İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi
7 Şubat 2022
Modifiye edilmiş bir fiksasyon sonrası prosedür, dokudaki glikojen parçacıklarının kontrastını arttırır. Bu yazıda, iskelet kasında lif tipine özgü hücre altı glikojen dağılımı hakkında tarafsız ve nicel veriler elde etmek için dokunun nasıl ele alınacağını, görüntülemenin nasıl yapılacağını ve stereolojik yöntemlerin nasıl kullanılacağını açıklayan adım adım bir protokol sunulmaktadır.
Tek hücrelerde ve hücre altı organizasyonlarda glikojen içeriğinin ölçülmesi önemlidir, çünkü çoğu hücre tipinde, tek hücreler değişen fizyolojik koşullara ve hastalıklara farklı şekilde adapte olurlar. Bu nedenle, bu tekniğin temel avantajı, iletim elektron mikroskobundaki çok yüksek çözünürlüktür. Bu, lokalize hücre altı yapılara sahip olma olasılığını artırır ve ayrıca buradaki teknikteki bu içerikte, glikojen boyamasının antikorsuz olması önemlidir.
Yani, endişelenecek herhangi bir özgüllüğümüz yok. Glikojen üzerinde daha iyi bir kontrast elde etmek için, potasyum ferrosiyanür yerine% 1.5 potasyum ferrosiyanür kullanın. İki mililitrelik bir mikro merkezleme tüpünde 0.1 molar sodyum kakodilat tamponuna% 2.5 glutaraldehit ekleyerek, birincil fiksatif çözeltinin 1.6 mililitresini hazırlayın.
En fazla 14 gün boyunca beş santigrat derecede saklayın. Herhangi bir yönde maksimum bir milimetre çapına sahip olan ve enine kesitten daha uzunlamasına daha uzun olan kas biyopsisinden veya tüm kastan küçük bir örneği izole edin. Numuneyi soğuk primer fiksasyon çözeltisini içeren tüpe yerleştirin.
24 saat boyunca beş santigrat derecede saklayın. Daha sonra numuneyi 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda dört kez yıkayın. Transfer pipetlerini kullanarak, numuneye dokunulmadan kullanılmış tamponu tüpten çıkarın ve taze tamponu ekleyin.
Numuneyi% 1 ozmiyum tetroksit ve% 1.5 potasyum ferrosiyanür ile 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda dört santigrat derecede 120 dakika boyunca sabitleyin. Numuneyi oda sıcaklığında çift damıtılmış suda iki kez durulayın. Oda sıcaklığında derecelendirilmiş bir etanol serisine batırılarak kurutun.
Belirtilen hacim oranlarını kullanarak oda sıcaklığında propilen oksit ve epossidik reçine dereceli karışımlarla numuneye sızın. Ertesi gün, numuneleri kalıplara% 100 taze possidik reçineye gömün ve 48 saat boyunca 60 santigrat derecede polimerize edin. Bir numunenin bloğunu ultramikrotom tutucuya monte edin.
Doku seviyesine ulaşmak için yüzeydeki bloğu bir tıraş bıçağı ile kesin. Numunenin önüne bir elmas bıçak takın ve numune yüzeyini bıçağa paralel olarak hizalayın. Numunenin yönünü kontrol etmek için elmas bıçakla bir mikrometre kalınlığında yarı ince bir bölüm üretin.
Işık mikroskobu ile gözlem için yarı ince kesiti toluidin mavisi ile lekeleyin. Ardından, uygun ultra ince bölümler elde etmek için ilgi alanını azaltmak için bloğu daha da kesin. İkinci bir elmas bıçakla 60 ila 70 nanometre kalınlığındaki ultra ince kesitleri kesin.
Mükemmel bir döngü kullanarak bütün bir bakır ızgara üzerinde bir ila iki bölüm toplayın. Kesitleri kontrast oluşturmak için, ızgaraları 20 dakika boyunca uranil asetat çözeltisine batırın ve ızgaraları çift damıtılmış suda yıkayın ve ardından ızgaraları 15 dakika boyunca kurşun sitrat içine daldırın ve ızgaraları çift damıtılmış suda tekrar yıkayın. İletim elektron mikroskobu bilgisayarını ve görüntü kayıt yazılımını açın, dijital Yavaş Tarama CCD Kamera ve ilgili görüntüleme yazılımı ile dijital görüntüleri kaydedin.
Izgarayı mikroskop aşamasında birden fazla bölümle yerleştirdikten sonra, en kaliteli bölümleri seçmek ve kas liflerinin yönünü belirlemek için ızgarayı başlangıçta düşük büyütmede tarayın. Bir sonraki odak, 30.000'in üzerindeki büyütmedeki görüntü, ışın bölümdeki çevresel bir fiber üzerinde ortalanmış ve istenen büyütmede bir saniyelik pozlama süresiyle görüntüleri kaydedin. Tarafsız sonuçlar elde etmek için görüntülerin fiberin uzunluğu ve genişliği boyunca rastgele bir bot sistematik düzeninde dağıtıldığından emin olun ve altı ila 10 fiber görüntülenene kadar görüntülemeyi tekrarlayın.
Dosyayı ve ardından aç'ı tıklatarak görüntüleri J resmine aktarın. Analiz et'e tıklayarak genel ölçeği görüntünün orijinal boyutuyla eşleşecek şekilde ayarlayın ve ardından ölçeği ayarlayın. Yakınlaştırmak için% 100 resme tıklayın, yakınlaştırmaya gidin ve tıklayın.
Araçlar menüsünden düz çizgi aracını kullanarak miyofibriller uzayın görüntüsü başına bir Z-diskin kalınlığını ölçün ve altı ila 10 fiberin her birinin ortalama Z-disk kalınlığını hesaplayın. Subsarkolemmal bölgenin hemen altında görülebilen en dıştaki miyofibrilin uzunluğunu ölçmek için parçalı çizgi aracını kullanın. Bir ızgara eklemek için analize tıklayın, araçları seçin ve ardından ızgarayı seçin.
Şimdi nokta başına alanı 32.400 nanometre kare olarak ayarlayın. Bir çaprazın subsarkolemmal glikojene çarptığı 12 subsarkolemmal görüntüde mevcut uzunluktaki isabet sayısını sayın. Analize tıklayarak bir ızgara ekleyin, ardından araçları seçin, ardından ızgara ve nokta başına alanı 160.000 nanometre karede ayarlayın.
Bir çaprazın intramiyofibriler boşluğa çarptığı 12. miyofibriller görüntülerdeki isabet sayısını sayın. Sonra tekrar, bir ızgara eklemek için analize tıklayın, araçları seçin ve ardından ızgarayı seçin. Şimdi nokta başına alanı 3.600 nanometre kareye ayarlayın.
Bir çaprazın intramiyofibriler glikojene çarptığı 12. miyofibriller görüntülerdeki isabet sayısını sayın. Analize tıklayarak bir ızgara ekleyin, ardından araçları seçin, ardından ızgara ve nokta başına alanı 32.400 nanometre kareye ayarlayın. Bir çaprazın intermiyofibriller glikojene çarptığı 12. miyofibriller görüntülerdeki isabet sayısını sayın.
Glikojen parçacıklarını rastgele seçmek için 32.400 nanometre karelik ızgarayı kullanarak, sol üst kare ile başlayın ve gerekirse sola hareket edin. Düz çizgi aracını kullanarak, lif başına havuz başına ortalama 60 parçacık elde etmek için 12 görüntünün her biri için her havuzun rastgele seçilmiş beş glikojen parçacığının çapını ölçün. Bu şekil üç glikojen havuzunun normal değerlerini göstermektedir.
İntermiyofibriller glikojen değerlerinin normale yakın dağıldığı, oysa hem intramiyofibriler hem de subsarkolemmal glikojenin, liflerin bazen aşırı miktarda glikojene sahip olduğu yerlerde çarpık dağılım gösterdiği gözlenebilir. Tüm adımlar arasında potasyum ferrosiyanür kullanmak çok önemlidir. Glikojen analizi, diğer önemli metabolik bileşenlerin glikojen ve kas sağlığı ile nasıl ilişkili olduğunu anlamamızı geliştirebilecek mitokondri ve lipit damlacıklarının analizi ile birleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, dokuda glikojen partiküllerinin kontrastını artıran değiştirilmiş bir son-fiksasyon prosedürü sunmaktadır. Protokol, dokunun işlenmesi, görüntüleme teknikleri ve iskelet kasında glikojen dağılımının niceliğini belirlemek için stereolojik yöntemleri detaylandırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Histoloji
Arka Plan
- Gljekojen içeriği ölçümü, fizyolojik değişikliklere hücresel tepkileri anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Tek hücreler, koşullara ve hastalıklara farklı adaptasyonlar sergiler.
- Subsellüler yapıları gözlemlemek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme esastır.
- Teknik, antikor içermeyen glikojen boyaması kullanarak özgüllük sorunlarını önler.
Çalışmanın Amacı
- Doku örneklerinde glikojen partiküllerinin kontrastını artırmak.
- Görüntüleme ve analiz için detaylı bir protokol sağlamak.
- İskelet kasında glikojen dağılımı hakkında tarafsız veriler elde etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Potasyum ferrosiyanür ile değiştirilmiş son-fiksasyon prosedürü.
- Glutaraldehit ve sodyum kakodilat tampon kullanarak fiksatif çözeltinin hazırlanması.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için transmisyon elektron mikroskobu.
- Nicel analiz için stereolojik yöntemler.
Ana Sonuçlar
- Gljekojen partiküllerinin kontrastı artırılmıştır.
- Protokol, subsellüler yapıların hassas görüntülemesine olanak tanır.
- İskelet kasında glikojen dağılımının tarafsız nicellenmesi gösterilmiştir.
- Teknik, çeşitli doku türlerine uygulanabilir.
Sonuçlar
- Değiştirilmiş prosedür, glikojen görsellemesini önemli ölçüde iyileştirir.
- İskelet kasında glikojen çalışması için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Hücresel adaptasyonların daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
