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침전물에서 생물지표 추출-가속 용매 추출
 
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침전물에서 생물지표 추출-가속 용매 추출

Overview

출처: 제프 살라컵 연구소 - 매사추세츠 대학교 애머스트

고고학 및 박테리아 의 제품군에 의해 생성 된 글리세롤 -dialkyl 글리세롤 테트라에테르 (GDGTs)라는 유기 바이오 마커의 그룹의 분포는 공기 또는 수온1,2에대한 응답으로 예측 가능한 방식으로 변화하는 현대 퇴적물에서 발견되었다. 따라서, 공지된 나이의 퇴적물의 순서로 이러한 바이오마커의 분포는 천년의 시간대에 데카달에 공기 및/또는 수온의 진화를 재구성하는 데 사용될 수있다(도 1). 고생물학이라고 불리는 과거의 기후의 긴 고해상도 기록의 생산은 수백, 아마도 수천 개의 샘플의 신속한 분석에 달려 있습니다. 초음파 처리 또는 Soxhlet과 같은 오래된 추출 기술은 너무 느립니다. 그러나, 새로운 가속 용매 추출 기술은 효율성을 염두에 두고 설계되었다.

Figure 1
그림 1. 과거 ~27,000년3년동안 지중해 동부의 해수면 온도(SST)의 변화를 보여주는 고생물학 기록의예. 이 기록은 ~115개의 샘플로 구성되며 동위 상류GDGT 계의 TEX86 SST 프록시를 기반으로 합니다.

Principles

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가속용매 추출은 고온(~100°C)과 압력(~1,200psi)을 활용하여 추출 공정의 역학을 증가시키는 상표(Thermo Scientific Dionex) 추출 방법입니다. 가속 용매 추출기 또는 ASE(그림2)라고불리는 추출기는 최대 24개의 개별 샘플을 보유할 수 있습니다. ASE가 로드되고 실행되도록 설정하면 완전히 자동화됩니다. ASE는 추출 온도, 압력, 용매 부피, 용매 혼합물, 지속 시간, 헹구기 및 반복이 모두 샘플에서 샘플로 조정할 수 있습니다. 대부분의 유기 지질 화학 실험실은 이제 ASE를 용매 추출의 표준 방법으로 사용합니다.

Figure 2
그림 2. 가속용매 추출기(ASE).

가속용매 추출은 많은 수의 지질 퇴적물 샘플과 유기 바이오마커를 분리하는 데 사용되는 빠르고 효율적이며 높은 처리량 기술입니다.

전통적으로 초음파 처리 또는 Soxhlet과 같은 추출 방법이 사용되지만 이러한 프로토콜의 단점은 상세한 고생물학 재건을 위해 충분한 재료를 처리하기에는 너무 느리다는 것입니다. 새로운 기술인 가속 용매 추출 또는 ASE 방법은 효율성과 높은 처리량을 염두에 두고 개발되었습니다.

ASE 방법은 고온과 고압의 조합을 사용하여 샘플을 추출하고 비교적 빠른 단일 준비 실행에서 여러 샘플을 수행 할 수 있습니다.

이 비디오는 퇴적물에서 바이오 마커를 추출하는 방법을 자세히 설명하는 시리즈의 세 번째 입니다. 그것은 절차를 커버하고 초음파 처리 또는 Soxhlet 추출을 통해 ASE의 장점에 대한 통찰력을 제공합니다.

가속용매 추출에서 샘플은 강철 셀에 적재되어 회전 목마에 로드됩니다. 각 샘플 셀에 대한 수집 바이알도 별도의 회전 목마에 로드됩니다. 계측기는 샘플 셀을 내부 오븐에 로드합니다. 용매는 충분한 압력에 도달 할 때까지 일련의 밸브를 통해 용매 병에서 펌핑됩니다.

이 압력은 샘플 및 별별에 의해 지시된 시간의 양동안 유지됩니다. 이어서, 용매는 리졸브 라인을 통해 샘플 셀로부터 플러시되어 해당 수집 유리알로 한다. 이 프로세스는 여러 번 반복될 수 있습니다. 온도, 압력 및 지속 시간은 모두 시료에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다.

사용되는 고온은 추출의 운동학을 증가시키면서 고압으로 용매가 휘발되는 것을 막습니다. 수집 유리병에는 총 지질 추출물이 포함되어 있으며 샘플 셀에 남은 내용이 잔류물이라고 합니다. 그것은 비 유기 물질뿐만 아니라 용매 추출할 수 없는 유기 물질, 케로겐이라고 구성된다.

이제 우리는 가속 용매 추출 뒤에 원리를 잘 알고, 이 실험실에서 수행되는 방법을 살펴 보자.

관심 있는 샘플을 수집한 후; 이 시리즈의 다른 비디오에서 설명한 것처럼 동결 건조, 균질화 및 오염 제거.

모든 샘플이 준비되면 추출할 각 샘플에 대한 셀을 조립하고 빈 용으로 1개를 추가합니다. 이렇게 하려면 끝 캡을 셀 본문에 나사로 나사로 세입니다. 용매 린 핀셋을 사용하여 연소 유리 섬유 필터를 각 핀셋 위에 놓습니다. 플런저로 필터를 천천히 부드럽게 누릅니다.

각 샘플에 대해 셀 바디에 숫자로 레이블을 지정하고 빈 칸에 별도로 레이블을 지정합니다. 연소된 계량 주석을 실험실 규모에 놓고 타레에 놓습니다. 주걱을 용매로 헹구고 5~10g의 시료를 계량 주석으로 옮기고 질량을 기록합니다.

계량 주석의 모든 재료를 해당 셀로 전송합니다. 다른 유리 섬유 필터를 위에 놓고 샘플 상단에 도달할 때까지 부드럽게 탬프합니다.

디스퍼넌트를 추가, 같은 diatomaceous 지구 또는 모래등, 그것은 거의 가득 때까지, 세포 체체 스레드에 어떤 파편을 얻기 위해 주의 되 고. 다른 끝 캡으로 셀 의 상단을 캡합니다. 각 샘플과 공백에 대해 이러한 단계를 반복합니다.

각 수집 유리병에 해당 샘플 셀 또는 빈 수와 유리병 캡을 표시합니다. 각 셀을 ASE 상단 트레이의 번호가 매겨진 슬롯에 넣습니다. ASE의 키패드를 이용하여 추출 방법에 대한 파라미터를 설정하여 100°C 및 1,200 psi에서 추출한다. 10분의 정적 홀드로 각 샘플을 3회 추출하고 정적 홀드 사이의 총 부피의 50%로 셀 바디를 플러시합니다.

다음으로 용매 병에 모든 샘플을 추출할 수 있을 만큼 충분한 내용이 포함되어 있는지 확인합니다. 실행을 시작하기 전에 악기 라인을 3 번 헹구는 다. 마지막으로, 시작을 누릅니다.

ASE에서 바이알을 제거합니다. 이제 바이오마커가 추출되었으므로 분석 전에 정제되어야 합니다.

가속 용매 추출은 다양한 응용 분야에 활용할 수있는 다양한 기술이며, 그 중 일부는 여기에서 탐구됩니다.

가속용매 추출은 식품을 포함한 다른 유형의 샘플에도 사용될 수 있습니다. 농약 오염을 테스트하기 위한 잔류물 분석은 과일이나 채소와 같은 식품의 안전성과 품질을 확인하기 위해 규제 및 산업 시설에서 자주 수행됩니다. ASE는 식품 샘플에서 유기염소 살충제를 추출하고 농산물에 존재하는 잔류물의 종류 또는 수준을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 정보는 생산이 인간 또는 동물 소비에 적합한지 여부를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, dieldrin은 제품에 따라 음식에 백만 당 0 ~ 0.1 부품 이내로 발견되어야합니다.

식품 영양 성분은 ASE를 사용하여 추출할 수도 있습니다. 예를 들어, 높은 중력 지방 함량을 가질 수 있습니다 초콜릿 같은 제품, 추출 될 수 있습니다. 석유 에테르를 사용하여 지방은 초콜릿 샘플에서 분리할 수 있으며 정량 적 분석을 실시하여 알려진 초콜릿 수량당 정확한 지방 함량을 결정할 수 있습니다. 이 정보를 사용하여 규제 기관은 초콜릿 제조업체의 클레임을 확인하거나 제조업체가 정확한 식품 라벨을 만들기 위해 정보를 얻을 수 있습니다.

가속용매 추출 또는 ASE를 사용하여 지질 바이오마커 추출에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다. 후속 비디오에서 추가 처리 및 분석을 위한 방법을 찾을 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

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Procedure

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1. 필요한 재료의 수집

  1. 샘플을 추출합니다. 샘플(이 경우 퇴적물)은 추출 전에 동결, 동결 건조, 분쇄 및 균질화되며, 효율성을 극대화하기 위해 그룹으로 추출됩니다.
  2. 샘플크기에 따라 40mL 또는 60mL의 볼륨이 있는 수집 바이알을 사용합니다. 이 실험을 위해, 보로실리케이트 유리 바이알(40mL) 및 용매 안전 캡이 사용된다. 연소 유리, 보로실리케이트 유리 파이펫, 550°C의 계량 주석은 6시간 동안 가능한 유기 오염 물질을 제거합니다.
  3. 디클로로메탄(DCM)과 메탄올은 대부분의 유기 지질화학 실험실에서 흔히 볼 수 있습니다. 개별적으로 사용하길( 메탄올 먼저, DCM이 뒤따랐음)을 사용하여 사용 전에 실험실 도구와 유리 제품을 헹구는 것입니다. 메탄올(MeOH; 9:1)에 디클로로메탄을 혼합하여 광범위한 극성을 가진 바이오마커를 효율적으로 추출하는 데 사용됩니다. 용매는 유기 오염 물질이 없어야합니다.
  4. 이 실험에 사용할 가속 용매 추출기를 구하십시오.

2. 샘플 셀 의 준비

  1. 추출할 각 샘플에 대한 샘플 셀과 빈 1개를 어셈블합니다.
    1. 각 셀에 대해 끝 캡을 셀 본체의 한쪽 끝에 나사로 세면합니다.
    2. 용매 린핀셋을 사용하여 각 셀 위에 연소 유리 섬유 필터를 놓습니다. 그런 다음 필터 플런저를 사용하여 필터를 셀로 부드럽게 천천히 누릅니다.
    3. 각 샘플에 대해 셀바디(예: 1 -22)로 라벨을 지정하고 빈 셀에 "공백"을 작성합니다.
    4. 비블랭크를 투이코러스 어스(또는 모래)로 채우고 캡을 두 번째 끝 캡으로 채웁니다. 손으로 조입니다.

3. 샘플 준비

  1. 연소된 계량 주석을 실험실 규모에 놓고 용기를 놓습니다.
  2. 용매로 실험실 주걱을 헹구고 적절한 양의 샘플을 계량 주석으로 전송하고 질량을 기록합니다.
    1. 샘플의 질량은 유기물 함량에 따라 다릅니다. 상대적으로 유기물질 린(marine mud)은 여러 그램을 필요로 할 수 있으며, 유기물질이 풍부한 물질(잎 조직)은 훨씬 적게 필요할 수 있다.
  3. 계량 주석의 모든 재료를 준비된 ASE 셀로 옮기.
  4. 다른 유리 섬유 필터를 셀 상단에 놓고 필터 플런저를 사용하여 샘플 상단에 도달할 때까지 천천히 부드럽게 누릅니다.
  5. 거의 가득 차때까지 세포에 투이토마오스 어스(또는 모래)를 추가합니다. 셀 바디 스레드에서 이물질을 제거하십시오.
  6. 다른 끝 캡으로 셀 의 상단을 캡합니다.
  7. 각 샘플에 대해 3.1 - 3.6 단계를 반복합니다.

4. 컬렉션 바이알 준비

  1. 각 유리병에 해당셀(예: 1 - 22 또는 공백) 및 뚜껑을 ASE 컬렉션 바이알 캡으로 레이블을 지정합니다.

5. 추출

  1. 각 샘플 셀을 ASE 상단 트레이의 번호가 매겨진 슬롯에 넣습니다.
  2. 해당 컬렉션 바이알을 아래 ASE 트레이에 동일한 수 슬롯에 배치합니다.
  3. ASE의 키패드를 사용하여 추출 방법을 만듭니다. 100 °C 및 1,200 psi에서 추출하십시오. 10분의 정적 홀드로 각 샘플을 3배 추출하고 정적 홀드 사이에 총 부피의 50%를 사용하여 셀 바디를 플러시합니다.
  4. 용매 병에 모든 샘플을 추출하기에 충분한 용매가 포함되어 있는지 확인하십시오.
  5. ASE 제어 패드의 "헹도" 버튼을 눌러 실행을 시작하기 전에 ASE 3x를 헹군다.
  6. 시작을 누릅니다.

가속용매 추출은 많은 수의 지질 퇴적물 샘플과 유기 바이오마커를 분리하는 데 사용되는 빠르고 효율적이며 높은 처리량 기술입니다.

전통적으로 초음파 처리 또는 Soxhlet과 같은 추출 방법이 사용되지만 이러한 프로토콜의 단점은 상세한 고생물학 재건을 위해 충분한 재료를 처리하기에는 너무 느리다는 것입니다. 새로운 기술인 가속 용매 추출 또는 ASE 방법은 효율성과 높은 처리량을 염두에 두고 개발되었습니다.

ASE 방법은 고온과 고압의 조합을 사용하여 샘플을 추출하고 비교적 빠른 단일 준비 실행에서 여러 샘플을 수행 할 수 있습니다.

이 비디오는 퇴적물에서 바이오 마커를 추출하는 방법을 자세히 설명하는 시리즈의 세 번째 입니다. 그것은 절차를 커버하고 초음파 처리 또는 Soxhlet 추출을 통해 ASE의 장점에 대한 통찰력을 제공합니다.

가속용매 추출에서 샘플은 강철 셀에 적재되어 회전 목마에 로드됩니다. 각 샘플 셀에 대한 수집 바이알도 별도의 회전 목마에 로드됩니다. 계측기는 샘플 셀을 내부 오븐에 로드합니다. 용매는 충분한 압력에 도달 할 때까지 일련의 밸브를 통해 용매 병에서 펌핑됩니다.

이 압력은 샘플 및 별별에 의해 지시된 시간의 양동안 유지됩니다. 이어서, 용매는 리졸브 라인을 통해 샘플 셀로부터 플러시되어 해당 수집 유리알로 한다. 이 프로세스는 여러 번 반복될 수 있습니다. 온도, 압력 및 지속 시간은 모두 시료에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다.

사용되는 고온은 추출의 운동학을 증가시키면서 고압으로 용매가 휘발되는 것을 막습니다. 수집 유리병에는 총 지질 추출물이 포함되어 있으며 샘플 셀에 남은 내용이 잔류물이라고 합니다. 그것은 비 유기 물질뿐만 아니라 용매 추출할 수 없는 유기 물질, 케로겐이라고 구성된다.

이제 우리는 가속 용매 추출 뒤에 원리를 잘 알고, 이 실험실에서 수행되는 방법을 살펴 보자.

관심 있는 샘플을 수집한 후; 이 시리즈의 다른 비디오에서 설명한 것처럼 동결 건조, 균질화 및 오염 제거.

모든 샘플이 준비되면 추출할 각 샘플에 대한 셀을 조립하고 빈 용으로 1개를 추가합니다. 이렇게 하려면 끝 캡을 셀 본문에 나사로 나사로 세입니다. 용매 린 핀셋을 사용하여 연소 유리 섬유 필터를 각 핀셋 위에 놓습니다. 플런저로 필터를 천천히 부드럽게 누릅니다.

각 샘플에 대해 셀 바디에 숫자로 레이블을 지정하고 빈 칸에 별도로 레이블을 지정합니다. 연소된 계량 주석을 실험실 규모에 놓고 타레에 놓습니다. 주걱을 용매로 헹구고 5~10g의 시료를 계량 주석으로 옮기고 질량을 기록합니다.

계량 주석의 모든 재료를 해당 셀로 전송합니다. 다른 유리 섬유 필터를 위에 놓고 샘플 상단에 도달할 때까지 부드럽게 탬프합니다.

디스퍼넌트를 추가, 같은 diatomaceous 지구 또는 모래등, 그것은 거의 가득 때까지, 세포 체체 스레드에 어떤 파편을 얻기 위해 주의 되 고. 다른 끝 캡으로 셀 의 상단을 캡합니다. 각 샘플과 공백에 대해 이러한 단계를 반복합니다.

각 수집 유리병에 해당 샘플 셀 또는 빈 수와 유리병 캡을 표시합니다. 각 셀을 ASE 상단 트레이의 번호가 매겨진 슬롯에 넣습니다. ASE의 키패드를 이용하여 추출 방법에 대한 파라미터를 설정하여 100°C 및 1,200 psi에서 추출한다. 10분의 정적 홀드로 각 샘플을 3회 추출하고 정적 홀드 사이의 총 부피의 50%로 셀 바디를 플러시합니다.

다음으로 용매 병에 모든 샘플을 추출할 수 있을 만큼 충분한 내용이 포함되어 있는지 확인합니다. 실행을 시작하기 전에 악기 라인을 3 번 헹구는 다. 마지막으로, 시작을 누릅니다.

ASE에서 바이알을 제거합니다. 이제 바이오마커가 추출되었으므로 분석 전에 정제되어야 합니다.

가속 용매 추출은 다양한 응용 분야에 활용할 수있는 다양한 기술이며, 그 중 일부는 여기에서 탐구됩니다.

가속용매 추출은 식품을 포함한 다른 유형의 샘플에도 사용될 수 있습니다. 농약 오염을 테스트하기 위한 잔류물 분석은 과일이나 채소와 같은 식품의 안전성과 품질을 확인하기 위해 규제 및 산업 시설에서 자주 수행됩니다. ASE는 식품 샘플에서 유기염소 살충제를 추출하고 농산물에 존재하는 잔류물의 종류 또는 수준을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 정보는 생산이 인간 또는 동물 소비에 적합한지 여부를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, dieldrin은 제품에 따라 음식에 백만 당 0 ~ 0.1 부품 이내로 발견되어야합니다.

식품 영양 성분은 ASE를 사용하여 추출할 수도 있습니다. 예를 들어, 높은 중력 지방 함량을 가질 수 있습니다 초콜릿 같은 제품, 추출 될 수 있습니다. 석유 에테르를 사용하여 지방은 초콜릿 샘플에서 분리할 수 있으며 정량 적 분석을 실시하여 알려진 초콜릿 수량당 정확한 지방 함량을 결정할 수 있습니다. 이 정보를 사용하여 규제 기관은 초콜릿 제조업체의 클레임을 확인하거나 제조업체가 정확한 식품 라벨을 만들기 위해 정보를 얻을 수 있습니다.

가속용매 추출 또는 ASE를 사용하여 지질 바이오마커 추출에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다. 후속 비디오에서 추가 처리 및 분석을 위한 방법을 찾을 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

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Results

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추출의 끝에서, 각 샘플에 대한 총 지질 추출물 (TLE)이 있다. 각 바이알은 이제 퇴적물, 토양 또는 식물 조직에서 추출 가능한 유기물을 함유하고 있습니다. 이러한 TL은 분석될 수 있으며, 그들의 화학 성분은 확인되고 정량화된다.

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Applications and Summary

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추출된 시료의 TL은 고대 온도를 재구성하는 데 사용되는 GDGT를 포함한 다양한 유기 화합물을 함유하고 있습니다. 글리세롤-다이얼킬 글리세롤 테트라에테는 성장 온도에 대한 민감성을 보여주는 대형 바이오마커 제품군입니다. 핵심 알킬 그룹에 분기 패턴의 문자가 다른 GDGT, 분기 및 이소페노이드의 두 그룹이 있습니다 (그림3). 바다에서, 타우 마르카에오타라는 고고학의 국제적인 그룹은 isoprenoidal GDGTs4을생산하고 있습니다. 분지 GDGT는 토양5,호수, 호수 퇴적물6에서 아직 확인되지 않은 박테리아, 가능성이 산토박테리아7에서토양에서 생산된다. 고고학과 박테리아 모두 성장 온도에 따라 코어 알킬 군에서 메틸 가지및 고리 구조물의 수를 조정하고, GDGT는 수백만 년 동안 퇴적물에서 안정적이기 때문에 기후 변화의 긴 고해상도 기록이 생성됩니다.

TEX86 팔레오 수온 프록시는 특정 이소프레노이달 GDGT의 비율을 기반으로 하며, 각각 코어 알킬 군에서 86개의 탄소 원자를 함유하고있습니다(그림 3):

TEX86 = (GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4') /
(GDGT-1 + GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4')

그런 다음 원래 방정식과 같은 교정을 사용하여 팔레오 수온을 유추합니다.

TEX86 = 0.015T + 0.28 (R2 = 0.92)

제안: 쇼텐 외. 1, T가 고온인 곳. 예를 들어, 대형 호수나 열대 지방에서 사용하기 위한 프록시를 더욱 구체화하기 위해 여러 가지 다른 지역 및 지역 교정이 개발되었습니다.

Figure 3
그림 3. 이소프레노이달 및 분기 GDGT의 화학 적 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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References

  1. Schouten, S. et al. Distributional variations in marine crenarchaeotal membrane lipids: a new tool for reconstructing ancient sea water temperatures?, Earth and Planetary Science Letters204(1-2), 265-274 (2002).
  2. Weijers, J. W. H. et al. Environmental controls on bacterial tetraether membrane lipid distribution in soils, Geochimica et Cosmochimica Acta71(3), 703-713 (2007).
  3. Castaneda, I. S. et al. Millennial-scale sea surface temperature changes in the eastern Mediterranean (Nile River Delta region) over the last 27,000 years, Paleoceanography, 25, 13 (2010).
  4. Damste, J. S. S. et al. Crenarchaeol: the characteristic core glycerol dibiphytanyl glycerol tetraether membrane lipid of cosmopolitan pelagic crenarchaeota, J Lipid Res, 43(10), 1641-1651 (2002).
  5. Hopmans, E. C. et al. A novel proxy for terrestrial organic matter in sediments based on branched and isoprenoid tetraether lipids, Earth and Planetary Science Letters224(1-2), 107-116 (2004).
  6. Tierney, J. E., Russell J. M. Distributions of branched GDGTs in a tropical lake system: Implications for lacustrine application of the MBT/CBT paleoproxy, Organic Geochemistry40(9), 1032-1036 (2009).
  7. Damste, J. S. S. et al. 13,16-Dimethyl Octacosanedioic Acid (iso-Diabolic Acid), a Common Membrane-Spanning Lipid of Acidobacteria Subdivisions 1 and 3, Appl Environ Microb, 77(12), 4147-4154 (2011).

Transcript

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