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Visualizando microrganismos do solo através do ensaio de slides de contato e microscopia
 
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Visualizando microrganismos do solo através do ensaio de slides de contato e microscopia

Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Bradley Schmitz

O solo compreende a fina camada na superfície da Terra, contendo fatores bióticos e abióticos que contribuem para a vida. A porção abiótica inclui partículas inorgânicas variando em tamanho e forma que determinam a textura do solo. A porção biótica incorpora resíduos vegetais, raízes, matéria orgânica e microrganismos. A abundância e a diversidade dos micróbios do solo são expansivos, pois um grama de solo contém 10 bactérias7-8, 106-8 actinomycetes, 10fungos 5-6, 103 leveduras, 10 protozoários4-6, 103-4 algas e 5 nematoides. Juntos, os fatores bióticos e abióticos formam arquiteturas em torno das raízes vegetais, conhecidas como rizosfera, que fornecem condições favoráveis para os microrganismos do solo.

Fatores bióticos e abióticos promovem a vida nos solos. No entanto, eles também contribuem com dinâmicas estressantes que limitam micróbios. O estresse biótico envolve competição entre a vida para se adaptar e sobreviver em condições ambientais. Por exemplo, micróbios podem secretar substâncias inibitórias ou tóxicas para prejudicar os microrganismos vizinhos. Penicillium notatum é um fungo notório, pois reduz a competição por nutrientes produzindo um antimicrobiano, que os humanos colhem para criar a penicilina farmacêutica. As tensões abióticas surgem de propriedades físicas ou químicas que limitam a sobrevivência microbiana, como luz, umidade, temperatura, pH, nutrientes e textura.

Principles

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Observar diretamente as inter-relações entre organismos do solo, partículas e comportamentos em ambientes variados do solo é difícil, mas o ensaio de slides de contato, também conhecido como técnica de deslizamento enterrado, desenvolvido por Rossi et al. (1936) fornece um ponto de vista instantâneo na microbiologia do solo. Este método é útil para observar fungos do solo, actinomycetes e bactérias através de microscopia. Embora não se destine a quantificações microbianas, pois implica apenas uma pequena porção de um ambiente heterogêneo maior.

Este método é facilmente executado enterrando um deslizamento de vidro no solo por vários dias, em seguida, fixando os microrganismos na lâmina com ácido acético. Os micróbios são manchados com corante rose bengala e observados via microscopia usando imersão de óleo no objetivo de 100X. Três grupos microbianos podem ser distinguidos, pois as bactérias aparecem como pequenas formas arredondadas, filamentos de actinomícetos como cordas finas, e hifas fúngicas como fios grossos. No solo, quase todas as bactérias são menores e mais redondas do que aquelas em cultura pura devido ao estresse nutricional, o que causa encolhimento e arredondamento para uma superfície mais favorável: razão de volume. As formas escuras irregulares não manchadas são partículas de solo. Diferentes alterações de nutrientes podem ser adicionadas ao solo para fornecer fontes de carbono e glicose que promovam o crescimento e as interações microbianas. Esta técnica permite fácil observação da microbiologia do solo e ajuda a identificar diversos organismos presentes no ambiente.

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Procedure

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1. Preparação do Microcosmo do Slide do Solo

  1. Colete o solo do jardim da superfície (profundidade de 0-6" e pese 150 g de solo em duas xícaras separadas.
    1. Se o solo tem alta densidade de matéria orgânica, pesa 100 g.
  2. Rotule uma xícara de "Tratamento" e a outra "Controle".
  3. Calcule a quantidade de água necessária para alterar o teor de umidade.
    1. O teor de umidade é muitas vezes próximo da capacidade de campo.
      Equation 1 1
  4. Meça a quantidade de água destilada com um cilindro graduado.
  5. Despeje a quantidade de água destilada em dois frascos.
  6. Rotule um frasco de "Tratamento" e o outro "Controle".
  7. Altere a água no frasco "Tratamento" com glicose suficiente para uma concentração final de glicose do solo de 1%, de acordo com uma base de peso seco no solo "Tratamento".
  8. Adicione 200 mg NH4NO3 no frasco "Tratamento" e mexa para dissolver as alterações. O nitrato serve como uma fonte de nitrogênio de nutrientes para os micróbios do solo.
  9. Não altere o frasco "Controle".
  10. Em pequenas alíquotas de aproximadamente 50 mgs, misture o conteúdo do frasco de "Tratamento" no copo "Tratamento". Mexa com uma espátula após cada adição de alíquota.
  11. Em pequenas alíquotas, misture o conteúdo do frasco "Controle" no copo "Controle". Mexa com uma espátula após cada adição de alíquota.
  12. Rotule quatro slides de microscópio limpos: dois slides "Treatment" e dois slides "Control".
  13. Insira os dois slides "Treatment" no copo de solo "Treatment" e insira os dois slides "Control" no copo de solo "Control". Deixe 2 cm de cada slide projetando acima da superfície do solo, e certifique-se de deixar uma lacuna entre os dois slides.
  14. Cubra os copos com plástico e fixe-o com um elástico.
  15. Puna o envoltório várias vezes para permitir o ar, mas ainda assim evitar a evaporação excessiva.
  16. Registo o peso das duas xícaras.
  17. Incubar os copos cheios de solo à temperatura ambiente em uma área/incubadora designada por 7 dias.

2. Mancha de slides e microscopia

  1. Registo o peso das duas xícaras.
  2. Calcule a umidade do solo no momento da remoção do slide.
  3. Remova os dois slides de cada xícara pressionando cada slide para uma posição inclinada e retirando para que a face superior do slide não seja perturbada.
  4. Identifique e marque o lado do slide a ser manchado e observado.
  5. Toque suavemente os slides na parte superior do banco para remover grandes partículas do solo.
  6. Usando uma toalha de papel úmida, limpe a face inferior dos slides. Seque os slides à temperatura ambiente.
  7. Usando óculos de proteção e segurando cada lâmina com fórceps, mergulhe os slides em 40% (v/v) ácido acético por 1-3 min sob um capô de fumaça.
  8. Lave o excesso de ácido sob um fluxo suave de água.
  9. Usando uma garrafa de porta-gotas, cubra a superfície dos slides com a fenólica Rose Bengala. Apoie o slide em um rack de manchas sobre um recipiente para pegar o excesso de mancha. Tenha cuidado, não lave com força que possa remover microrganismos da superfície dos slides.
  10. Manche os slides por 5-10 min. Não deixe o slide ficar seco. Adicione mais manchas conforme necessário.
  11. Lave delicadamente as lâminas para remover o excesso de manchas.
  12. Deixe os slides secarem à temperatura ambiente.
  13. Utilizando o objetivo de imersão do óleo, observe o slide usando um microscópio(Figura 1).

Figure 1
Figura 1. Um slide sob um microscópio.

As relações entre os diversos organismos e componentes inorgânicos no solo são vitais para a compreensão das mudanças do solo e das tensões ambientais, mas não podem ser elucidadas sem visualização direta.

O solo, um sistema extremamente complexo, é um habitat para milhões de organismos diversos. A região do solo diretamente ao redor das raízes das plantas, em particular, chamada de rizosfera, contém uma variedade única de organismos que são diretamente influenciados pelas raízes das plantas.

O componente abiótico, ou não biológico, da rizosfera inclui partículas inorgânicas que variam em tamanho e forma que contribuem para a textura do solo. A porção biótica, ou biológica, inclui resíduos vegetais, raízes, matéria orgânica e microrganismos.

Este vídeo demonstrará a visualização direta dos componentes bióticos e abióticos do solo da rizosfera, a fim de entender os fatores que afetam as mudanças do solo e prever tensões ambientais.

Organismos microscópicos tendem a residir na água localizada dentro dos poros do solo. As bactérias estão entre os organismos mais simples e abundantes presentes no solo, e são encontradas em muitas morfologias, incluindo esferas chamadas cocci, hastes chamadas bacilos e formas filamentosas.

Espécies fúngicas, como leveduras e moldes, são os segundo organismos mais abundantes no solo. Eles trabalham para se decompor e reciclar matéria orgânica morta. Fungos filamentosos microscópicos diferem visualmente de outros microrganismos, pois possuem hifas longas e ramificadas que liberam esporos.

A observação direta das relações entre esses organismos é desafiadora, mas pode ser alcançada usando um ensaio de slide de contato. Este método é realizado submergindo um deslizamento de vidro no solo por vários dias e permitindo que os organismos e partículas do solo adsorvam a superfície de slides.

O slide é então removido em um ângulo para evitar a mancha da superfície. Os micróbios são fixados com ácido acético, e manchados com mancha de Bengala Rosa para permitir a visualização através de microscopia leve.

Agora que você entende os princípios por trás da técnica de ensaio de slides de contato, vamos dar uma olhada no processo em laboratório.

Primeiro, coletar solo de jardim de superfície e transferir o solo para o laboratório. Pesar 150 g de solo nos 2 recipientes separados. Um recipiente deve ser rotulado como a amostra de tratamento, que será modificada com nutrientes para incentivar a rápida proliferação de organismos. Rotule o outro como o controle, que será inalterado.

Calcule o teor de água no solo, utilizando a técnica mostrada no vídeo Determinação do Conteúdo de Umidade no Solo desta coleção. Com base neste cálculo, determine a quantidade de água no solo em uma base de peso seco. Agora calcule a quantidade de água que precisa ser adicionada para dar um teor de umidade do solo de 15%. Isso traz a umidade para a capacidade de campo, ideal para o crescimento do microrganismo.

Meça a quantidade calculada de água destilada usando um cilindro graduado. Despeje o volume calculado de água em cada recipiente. Com base no peso seco previamente determinado do solo, calcule a quantidade de glicose necessária para alcançar uma concentração final de glicose do solo de 1% por massa, utilizando a base de peso seco. Pesar essa quantidade de glicose e adicioná-la apenas ao recipiente de tratamento.

Pese 200 mg de nitrato de amônio e adicione-o apenas ao recipiente de tratamento. O nitrato de amônio serve como a fonte de nutrientes nitrogenados para os micróbios do solo. Misture a mistura de nitrato de solo, glicose e amônio no recipiente.

Em seguida, rotule 4 slides de microscópio limpo: dois como tratamento e dois como controle. Insira as duas lâminas de tratamento no recipiente do solo de tratamento. Deixe uma seção de cada slide exposta acima da superfície do solo e certifique-se de que há uma lacuna entre os dois slides.

Insira as duas lâminas de controle no recipiente do solo de controle da mesma forma. Cubra os copos com plástico e fixe com um elástico. Puna o plástico várias vezes para permitir a transferência de ar, mas ainda assim evitar a evaporação excessiva.

Finalmente, pese ambas as xícaras, registe seu peso e incuba-as em uma área designada à temperatura ambiente por sete dias.

Após a incubação de sete dias, calcule o teor de umidade do solo pesando os copos do solo. Determine se o peso foi perdido devido à evaporação da água e substitua a água, se necessário.

Remova o envoltório plástico do recipiente e remova as duas lâminas do solo pressionando cada lâmina para uma posição inclinada e retirando para que a face superior do slide não seja perturbada.

Toque suavemente nas lâminas para remover grandes partículas do solo. Usando uma toalha de papel úmida, limpe a face inferior dos slides. Deixe-os secar em temperatura ambiente em um capô de fumaça. Uma vez seco, pegue um slide com fórceps e mergulhe-o em ácido acético por 1 a 3 min.

Enxágüe a parte superior do slide com um fluxo suave de água destilada para remover o excesso de ácido. Repita estes passos para todos os slides. Deixe as lâminas secarem.

Apoie o slide em um rack de manchas sobre um recipiente para capturar o excesso de corante. Usando um porta-gotas, cubra suavemente a superfície de cada lâmina com corante de Rose Bengala fenólico. Deixe os slides mancharem por 5 a 10 minutos, tomando o cuidado de adicionar mais corante conforme necessário para manter os slides molhados. Enxágue suavemente os slides com água para remover o excesso de manchas e deixe os slides secarem à temperatura ambiente.

Examine os slides em um microscópio leve, usando um objetivo de imersão de óleo. O solo tratado terá mais micróbios do solo.

As interações espaciais entre organismos fúngicos e bacterianos em amostras típicas do solo podem ser facilmente visualizadas. As partículas do solo exibem formas escuras e irregulares.

Organismos fúngicos exibem hifas de espasma grossa, enquanto os actinomycetes exibem hifas finas filamentosas.

As bactérias são encontradas como pequenas formas de cocci ou haste, tipicamente em aglomerados, em partículas de solo ou forro de hifas fúngicas.

O isolamento direto dos organismos do solo é importante para a compreensão das características do solo e do meio ambiente.

Nematoides entomopatômicos são vermes redondos microscópicos que parasitam insetos. Embora não sejam visualizados no ensaio de slides de contato, eles podem ser isolados a partir de amostras de solo coletadas, como mostrado neste exemplo.

Primeiro, os nematoides foram iscas no solo usando insetos identificados a partir do exame visual. Nematoides foram isolados da isca de insetos mortos, colocando os insetos mortos em um ambiente úmido e escuro e permitindo que os nematoides migrassem para a água circundante. Os nematoides foram então coletados da água, e analisados.

Fungos filamentosos são vitais para a saúde do solo devido ao seu papel na reciclagem de nutrientes. Neste exemplo, foi realizado o isolamento e a observação de fungos filamentosos do solo.

Amostras de solo foram diluídas com água, e adicionadas a placas de ágar estéril rose bengal. A estreptomicina impediu o crescimento bacteriano e possibilitou o crescimento fúngico. Colônias fúngicas foram contadas e montadas em um escorregador de vidro usando fita adesiva. Os fungos foram então imagens usando um microscópio leve.

Os microrganismos do solo naturalmente quebram componentes no solo, como plantas mortas e organismos. Foi examinada a biodegradação e colonização de filmes plásticos biodegradáveis, como mostrado neste exemplo.

Fungos foram isolados de filmes plásticos enterrados no solo por vários meses. Os fungos foram então testados individualmente para o crescimento em filmes plásticos. As películas plásticas foram então incubadas com a cepa fúngica selecionada sem mídia de crescimento, a fim de observar a degradação direta do plástico pelos fungos.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE ao ensaio de slides de contato para imagens qualitativas de micróbios do solo. Agora você deve entender como preparar o slide de contato, e visualizar micróbios do solo. Obrigado por assistir!

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Results

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Fungos exibem higefa grossa e filamentosa(Figura 2). Actinomycetes exibem hifa fina e filamentosa. As bactérias exibem pequenas formas de cocci ou haste. Eles são frequentemente encontrados em aglomerados, em partículas do solo, ou forrando hifas fúngicas. As partículas do solo apresentam formas irregulares e escuras(Figura 3).

Figure 2
Figura 2. Entre em contato com a imagem do slide usando a lente objetiva 100X.
Foto cortesia W.H. Fuller.

Figure 3
Figura 3. Entre em contato com a imagem do slide usando a lente objetiva 100X.
Foto cortesia W.H. Fuller.

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Applications and Summary

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O ensaio de slide de contato, também referido como o deslizamento enterrado, é uma técnica simples utilizada para observar qualitativamente a biota do solo. Este ensaio mostra qualitativamente as interações espaciais entre hifae fúngica, filamentos de actinomíceto, bactérias e partículas do solo. Indivíduos ou indústria podem empregar este ensaio para reunir conhecimento sobre a saúde de um determinado solo no que diz respeito à agricultura, jardinagem, compostagem, ensino e estudo. No entanto, essa técnica não quantifica a microbiota do solo, pois abrange apenas um pequeno retrato de um ambiente heterogêneo maior.

As relações com o organismo do solo podem ser observadas realizando o ensaio de slides de contato e visualizando os resultados através da microscopia de imersão em óleo 100X(Figuras 2 e 3). A simplicidade e facilidade para realizar este ensaio torna-o uma ótima técnica inicial para aqueles que nunca foram expostos à microbiologia e podem estar visualizando microrganismos através de um microscópio pela primeira vez.

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References

  1. Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
  2. Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
  3. Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).

Transcript

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