Overview
Fonte: Laboratório de Jeff Salacup - Universidade de Massachusetts Amherst
Como mencionado em vídeos anteriores, o produto de uma extração de solvente orgânico, um extrato lipídeca total (TLE), é muitas vezes uma mistura complexa de centenas, se não milhares, de compostos diferentes. O pesquisador muitas vezes só está interessado em um punhado de compostos. No caso de nossos dois paleotermômetros orgânicos (Uk'37 e MBT/CBT), o interesse é em apenas 6 compostos (2 alkenones e 4 tetraethers de glicerol isorenoidal). Como discutido nos dois vídeos anteriores desta série, técnicas de purificação podem ser aplicadas a fim de reduzir o número de compostos em uma amostra analisada. Essas técnicas podem alterar quimicamente os componentes indesejados (saponificação), aproveitar as diferentes químicas compostas (cromatografia de coluna) ou usar as diferentes formas e tamanhos das moléculas para incluir ou excluir certos componentes da análise (adução da ureia). A estrutura atômica de diferentes produtos químicos leva alguns compostos orgânicos a formar cadeias longas, estreitas e retas (n-alkanes e alkenones), outros compostos orgânicos para formar estruturas cíclicas complexas, outros para formar estruturas altamente ramificadas, e outros que formam estruturas cíclicas e ramificadas (GDGTs)(Figura 1). As diferentes formas e tamanhos dos compostos em uma amostra podem ser usados para separá-los uns dos outros, da mesma forma que um classificador de moedas separa moedas de diferentes denominações (tamanhos).
Figura 1. Comparação de diferentes estruturas químicas. Decane, um alcano de cadeia reta (A; de http://www.bpc.edu/mathscience/chemistry), ciclohexano, um alkano cíclico (B; de http://www.bpc.edu/mathscience/chemistry), um esteroide, um hidrocarboneto policíclico (C; de www.wikiwand.com), e 2,2 dimetilbutano, um alkano ramificado (D; www.wikimedia.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Principles
A adução da ureia é uma técnica de exclusão de tamanho que separa estruturas de cadeias retas ou raramente ramificadas de estruturas altamente ramificadas e cíclicas. Isso acontece por causa da estrutura cristalina especial da ureia (Figura 2). Quando um cristal de ureia se forma, cria espaços minúsculos entre os cristais individuais. Os espaços são longos e estreitos com um diâmetro médio de cinco angstroms (5 x 10-10 m). Esses espaços são grandes o suficiente para incluir compostos de cadeia reta ou raramente ramificadores na rede de cristal, mas muito pequenos para estruturas altamente ramificadas ou cíclicas. Assim, as últimas estruturas são excluídas. Os cristais podem então ser lavados, e as estruturas altamente ramificadas ou cíclicas podem ser removidas da amostra. A dissolução subsequente do cristal libera os compostos de cadeia reta e raramente ramificados de volta à solução, a partir da qual eles podem ser extraídos e analisados.
Figura 2. Representação da estrutura química e cristalina da ureia. (de www.imgkid.com) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A adução da ureia é uma técnica que separa alkenonas de cadeia reta de compostos altamente ramificados e cíclicos.
Ureia é um composto orgânico que forma uma estrutura cristalina porosa. O cristal pode capturar certas moléculas, formando um aduto, enquanto outros não cabem dentro da estrutura.
A adução da ureia utiliza os diferentes tamanhos e formas dos compostos para separá-los – semelhante à forma como uma máquina de contagem de moedas classificará um frasco de troca solta.
Este vídeo faz parte de uma série sobre extração lipídica, purificação e análise de sedimentos. Ilustrará o uso da adução da ureia para realizar a purificação de tamanho em uma amostra para paleotermometria alkenone.
A adução da ureia é um método de purificação baseado na exclusão de tamanho. Ele separa compostos de cadeia reta ou raramente ramificados – como n-alkanes e alkenonas – daqueles que são altamente ramificados e/ou cíclicos.
Isso é possível por causa da estrutura cristalina especial da Ureia. Quando um cristal de ureia se forma, pequenos espaços são criados entre as moléculas individuais. Esses espaços são longos e estreitos - por isso compostos de cadeia reta ou raramente ramificados podem caber na rede de cristal, enquanto compostos altamente ramificados e cíclicos são muito grandes.
Os cristais de ureia são então lavados com um solvente apolar, separando as moléculas excluídas das lineares incluídas. As moléculas lavadas podem ser extraídas e analisadas diretamente, enquanto os cristais devem ser dissolvidos na água para liberar os compostos lineares de volta à solução primeiro. Outro solvente apolar é então usado para extrair os compostos desejados da água.
Tanto as moléculas incluídas quanto excluídas podem fornecer informações valiosas. Por exemplo, isoorenóides altamente ramificados, produzidos por diatomás de gelo marinho, podem ser um proxy para a existência de gelo marinho sazonal em altas latitudes. Compostos cíclicos podem refletir a presença de incêndios passados. Alcanos e alkenonas acorrentados diretos são proxies comuns para a estrutura ecossistêmica e a temperatura da superfície do mar.
A purificação fornecida pela adução da ureia nem sempre é necessária, pois alguns compostos de interesse podem ser analisados diretamente da amostra orgânica extraída não beterada. Em casos extremos - como em sedimentos adquiridos de áreas altamente poluídas, como estuários perto de centros industriais - uma adução de ureia pode ser necessária para remover compostos desconhecidos que coelute durante a análise.
Agora que você entende a adução da ureia, você está pronto para começar o procedimento.
Para começar, adquira um extrato lipídado total seco – ou TLE – que foi extraído da amostra e purificado com saponificação e cromatografia da coluna.
Em seguida, prepare as soluções de adução da ureia conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de que todos os componentes estão puros e livres de hidrocarbonetos.
Suspenda a amostra em 1,5 mL da solução DCM/hexano. Se o TLE não dissolver completamente, sonicar por 5 min. Adicione 1,5 mL da solução de ureia e metanol. Observe a formação de um precipitado branco, pois isso sinaliza a criação de cristais de ureia. Em seguida, seque suavemente os cristais de ureia sob nitrogênio, usando calor suave. Certifique-se de evaporar todo o solvente. Uma vez que os cristais estejam completamente secos, enxágue-os 3 vezes com aproximadamente 1 mL de hexano. Use uma pipeta de vidro para remover o hexano entre cada enxágue e transfira para um frasco fresco. Isso é rotulado como "não-aduto". Em seguida, dissolva os cristais em 2 mL de água pura. Agite para garantir a dissolução completa.
Para extrair os biomarcadores da água adicionada, adicione 1 mL de hexano, tampa e agite suavemente por 5 s.
Deixe a solução descansar até que o hexano e a água se separem completamente. Em seguida, usando uma pipeta de vidro, remova aproximadamente 75% do hexano e transfira-o para um novo frasco. Isso é rotulado de "aduto".
Repita este processo de extração duas vezes, adicionando 1 mL de hexano cada vez. Misture os três adutos em um frasco. Descarte a solução de água e ureia em um recipiente de resíduos apropriado. A amostra está pronta para análise.
A adução da ureia tem várias aplicações na separação e purificação de moléculas orgânicas.
Um isótopo é uma variante de um elemento químico que difere na quantidade de nêutrons, e assim difere em sua massa atômica. Um elemento pode ter vários isótopos, cada um tendo uma massa diferente. Isótopos também podem ter propriedades químicas e moleculares que diferem entre si, por isso pode ser importante determinar quais isótopos estão presentes em uma determinada amostra. Neste exemplo, as relações de isótopos de carbono e hidrogênio em ceras de folhas foram medidas a fim de coletar informações sobre as vias metabólicas de uma planta. Grandes quantidades de material são necessárias para determinar as proporções de isótopos, e compostos que têm detecções semelhantes em baixas concentrações podem se sobrepor quando grandes quantidades são analisadas.
Portanto, a adução da ureia foi usada para separar os n-alkanes de interesse de quaisquer compostos interferentes. A remoção desses materiais indesejados permitiu determinar uma relação precisa de isótopos.
O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos, cada um com propriedades e usos únicos. A separação desses compostos do petróleo é muito importante na indústria química - alkanes de cadeia ramificada são frequentemente usados como lubrificantes leves, enquanto alkanes de cadeia reta são usados principalmente em processos de alquilação. Neste exemplo, a adução da ureia foi usada para separar alkanes do querosene. Usando uma série sucessiva de aduções de ureia, essas alkanes foram separadas do querosene com uma pureza de 99%.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à purificação de complexas misturas orgânicas via adução de ureia. Agora você deve entender a exclusão de tamanho, a importância de purificar amostras para medição precisa de componentes e adução da ureia.
Obrigado por assistir!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. Instalação e Preparação de Materiais
- Obtenha um extrato lipídeco total (TLE) usando um método de extração de solvente (Sonication, Soxhlet ou Accelerated Solvent Extraction (ASE).
- Comprar os seguintes materiais de qualquer revendedor químico: pipetas e lâmpadas de vidro borossilicato queimados; água pura; hexana; diclorometano (DCM); metanol; ureia.
- Os reagentes devem ser puros e livres de hidrocarbonetos. Alternativamente, a água pura pode ser feita em um laboratório usando um sistema de purificação de água.
- Obtenha frascos de vidro borossilicato de 4 mL com tampas forradas com PTFE.
2. Métodos
- Faça uma mistura de 2:1 DCM:Hexane (v:v).
- Em um frasco de Erlenmeyer, misture 200 mL de DCM e 100 mL de hexano.
- Faça uma mistura de ureia em metanol (100 mg/mL).
- Despeje 300 mL de metanol em um frasco de Erlenmeyer.
- Adicione 300 mg de ureia.
- Mexa em uma placa de mexida automática até que a ureia esteja completamente dissolvida.
- Comece com a amostra seca em um frasco de 4 mL.
- Suspenda a amostra em 1,5 mL de uma mistura de 2:1 de DCM:Hexane (v:v).
- Se a amostra não dissolver completamente, sonicar por 5 minutos.
- Nessa mistura, adicione 1,5 mL de ureia no metanol.
- Após esta adição, observe para um precipitado branco para formar. Isso sinaliza a criação de cristais de ureia.
- Seque suavemente os cristais sob nitrogênio, usando calor suave. Certifique-se de que todo solvente tenha evaporado antes de prosseguir para o próximo passo.
- Enxágüe os cristais 3x com aproximadamente 1 mL de hexano. Remova o hexano entre cada enxágue usando uma pipeta de vidro para transferi-lo para um frasco rotulado como "não-aduto".
- Dissolva os cristais em 2 mL de água pura. Agite para garantir a dissolução completa.
- Extrair a fase aquosa com hexano adicionando 1 mL e tremendo suavemente por 5 s.
- Deixe o hexano e a água se separarem completamente antes de remover aproximadamente 75% do hexano usando uma pipeta de vidro e transferi-la para um frasco rotulado de "aduto".
- Repita o passo 2.10 duas vezes.
- Descarte a solução de água e ureia em um recipiente de resíduos apropriado.
A adução da ureia é uma técnica que separa alkenonas de cadeia reta de compostos altamente ramificados e cíclicos.
Ureia é um composto orgânico que forma uma estrutura cristalina porosa. O cristal pode capturar certas moléculas, formando um aduto, enquanto outros não cabem dentro da estrutura.
A adução da ureia utiliza os diferentes tamanhos e formas dos compostos para separá-los – semelhante à forma como uma máquina de contagem de moedas classificará um frasco de troca solta.
Este vídeo faz parte de uma série sobre extração lipídica, purificação e análise de sedimentos. Ilustrará o uso da adução da ureia para realizar a purificação de tamanho em uma amostra para paleotermometria alkenone.
A adução da ureia é um método de purificação baseado na exclusão de tamanho. Ele separa compostos de cadeia reta ou raramente ramificados – como n-alkanes e alkenonas – daqueles que são altamente ramificados e/ou cíclicos.
Isso é possível por causa da estrutura cristalina especial da Ureia. Quando um cristal de ureia se forma, pequenos espaços são criados entre as moléculas individuais. Esses espaços são longos e estreitos - por isso compostos de cadeia reta ou raramente ramificados podem caber na rede de cristal, enquanto compostos altamente ramificados e cíclicos são muito grandes.
Os cristais de ureia são então lavados com um solvente apolar, separando as moléculas excluídas das lineares incluídas. As moléculas lavadas podem ser extraídas e analisadas diretamente, enquanto os cristais devem ser dissolvidos na água para liberar os compostos lineares de volta à solução primeiro. Outro solvente apolar é então usado para extrair os compostos desejados da água.
Tanto as moléculas incluídas quanto excluídas podem fornecer informações valiosas. Por exemplo, isoorenóides altamente ramificados, produzidos por diatomás de gelo marinho, podem ser um proxy para a existência de gelo marinho sazonal em altas latitudes. Compostos cíclicos podem refletir a presença de incêndios passados. Alcanos e alkenonas acorrentados diretos são proxies comuns para a estrutura ecossistêmica e a temperatura da superfície do mar.
A purificação fornecida pela adução da ureia nem sempre é necessária, pois alguns compostos de interesse podem ser analisados diretamente da amostra orgânica extraída não beterada. Em casos extremos - como em sedimentos adquiridos de áreas altamente poluídas, como estuários perto de centros industriais - uma adução de ureia pode ser necessária para remover compostos desconhecidos que coelute durante a análise.
Agora que você entende a adução da ureia, você está pronto para começar o procedimento.
Para começar, adquira um extrato lipídado total seco – ou TLE – que foi extraído da amostra e purificado com saponificação e cromatografia da coluna.
Em seguida, prepare as soluções de adução da ureia conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de que todos os componentes estão puros e livres de hidrocarbonetos.
Suspenda a amostra em 1,5 mL da solução DCM/hexano. Se o TLE não dissolver completamente, sonicar por 5 min. Adicione 1,5 mL da solução de ureia e metanol. Observe a formação de um precipitado branco, pois isso sinaliza a criação de cristais de ureia. Em seguida, seque suavemente os cristais de ureia sob nitrogênio, usando calor suave. Certifique-se de evaporar todo o solvente. Uma vez que os cristais estejam completamente secos, enxágue-os 3 vezes com aproximadamente 1 mL de hexano. Use uma pipeta de vidro para remover o hexano entre cada enxágue e transfira para um frasco fresco. Isso é rotulado como "não-aduto". Em seguida, dissolva os cristais em 2 mL de água pura. Agite para garantir a dissolução completa.
Para extrair os biomarcadores da água adicionada, adicione 1 mL de hexano, tampa e agite suavemente por 5 s.
Deixe a solução descansar até que o hexano e a água se separem completamente. Em seguida, usando uma pipeta de vidro, remova aproximadamente 75% do hexano e transfira-o para um novo frasco. Isso é rotulado de "aduto".
Repita este processo de extração duas vezes, adicionando 1 mL de hexano cada vez. Misture os três adutos em um frasco. Descarte a solução de água e ureia em um recipiente de resíduos apropriado. A amostra está pronta para análise.
A adução da ureia tem várias aplicações na separação e purificação de moléculas orgânicas.
Um isótopo é uma variante de um elemento químico que difere na quantidade de nêutrons, e assim difere em sua massa atômica. Um elemento pode ter vários isótopos, cada um tendo uma massa diferente. Isótopos também podem ter propriedades químicas e moleculares que diferem entre si, por isso pode ser importante determinar quais isótopos estão presentes em uma determinada amostra. Neste exemplo, as relações de isótopos de carbono e hidrogênio em ceras de folhas foram medidas a fim de coletar informações sobre as vias metabólicas de uma planta. Grandes quantidades de material são necessárias para determinar as proporções de isótopos, e compostos que têm detecções semelhantes em baixas concentrações podem se sobrepor quando grandes quantidades são analisadas.
Portanto, a adução da ureia foi usada para separar os n-alkanes de interesse de quaisquer compostos interferentes. A remoção desses materiais indesejados permitiu determinar uma relação precisa de isótopos.
O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos, cada um com propriedades e usos únicos. A separação desses compostos do petróleo é muito importante na indústria química - alkanes de cadeia ramificada são frequentemente usados como lubrificantes leves, enquanto alkanes de cadeia reta são usados principalmente em processos de alquilação. Neste exemplo, a adução da ureia foi usada para separar alkanes do querosene. Usando uma série sucessiva de aduções de ureia, essas alkanes foram separadas do querosene com uma pureza de 99%.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à purificação de complexas misturas orgânicas via adução de ureia. Agora você deve entender a exclusão de tamanho, a importância de purificar amostras para medição precisa de componentes e adução da ureia.
Obrigado por assistir!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
Esta técnica de purificação produz dois frascos diferentes; um aduto rotulado, contendo compostos de cadeia reta e raramente ramificações, e outro não aduto rotulado, contendo compostos altamente ramificados e cíclicos. Este procedimento diminuiu consideravelmente a complexidade de qualquer amostra a ser analisada em um instrumento. Essa diminuição da complexidade é muitas vezes crucial para a análise precisa dos compostos-alvo. Por exemplo, em ambientes próximos à costa após aproximadamente 1850, alkenones co-elute com compostos problemáticos, ostensivamente poluentes introduzidos após a Revolução Industrial, que não são removidos usando cromatografia de coluna ou saponificação sozinho. Aparentemente, os poluentes são cíclicos ou ramificados porque a adução da ureia os remove da amostra. Os 160 anos mais altos de alguns desses arquivos de sedimentos podem ser analisados com confiança para Uk'37 apenas por causa da aplicação da adução da ureia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
A adução da ureia é frequentemente usada na purificação de n-alkanes, constituintes comuns da cera de folha, a fim de remover compostos de co-eluição antes da análise de isótopos. As proporções de isótopos de carbono e hidrogênio de ceras de folhas nas plantas contêm informações sobre as vias metabólicas e as condições ambientais em que a planta utilizou e viveu, respectivamente. Para determinar as relações de isótopos, grandes quantidades de composto devem ser carregadas em um GC. Tais grandes quantidades muitas vezes causam compostos que eluto perto um do outro em concentrações mais baixas para co-elute. Muitas vezes, os compostos que co-eluem com alcanos são moieties ramificados ou cíclicos desse alkano e, portanto, podem ser removidos usando a adução da ureia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
