Overview
Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner
O espectro de pesquisas em microbiologia ambiental é amplo em escopo e potencial de aplicação. Se o trabalho é de bancada com isolados bacterianos conhecidos, ou no campo coletando amostras de solo ou água contendo isolados bacterianos desconhecidos, a capacidade de discernir rapidamente e visualmente populações culturais de interesse permanece de grande importação para microbiologistas ambientais ainda hoje com a abundância de técnicas moleculares disponíveis para uso. Este vídeo demonstrará uma dessas técnicas, conhecida como mancha gram.
Principles
A mancha de Gram é uma técnica clássica e importante de coloração que permanece amplamente utilizada por microbiologistas ambientais. Semelhante a uma simples mancha, permite a avaliação da morfologia celular bacteriana (por exemplo,cocci, hastes, esporos- ex), tamanho e arranjo(por exemplo,cadeias ou aglomerados). Além disso, permite diferenciar bactérias em dois grupos distintos de princípios — Gram-negativo e Gram-positivo — de acordo com a composição e estrutura da parede celular(Figura 1).
A coloração de grama é um processo de várias etapas. Antes da coloração, uma mancha bacteriana é preparada usando uma cultura de placa, inclinação ou caldo. A preparação para a mancha é seca e fixada em uma lâmina de vidro limpa. Uma mancha primária de violeta cristalina é então aplicada à mancha fixa. O violeta cristalina é uma mancha básica composta por íons coloridos carregados positivamente (ou seja, cromóforos) que formam ligações iônicas fracas com grupos funcionais negativamente carregados presentes na parede celular bacteriana. Depois de enxaguar suavemente o toboágua com água, o iodo de Gram é aplicado, e forma complexos insolúveis com o cristal violeta na parede celular. Os complexos de cristal violeta-iodo se ligam ainda mais com peptidoglycan, um componente principal das paredes celulares bacterianas. Após uma segunda lavagem de água, um agente descolorante é brevemente aplicado à mancha. Para bactérias Gram-negativas, o complexo cristalino-iodo é lavado durante a etapa de descoloração, com bactérias Gram-positivas retendo a mancha roxa. Uma terceira e última lavagem de água é seguida por uma contra-mancha de safran que colore as bactérias Gram-negativas rosa ou vermelha.
Figura 1. Comparação da parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
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Procedure
1. Coleta de Amostras
- Coletar amostras de solo e transportar para o laboratório para análise microbiana.
- No laboratório, pese uma amostra de 10 g usando um equilíbrio analítico.
- Diluir a amostra 1:10 em 95 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (10 partes de solo equivale a 5 partes de líquido aquoso) e vórtice para misturar(Figura 2, Passo 1).
- Realizar diluições subsequentes de 1:10 até pelo menos 10-5 g de solo por mL, e diluições selecionadas em placas de propagação em réplicas de dois ou três em um meio de ágar de baixo nutriente(por exemplo,R2A) (Figura 2, Passos 2-3).
- Incubar as placas durante uma semana em temperatura ambiente(Figura 2, Passo 4).
- Selecione uma ou duas colônias para isolamento e listrada em placas de ágar fresco(Figura 3, Passos 1-3).
- Incubar as placas de raia por dois a três dias em temperatura ambiente(Figura 3, Passo 4).
2. Preparação de manchas bacterianas
- Observe as placas de listras para colônias isoladas.
- Para preparar cada preparação de difamação, mergulhe um laço inoculante em etanol, esterilizar a chama e coloque de 1 a 2 laços de água destilada estéril no centro de lâminas de vidro pré-limpas.
- Esterilize o laço de inoculação novamente como descrito anteriormente. Uma vez resfriado, remova uma pequena quantidade de cultura de uma única colônia isolada e misture-a com as gotículas de água no escorregador (a mancha deve se assemelhar ao leite desnatado diluído). O laço inoculante deve ser resfriado antes do isolamento da colônia. Um laço muito quente fará com que a colônia e/ou o meio espirrem, o que pode levar à aerossolização de bactérias. Geralmente, quando o laço é muito quente para uso, um som "assobiar" será ouvido quando aplicado ao ágar ou colônia. O resfriamento inadequado do loop também pode resultar em transferência de cultura para slide menos eficiente e distorção da morfologia celular.
- Espalhe a mancha sobre a superfície do slide medindo aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm, e deixe-a secar. É importante que a secagem do ar ocorra sob condições de fluxo laminar. Os slides não devem ser secados para não interromper a mancha. Além disso, os slides não devem ser secos à chama, a fim de manter a morfologia celular.
- Após a secagem, o calor corrija a mancha passando rapidamente pelo escorregador através de uma chama de 2-3x. O slide não deve ser mantido parado na chama, para evitar distorção da morfologia celular e/ou danos ao escorregador de vidro.
3. Mancha de grama
- Fixar o slide em uma extremidade usando um grampo de roupa limpo.
- Cubra a mancha com violeta cristalina (mancha primária) e segure por 2 a 3 minutos.
- Lave cuidadosamente o escorregador com água destilada. O fluxo de água não deve ser direcionado para a mancha, a fim de evitar danos e/ou desprendimento da lâmina de vidro.
- Cubra a mancha com o iodo do Gram e segure por 2 minutos, depois enxágue suavemente o toboágua com água.
- Descolorir a mancha usando 95% de etanol até que a mancha não lave mais do escorregador (isso geralmente não leva mais de 20 s dependendo da espessura da mancha), depois enxágue imediatamente com água destilada. Esta etapa é fundamental para evitar a descoloração excessiva do slide, o que pode levar a uma designação falsa de mancha gram (ou seja, variável Gram).
- Adicione a contra-mancha (safranin) à mancha e segure por 30 s. Em seguida, enxágue suavemente o escorregador com água destilada e enxugue a mancha usando papel absorvente.
4. Observação microscópica de slides
- Observe os slides usando objetivos baixos (por exemplo,4X ou 10X), de alta seca(por exemplo,40X) e de imersão de óleo (100X). Para imersão em óleo, adicione o óleo diretamente à mancha.
- Para obter resultados representativos de bactérias do solo Gram-positivo e Gram-negativos, consulte as Figuras 4 e 5.
Figura 2. Técnica de diluição e revestimento de difusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Isolamento da colônia usando a técnica da placa de raia.
Figura 4. Gram-positivo bactéria do solo Staphylococcus aureus.
Figura 5. Gram-negativo bactéria do solo Escherichia coli.
A coloração de grama permite uma visualização rápida da morfologia bacteriana e ampla distinção celular de uma ampla gama de amostras ambientais. Para manchar bactérias, uma mancha uniforme é aplicada em um lado de vidro e permitida a secar. Após a fixação de calor da mancha, a violeta cristalina é aplicada.
Um agente descolorante enxagua o cristal violeta das células Gram-negativas, mas não as células Gram-positivas. Um segundo corante, tipicamente safranin, é usado como uma mancha de fundo para visualizar as células Gram-negativas. Uma vez manchadas, as células podem ser avaliadas para morfologia celular, tamanho e arranjo, como correntes ou aglomerados.
Este vídeo demonstrará como preparar uma amostra ambiental, isolar as espécies bacterianas encontradas nela, e executar uma mancha de Grama nas colônias isoladas
A coloração grama permite a categorização da maioria das bactérias em duas classes estruturais amplas: Gram-positive e Gram-negativo. Embora ambas as classes tenham uma membrana de plasma fosfolipídida subjacente, a estrutura da parede celular varia muito. A parede celular Gram-positive é composta principalmente de uma espessa camada de peptidoglycan, que é um polímero que consiste em açúcares e aminoácidos. As paredes celulares gram-negativas têm uma camada mais fina de peptidoglycan, sanduíche entre uma segunda membrana lipídica. Esta membrana externa normalmente contém lipopólises.
O violeta cristalina carregada positivamente liga-se fracamente à parede celular bacteriana carregada negativamente. O iodo de Gram forma um complexo insolúvel com o corante violeta cristalino, fixando-o assim na parede celular.
Durante a etapa descoloração, o peptidoglycan nas células Gram-positivas é desidratado, fazendo com que se contraa e preenalize os complexos de cristal violeta-iodo. Nas células Gram-negativas, o agente descolorante compromete a membrana externa, aumentando sua porosidade. Isso permite que os complexos de cristal violeta-iodo sejam lavados.
Agora que você entende os princípios por trás da mancha de gram bactérias do solo, vamos ver o processo realizado em bactérias do solo em laboratório.
Depois de coletar uma amostra de solo no campo, leve-a para o laboratório para análise. Refine a amostra com uma peneira e pese 10 g do solo peneirado usando um equilíbrio analítico.
Diluir a amostra em 95 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato e vórtice para misturar. Realize diluições adicionais de 1 a 10, vórtices entre cada diluição. Transfira alíquotas de pelo menos 3 diluições sucessivas, para replicar placas de baixa agarose de nutrientes.
Após a esterilização da chama de etanol e o resfriamento de uma haste de vidro dobrada, tocando na mídia, espalhe a amostra sobre a superfície das placas. Incubar as placas em temperatura ambiente. Após incubar por 3 a 5 dias, selecione a maior diluição com 30 a 300 colônias discretas. Com um laço inoculante estéril, selecione colônias de interesse para o isolamento.
Coloque a colônia em uma seção de uma placa fresca. Esterilizando o laço entre listras, faça sucessivas listras em um padrão zig-zag em cada seção da placa para permitir o isolamento subsequente de colônias únicas discretas. Incubar as placas por 1 a 2 dias em temperatura ambiente.
Para iniciar a preparação de manchas bacterianas, conecte um clipe a uma lâmina de vidro pré-limpa para facilitar o manuseio. Para cada mancha bacteriana, limpe e esterilize uma alça inoculante. Coloque 2 laços de água destilada estéril no centro do escorregador.
Depois de esterilizar o laço novamente, remova uma pequena quantidade de cultura de uma colônia isolada, e misture com a água no escorregador. É importante esfriar o laço antes de tocar a cultura tocando uma porção não vacinada de ágar várias vezes. A mancha deve se assemelhar ao leite diluído. Deixe o slide secar à temperatura ambiente. Após a secagem, o calor corrija a mancha passando rapidamente por uma chama.
Uma vez seco, pipeta cristal violeta sobre a mancha, e deixe sentar-se por 2 - 3 min. Enxágue cuidadosamente o slide com água destilada, apontando o fluxo direto para o topo do escorregador, permitindo que a água flua suavemente para baixo. Não aponte o fluxo de água diretamente para a mancha.
Cubra o slide com iodo da vovó. Depois de 2 minutos, enxágue delicadamente com água destilada. Descolorir o escorregador com 95% de etanol até que a mancha não desaja mais. Enxágue imediatamente com água destilada. Isso limitará o excesso de descoloração da mancha.
Adicione safranin como contra-mancha à mancha por 30 s. Isso manchará todas as células Gram-negativas presentes. Enxágue suavemente com água destilada e enxugue a mancha com papel absorvente. Observe o slide resultante com um microscópio. Use um objetivo de baixa potência primeiro para fazer ajustes grosseiros e encontrar uma porção ideal da mancha antes de passar para o campo de visão menor das ampliações mais altas.
Após mais imagens e ajuste a mancha com um objetivo de potência média, adicione óleo de imersão diretamente à mancha. O óleo é necessário para objetivos de alta potência que fornecerão os melhores micrografos. As bactérias gram-positivas aparecerão de cor azul ou roxa, enquanto as células Gram-negativas serão vermelhas ou rosas. Além da estrutura da parede celular, a forma e o arranjo são elucidados a partir dos micrografos resultantes.
A capacidade de coloração de Gram para estudar bactérias qualitativamente é importante para uma ampla gama de campos científicos.
O solo é apenas uma das fontes ambientais das quais as bactérias podem ser isoladas e analisadas. Para água potável, a preparação da amostra deve ser modificada. Amostras de água da torneira podem ser extraídas de uma torneira, e banhadas em meios de crescimento que facilitam o crescimento de diversas colônias bacterianas heterotróficas. Ao emplacar em um meio como o R2A, o processo é quase idêntico ao procedimento do solo.
Para certas técnicas de identificação bacteriana, os parâmetros dependem do tipo de parede celular das bactérias de interesse. Neste exemplo, o sangue de um paciente séptico foi testado e foi encontrado abrigando bactérias Gram-positivas.
Com essas informações, foram escolhidas sondas de ácido nucleírico de peptídeos específicas da espécie que se ligariam ao rRNA das células. Estas sondas foram ligadas a corantes fluorescentes que foram usados para identificar as espécies presentes.
Devido às diferenças fundamentais na estrutura celular Gram-positiva e negativa, as bactérias têm respostas únicas para outros compostos além da violeta cristalina. Este experimento procurou isolar Clostridium difficile, uma bactéria Gram-positiva, de amostras fecais. A cicloserina, que inibe o crescimento de células Gram-negativas, foi adicionada à placa de ágar. As células Gram-positivas que cresceram na placa foram ainda mais isoladas através de outros métodos.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à mancha de Gram para estudos ambientais. Agora você deve entender os benefícios do processo e como executar a técnica e utilizar os resultados. Obrigado por assistir!
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Applications and Summary
A mancha de Gram é usada nos muitos subágros da microbiologia ambiental e clínica. Cientistas de qualidade da água podem usar a mancha de Gram como uma ferramenta confirmatória para a detecção de bactérias fecais em amostras de água. Isolados bacterianos de solos são manchados de Gram para caracterizar ainda mais as comunidades de solos culturais. Para microbiologistas ambientais, a mancha de gram auxilia na categorização das populações bacterianas de acordo com a estrutura da parede celular. Isso, por sua vez, fornece informações sobre a capacidade geral de uma determinada comunidade microbiana de suportar a dessecação e outros estressores ambientais. O conhecimento da designação de manchas gram também é importante na pesquisa e desenvolvimento de desinfetantes e outros antimicrobianos, já que as bactérias Gram-positivas tendem a ser mais resistentes à inativação por químicas particulares do que as bactérias Gram-negativas.
Para aplicações clínicas de microbiologia, a mancha de Gram é usada para confirmar a identidade dos agentes de doenças bacteriológicas, juntamente com os métodos tradicionais de diagnóstico. É também de grande ajuda quando a colheita falhou, ou não é uma opção. A coloração gramada de amostras clínicas pode revelar a presença de agentes etiológicos que podem não ter sido observados de outra forma.
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