik ishalin etkileri ve mukus tabakasının tükenmesinin hem konağı hem de mikrobiyotayı nasıl etkilediğine dair çalışmalara neden olan bazı önemli keşiflere izin almıştır. Ve bunlar Sonnenberg grubu ve grubumuz tarafından yapılan çalışmalardı.