İnsan CD14⁺ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Hangi immünomodülatör tedavilerin halihazırda farklılaşmış monosit türevli dendritik hücrelerden tolere edilmiş dendritik hücreler üretebileceğini anlamaya çalışıyoruz ve bu, otoimmün ve transplantasyon araştırmaları için çok değerlidir. Kendi kendine terapiler, üretimdeki ilerlemeler nedeniyle daha pratik hale gelmektedir ve tolerojenik dendritik hücreler klinik öncesi çalışmalarda umut vaat etmektedir. Antijene özgü tolerans oluşturabilirler. En yaygın olanı sitometri içindir. Bu, tolere edilmiş hücreleri analiz etmek için hızlı ve aynı zamanda erişilebilir bir yol sağlar. Her iki fonksiyonda da in vivo olarak devam eden tolerojenik dendritik hücreler üretmek zordur. Bu nedenle tolere edilenler için klinik olarak onaylanmış dendritik hücre tedavileri yoktur. Büyük tarama çalışmalarından elde edilen immünomodülatör bileşiklerin yeni kombinasyonlarını, bunların tolere edilmiş dendritik hücre işlevselliğinde iyileşme gösterdiğini belirledik. Ayrıca tolere edici nanopartikül formülasyonları da tasarlıyoruz.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, zenginleştirilmiş insan monositleri ve T hücreleri içeren 15 mililitrelik tüpleri bir santrifüje yerleştirin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, süpernatanı tüplerden aspire etmek için bir pipet kullanın. Monosit peletine bir mililitre MODC kültür ortamı, T hücreleri ile tüpe bir mililitre T hücresi kültür ortamı ekleyin ve hücre sayımından önce iyice karıştırın. Daha sonra, 10 mililitrelik son hacmi elde etmek için monosit süspansiyonuna dokuz mililitre ılık MODC kültür ortamı ekleyin. Daha sonra GM-CSF ve IL-4 stok çözeltilerinin her birine 100 mikrolitre pipetleyin. Süspansiyonu MODC olarak işaretlenmiş etiketli bir Petri kabına aktarın ve inkübe edin. Daha sonra, T hücresi süspansiyonuna bir mililitre T hücresi dondurma ortamı ekleyin. Karışımı iki mililitrelik kriyo şişesine bölün. Mühürlü kriyo şişelerini, kullanılmayan kuyucuklarda dengeleme tüpleri olan bir dondurma odasına yerleştirin. Dördüncü günde, monosit tüpüne beş mililitre taze MODC kültür ortamı ekleyin. Ardından, GM-CSF ve IL-4 stok çözeltilerinin her birinden 100 mikrolitre pipetleyin ve yedinci güne kadar inkübe edin. Yedinci günde, farklılaşmış monositten türetilmiş dendritik hücreleri veya MDOC'leri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Hücre peletine bir mililitre ılık MODC kültür ortamı ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. İstenilen hücre konsantrasyonu elde edilene kadar süspansiyonu GM-CSF ve IL4 içeren ılık MODC kültür ortamı ile seyreltin. 30.000 hücre içeren 100 mikrolitre süspansiyonu düz tabanlı 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna dağıtın. Belirlenen kuyucuklara bir mikrolitre immünomodülatör ilaç ekleyin ve inkübe edin. Ertesi gün, MODC plakasını 300 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe çıkardıktan sonra, plakanın ve santrifüjün yan tarafına yavaşça 200 mikrolitre ılık HBSS ekleyin. Yine, süpernatan aspirasyondan sonra GM-CSF ve IL4 içeren 100 mikrolitre ılık MODC kültür ortamı ekleyin. İmmünostimülasyon kullanılıyorsa, belirlenen kuyucuklara bir mikrolitre 100X lipopolisakkarit stoğu ekleyin ve inkübe edin. Sekizinci günde, iki kriyo şişesini, içindekiler erimeye başlayana kadar 37 santigrat derecede sıcak bir boncuk banyosunda çözün. Kısmen çözüldükten sonra, şişeleri bir hücre kültürü başlığına aktarın. Daha sonra hücreleri hızla çözmek için bir mililitre ılık T hücresi kültür ortamı ekleyin. İçeriği 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüm hücreleri toplamak için kriyo şişelerini ek bir mililitre T hücresi kültürü ortamı ile durulayın. Süspansiyonu 15 mililitreye kadar akış boyama solüsyonu ve santrifüj ile doldurun. Peleti beş mililitre akış boyama çözeltisinde yeniden süspanse edin ve tekrar santrifüjleyin, ardından süpernatanı pipetledikten sonra hücre peletini bir mililitre ılık T-hücresi kültür ortamında yeniden süspanse edin. 10 mililitrelik bir son hacim elde etmek için dokuz mililitre ılık T hücresi kültür ortamı ekleyin. Süspansiyonu Yeniden Çözülmüş T hücreleri olarak etiketlenmiş bir Petri kabına aktarın ve inkübe edin. Sekizinci günde, MODC plakasını 300 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı pipetledikten sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre akış boyama solüsyonu ekleyin ve inkübe edin. Ardından, tekrar santrifüjlemeden önce bağlı hücreleri ve hücre süspansiyonunu yeni bir 96 kuyulu V-tabanlı plakaya çıkarmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için süpernatanı aspire ettikten sonra her bir kuyucuğa 50 mikrolitre FC reseptör bağlanma inhibitörü antikoru pipetleyin. Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra, her bir oyuğa 50 mikrolitre hazırlanan doğrulama paneli antikor kokteyli ekleyin. 1.5 mililitrelik tüplerde 50 mikrolitre kompanzasyon boncuğu ile her seyreltilmiş antikordan 50 mikrolitre karıştırın ve inkübe edin. Plakayı beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Hücreleri yıkamak için peleti 200 mikrolitre akış boyama solüsyonunda yeniden süspanse edin. Son yıkama ve santrifüjlemeden sonra, akış sitometrik analizi için hücreleri 110 mikrolitre akış boyama solüsyonunda yeniden süspanse edin. Tolerojenik MODC'ler için, antikor kokteylini tolerans paneli kokteyli ile değiştirin. Dokuzuncu günde, yeniden çözülmüş T hücreli Petri kabını 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü akış boyama solüsyonu ile doldurun. Trig analizi için boyanmamış T hücresi içeren ikinci tüpü kullanın. Tüpleri beş dakika boyunca 250 G'de döndürün. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri ılık hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. T hücresini sayın ve en az 4 milyon hücre elde edildiğinden emin olun. MODC plakasını 300 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanları aspire ettikten sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre T hücresi ekleyin. Trig analiz plakaları için boyanmamış T hücreleri ekleyin. T hücrelerini uyarmak ve 12. güne kadar inkübe etmek için negatif kontrol kuyuları hariç tüm gruplara mililitre başına 25 mikrolitre anti-CD3 / CD28 antikor kokteyli ekleyin. Daha sonra, tüm hücre süspansiyonlarını 96 kuyulu kültür plakasından akış boyama çözeltisi ile bir V-tabanlı plakaya aktarın. Hücreleri 200 mikrolitre akış boyama solüsyonunda iki kez yıkayın. Kompanzasyon kontrolleri için bazı hücreleri bir kenara koyun. İkinci yıkamadan sonra plakayı santrifüjleyin. Daha sonra her bir oyuğa 50 mikrolitre seyreltilmiş FC reseptör bağlanma inhibitörü antikoru ekleyin ve inkübe edin. Kuluçka tamamlandığında, her bir oyuğa 50 mikrolitre hazırlanmış trig panel antikor kokteyli ekleyin. Kompanzasyon kontrolleri için, 50 mikrolitre lekelenmemiş kompanzasyon hücresini her bir lekeli antikorun 50 mikrolitresi ile karıştırın. Plakayı ve dengeleme kontrollerini bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin, ardından santrifüjlemeden önce akış boyama solüsyonu ile yıkayın. Şimdi hücreleri, soğuk inkübasyondan önce oyuk başına 200 mikrolitre oranında HBSS ile seyreltilmiş Canlı / Ölü Near-IR boya ile boyayın. Fox P3 ve akış sitometrik analizi ile boyamadan önce plakayı yıkayın ve santrifüjleyin. Birinci günde, farklılaşmamış monositler ağırlıklı olarak küçük bir CD14 eksi ile HLA-DR-eksi iken, yedinci günde farklılaşmış monositler çoğu hücreyi HLA-DR-artı CD14 eksi, CD1c-artı, CD141 artı olarak gösterdi. Lipopolisakkarit ile ve lipopolisakkarit olmadan rapamisin ile tedavi, DC-SIGN-plus CD1c-plus popülasyonlarını önemli ölçüde azalttı ve tek başına LPS tedavisi ile gözlenen CD86 ve CD40 belirteçlerinin yukarı regülasyonunu inhibe etti. FOX P3 artı T düzenleyici hücre popülasyonları, MDC'ler T hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde artmıştır. Ancak dört MODC tedavi grubu arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. T hücresi proliferasyonu, Rapa ile tedavi edilen MDOC'lerle ko-kültürden sonra hem CD4-artı hem de CD8-artı T hücresi popülasyonlarında azalmıştır. İnterlökin-10 ile muamele edilen numuneler, 24 saat içinde İnterlökin-10 üretimini önemli ölçüde artırdı. Dex ile tedavi edilen MDOC'ler, interlökin-10 üretimini önemli ölçüde artırdı, ancak sadece 72 saat dinlendikten sonra. Deksametazonun ön tedavisi, 24 saat sonra LPS tedavisi üzerine ortalama TNF alfa oluşumunu azalttı. Dex artı LPS ve Rapa ile tedavi edilen gruplarda 72 saat sonra PDL1 artı MDOC'lerde önemli artışlar gözlenmiştir. Tüm immünomodülatör ile tedavi edilen gruplardan hem 24 hem de 72 saatte CD86 ekspresyonunun baskılanması gözlendi. İmmünomodülatör ile tedavi edilen MDOC'ler CD4 artı T hücresi proliferasyonunu artırmadı.