Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Analytical Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Cromatografia gasosa (GC) com Detecção de Ionização de Chamas
 
Click here for the English version

Cromatografia gasosa (GC) com Detecção de Ionização de Chamas

Overview

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia

A cromatografia gasosa (GC) é usada para separar e detectar pequenos compostos de peso molecular na fase gasosa. A amostra é um gás ou um líquido que é vaporizado na porta de injeção. Normalmente, os compostos analisados são inferiores a 1.000 Da, porque é difícil vaporizar compostos maiores. O GC é popular para monitoramento ambiental e aplicações industriais porque é muito confiável e pode ser executado quase continuamente. O GC é tipicamente usado em aplicações onde moléculas pequenas e voláteis são detectadas e com soluções não aquosas. A cromatografia líquida é mais popular para medições em amostras aquosas e pode ser usada para estudar moléculas maiores, porque as moléculas não precisam vaporizar. GC é favorecido para moléculas não polares, enquanto LC é mais comum para separar analitos polares.

A fase móvel para cromatografia a gás é um gás portador, tipicamente hélio devido ao seu baixo peso molecular e sendo quimicamente inerte. A pressão é aplicada e a fase móvel move o analito através da coluna. A separação é realizada usando uma coluna revestida com uma fase estacionária. Colunas capilares tubulares abertas são as colunas mais populares e têm a fase estacionária revestida nas paredes do capilar. Fases estacionárias são frequentemente derivados de polidimtilsiloxano, com 5-10% dos grupos funcionalizados para ajustar a separação. Grupos funcionais típicos são grupos fenil, cianopropil ou trifluoropropil. As colunas capilares geralmente têm de 5 a 50 m de comprimento. Colunas mais estreitas têm maior resolução, mas requerem pressões mais altas. Colunas embaladas também podem ser usadas onde a fase estacionária é revestida em contas embaladas na coluna. As colunas embaladas são mais curtas, de 1 a 5 m. Capilares tubulares abertos são geralmente preferidos porque permitem maior eficiência, análises mais rápidas e têm capacidades mais altas.

A detecção de ionização de chamas (FID) é um bom detector geral para compostos orgânicos em GC que detecta a quantidade de carbono em uma amostra. Após a coluna, amostras são queimadas em uma chama quente de ar hidrogênio. Íons de carbono são produzidos pela combustão. Embora a eficiência geral do processo seja baixa (apenas 1 em cada10 íons de carbono produzem um íon na chama), a quantidade total de íons é diretamente proporcional à quantidade de carbono na amostra. Eletrodos são usados para medir a corrente dos íons. FID é um detector destrutivo, já que toda a amostra é pirolisada. O FID não é afetado por gases e água não combustíveis.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O equilíbrio para cromatografia gasosa é particionamento, e os componentes da amostra serão particionados (ou seja, distribuir) entre as duas fases: a fase estacionária e a fase móvel. Compostos que têm maior afinidade com a fase estacionária passam mais tempo na coluna e, portanto, elute mais tarde e têm um tempo de retenção mais longo (tR) do que amostras que têm maior afinidade com a fase móvel. A afinidade com a fase estacionária é impulsionada principalmente por interações intermoleculares e a polaridade da fase estacionária pode ser escolhida para maximizar as interações e, assim, a separação. Os picos ideais são distribuições gaussianas e simétricas, devido à natureza aleatória das interações analitos com a coluna. Características de pico assimétricas, como frente de pico ou rejeito, podem ser devido à sobrecarga da coluna, problemas de injeção ou à presença de grupos funcionais adsortivos, como ácidos carboxílicos.

Em GC, a temperatura é ajustada para alterar o equilíbrio e, portanto, os tempos de eluição. As separações em GC baseiam-se na volatilidade porque substâncias de ponto de ebulição mais altas podem se condensar em uma coluna se a temperatura estiver baixa, portanto não são eludidas ou demoram muito para eluto. Separações isotermais são realizadas a uma temperatura ou separações gradientes são realizadas onde a temperatura é aumentada durante a separação. As rampas de temperatura permitem que os compostos de ponto de ebulição baixo e alto sejam separados na mesma separação.

A leitura produzida por GC é um cromatógrafo que dá o sinal ao longo do tempo. Picos são observados para cada composto na amostra. Para cada pico, uma altura máxima e uma área de pico podem ser calculadas. A área de pico é geralmente usada para fazer curvas de calibração e calcular concentrações de amostras em desconhecidos. O número de placas teóricas (N) é calculado a partir de cada pico para dar uma medida de eficiência da coluna. Uma equação prática para medir N é N=16(tR/W)2 onde tR é o tempo de retenção do analito e W é a largura da parte inferior do pico. N é usado para comparar separações em diferentes colunas.

O detector de ionização de chamas é sensível à massa. Assim, a quantidade de sinal é proporcional à massa de carbono na amostra, não ao número de mols. Compostos com mais carbono dão sinais maiores. A queima de carbono produz íons que são detectados como uma corrente. O FID é um dos detectores gerais mais sensíveis para GC com um limite de detecção na faixa de picograma. A resposta é linear sobre sete ordens de magnitude, dando-lhe uma grande faixa linear.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Inicialização do GC

  1. Ligue o gás e o ar do portador de hélio e ajuste os medidores de pressão no instrumento.
  2. Ligue o forno da coluna a uma alta temperatura (tipicamente 250 °C ou superior) para assar na coluna. Não exceda a temperatura máxima da coluna. Isso removerá quaisquer contaminantes. Deixe assar por pelo menos 30 minutos antes de executar uma amostra.

2. Fazer um arquivo de métodos

  1. No software que controla o instrumento, insira todos os valores desejados para um arquivo de métodos. Primeiro, defina as configurações do autosampler. Defina o número de enxágües pré-executados, enxágües pós-escoamentos e enxágues com amostra. Estas enxágües limpam a coluna entre diferentes amostras.
  2. A quantidade injetada é tipicamente de 1 μL. Uma proporção dividida é geralmente definida porque injetar toda uma amostra pode sobrecarregar a coluna. Se a razão de divisão for de 100:1, isso significa que para cada 1 parte que é injetada no instrumento 100 peças vão para o lixo.
  3. Insira os parâmetros de fase móvel. A vazão é controlada pelo conjunto de pressão. Taxas de fluxo mais rápidas levam a separações mais rápidas, mas há menos tempo para o analito interagir com a coluna.
  4. Digite a programação de temperatura. Para uma corrida isotemal, entre na temperatura da separação e, em seguida, um tempo para a separação. Para uma eluição gradiente, digite a temperatura inicial e o tempo de espera, a temperatura final e o tempo de espera, e a velocidade da rampa em °C/min. Também é definido um tempo de equilíbrio que permite que a coluna esfrie a temperatura original entre as corridas.
  5. Digite os parâmetros do detector. Uma temperatura do detector e uma taxa de amostragem serão inseridas. O detector deve ser sempre uma temperatura mais alta do que a da coluna para que nenhum analito condensa no detector.
  6. Salve o arquivo de métodos. Os parâmetros também podem precisar ser baixados para que sejam lidos pelo GC.

3. Coleta de Dados GC

  1. Ligue o gás hidrogênio e certifique-se de que o medidor de pressão esteja configurado corretamente. Acenda a chama do FID.
  2. No rack de autosampler, encha o frasco de lavagem com solvente de lavagem, como acetonitrilo ou metanol. Certifique-se de que o frasco de lixo está vazio.
  3. Prepare a amostra. Se houver alguma chance de partículas na amostra, filtre a amostra. Como os resíduos plásticos às vezes podem ser vistos com GC, use apenas seringas de vidro e frascos de vidro para preparar sua amostra.
  4. Encha o frasco pelo menos no meio do caminho com a amostra para que a seringa autosampler seja garantida para pegar a amostra. Os frascos de feixe automático são tipicamente de 2 mL, mas se o volume da amostra for limitado, as pastilhas de frasco estão disponíveis para reduzir o volume amostral necessário.
  5. Coloque o frasco de amostra no rack do autosampler. Acompanhe em que posição cada amostra está.
  6. Antes da execução, zero a linha de base do gravador de gráficos no software do computador.
  7. Os arquivos podem ser coletados como uma única execução ou usando uma tabela de lote para várias execuções. Certifique-se de especificar o número correto do frasco para a amostra. Aperte o botão "iniciar" e faça um arquivo.
  8. Os dados são normalmente analisados com um programa de software. Os parâmetros que podem ser medidos incluem tempo de retenção, altura máxima, área de pico e número de placas teóricas.

4. Resultados: Análise gc de amostras de café

  1. Neste exemplo, foi realizada a análise gc-FID para cafeína e ácido palmítico, dois compostos encontrados no café. A cafeína é menos polar que o ácido palmítico, que tem uma cauda de alkano de cadeia longa. Assim, a cafeína é menos retida e elutes primeiro na coluna nãopolar de 95% dimetilpolisiloxano e 5% fenil-arylene(Figura 1).
  2. A partir do cromatógrafo, as áreas de pico podem ser calculadas. As áreas de pico são proporcionais à massa de carbono que passa pelo detector e podem ser usadas para fazer uma curva de calibração de resposta de instrumento versus concentração. Para a Figura 1, a área de pico é de 27.315 para cafeína e 18.852 para ácido palmítico.
  3. Uma medida de eficiência da coluna é N, o número de placas teóricas. N pode ser calculado a partir do cromatógrafo para cada pico. Para a Figura 1, N é 283.000 para cafeína e 261.000 para ácido palmítico.
  4. A Figura 2 mostra o efeito da temperatura nas separações isotemais. Duas separações são sobrepostas da mesma amostra de cafeína e ácido palmítico. O primeiro é de 180 °C e o segundo a 200 °C. Os tempos de retenção são muito menores para a corrida de temperatura mais alta.

Figure 1
Figura 1. Análise GC-FID de amostras de cafeína e ácido palmítico. O elute padrão de cafeína de 5 mM primeiro, seguido pela amostra de ácido palmítico de 1 mM. A rampa de temperatura foi de 0,1 min a 150 °C seguida de uma rampa de 10 °C/min a 220 °C onde a temperatura foi mantida por 5 min.

Figure 2

Figura 2. Análise GC-FID de corridas isotérmicas de uma amostra de café assado escuro. Uma comparação de GC-FID é de 180 °C e 200 °C para uma amostra de café assado escuro. Os picos elute muito mais rápido com a temperatura de 200 °C.

Cromatografia gasosa, ou GC, é uma técnica que é usada para separar, detectar e quantificar pequenos compostos voláteis na fase gasosa.

Em GC, amostras líquidas são vaporizadas, depois transportadas por um gás inerte através de uma coluna longa e fina. Os analitos são separados com base em sua afinidade química com um revestimento no interior da coluna.

Como a GC exige que os analitos sejam vaporizados para a fase do gás, o instrumento é ideal para produtos químicos voláteis e não polares com menos de 1.000 daltons em massa. Para moléculas maiores, aquosas ou polares que são difíceis de vaporizar, a cromatografia líquida é uma alternativa útil. Este vídeo introduzirá o básico da cromatografia gasosa, e ilustrará os passos necessários para analisar as espécies químicas em uma amostra de mistura não aquosa usando um cromatógrafo gasoso.

O instrumento GC possui cinco componentes essenciais. Primeiro, uma porta de injeção é usada para introduzir a amostra no instrumento. Em seguida, uma câmara de aquecimento vaporiza a amostra e mistura-a com um gás inerte. O gás inerte, como hélio ou nitrogênio, carrega a amostra vaporizada através do sistema. Combinados, o gás transportador e a amostra compõem a fase móvel. Em seguida, a fase móvel entra na coluna aquecida, separando os analitos à medida que fluem. Por fim, um detector registra os gases quando saem da coluna, ou elute, e envia dados para um computador para análise. O componente mais crítico do instrumento é a coluna. A coluna é um capilar com uma matriz de fase estacionária que reveste as paredes internas. Alternativamente, as colunas podem ser embaladas com contas revestidas de matriz. A fase estacionária é geralmente modificada polidimtilsiloxano, que é ideal para resolver moléculas nãopolares. Suas propriedades de separação são refinadas adicionando grupos de fenil de 5 a 10% fenil, cianopropil ou trifluoropropil.

Analitos com baixa afinidade química para a fase estacionária movem-se rapidamente através da coluna, enquanto moléculas com alta afinidade são à medida que adsorb para as paredes da coluna. O tempo que um composto passa dentro da coluna é chamado de tempo de retenção, ou Rt,e permite que os compostos sejam identificados. O detector fica no final da coluna e registra gases enquanto eles eluto. A detecção de ionização de chamas, ou FID, é amplamente utilizada porque detecta íons de carbono, permitindo detectar praticamente qualquer composto orgânico. Em FID, analitos combustão em uma chama de hidrogênio-ar quando saem da coluna, produzindo íons de carbono que induzem uma corrente em eletrodos próximos. A corrente é diretamente proporcional à massa de carbono, assim, a concentração do composto pode ser determinada. O resultado final é um cromatógrama, que é um gráfico de sinal FID vs tempo, mostrando cada componente elucido à medida que saem da coluna. Idealmente, cada pico terá uma forma simétrica, gaussiana. Características assimétricas, como o pico de rejeito e o pico de frente, podem ser devido à sobrecarga, problemas de injeção ou à presença de grupos funcionais que grudam na coluna, como ácidos carboxílicos.

Agora que os princípios da cromatografia gasosa foram discutidos, vamos dar uma olhada em como realizar e analisar uma análise de cromatografia gasosa em laboratório.

Antes de fazer um experimento, ligue o tanque de gás hélio. Abra o software no computador e asse a coluna para remover possíveis contaminantes. Coloque o forno a uma temperatura elevada, tipicamente 250 °C ou mais, e asse a coluna por pelo menos 30 min.

Em seguida, ajuste as configurações do autosampler. Defina o número de enxágües pré e pós-escoamento para limpar a coluna entre as amostras.

Use um volume amostral de 1 μL e defina a configuração da razão de divisão para programar o instrumento para aceitar apenas uma fração da entrada. Ajuste a taxa de fluxo do gás transportador e use configurações estabelecidas ou tentativa e erro para encontrar a pressão ideal.

Agora insira as configurações de temperatura para o experimento. Para uma corrida isotemal, entre na temperatura e na hora da separação. Alternativamente, para um gradiente de temperatura, entre na temperatura inicial e no tempo de espera, a temperatura final e o tempo de espera, e a velocidade da rampa em °C por minuto.

Defina a hora para que a coluna esfrie entre as corridas para uma corrida gradiente ou isotérmica.

Por fim, defina a taxa de amostragem e a temperatura do detector. O detector deve ser sempre mais quente que a coluna para evitar a condensação. Depois de todas as configurações programadas, salve o arquivo de métodos.

Ative o detector abrindo a válvula do tanque de hidrogênio e aclativa a chama do FID. O instrumento está pronto para análise de amostras.

Para executar a amostra no GC, primeiro encha um frasco com um solvente de lavagem, como acetonitrilo ou metanol. Prepare a amostra, sendo certo usar seringas de vidro e frascos de vidro, pois resíduos plásticos podem contaminar o GC.

Agora adicione a amostra preparada a um frasco com uma pipeta. Encha pelo menos a meio caminho, para que a seringa autosampler fique totalmente submersa. Em seguida, carregue a lavagem e prove frascos no rack do autosampler. Antes de executar a amostra, zero a linha de base do cromatógrafo no software do computador. Os dados podem ser coletados como uma única execução ou usando uma tabela de lote para várias corridas. Pressione "start" para executar a amostra.

Neste exemplo, os níveis de cafeína e ácido palmítico no café foram analisados utilizando-se GC com FID. A cafeína é menor e menos polar, por isso é menos atraída pela coluna, e elutes primeiro. O ácido palmítico, que tem uma longa cauda de corrente de alkano, elutes mais tarde devido a uma maior afinidade com a fase estacionária.

Como as dimensões máximas são proporcionais à massa de carbono, a concentração de cada componente pode ser determinada a partir de sua respectiva área de pico no cromatógrafo e comparada aos padrões de concentração conhecida.

O efeito da temperatura da coluna também foi explorado. A 200 °C, as amostras passaram pela coluna duas vezes mais rápido que a amostra executada a 180 °C. Observe que, enquanto as alturas máximas mudam, a área sob a curva permanece constante.

O GC é uma técnica importante para análise química, e é amplamente utilizado em aplicações científicas, comerciais e industriais.

Devido à simplicidade da GC, os químicos usam-na rotineiramente para monitorar reações químicas e pureza do produto. As reações podem ser amostradas ao longo do tempo para mostrar a formação do produto e o esgotamento reacionário. O cromatógrafo revela concentrações de produtos e também a presença de produtos não intencionais ou laterais.

O GC é comumente usado em conjunto com espectrometria de massa, chamada GS-MS, para identificar inequivocamente produtos químicos em amostras ou ar. A espectrometria de massa, ou MS, separa moléculas baseadas em sua relação massa para carga, e permite a determinação de identidades compostas. O GC-MS é uma ferramenta poderosa, pois o GC primeiro separa misturas complexas em componentes individuais, e a MS fornece informações precisas de massa e identidade química.

O GC é usado rotineiramente no monitoramento do ar para detectar compostos orgânicos voláteis, ou VOCs, que podem surgir de poluição ambiental, pesticidas e explosivos. O GC pode ser usado para rastrear e identificar VOCs tanto dentro de casa para análise do headspace quanto ao ar livre, para saúde, segurança e segurança.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à cromatografia gasosa com FID. Agora você deve entender os princípios básicos da cromatografia gasosa e da detecção de FID.

Obrigado por assistir!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

GC é usado para uma variedade de aplicações industriais. Por exemplo, é usado para testar a pureza de um produto químico sintetizado. O GC também é popular em aplicações ambientais. GC é usado para detectar pesticidas, hidrocarbonetos poliaromáticos e ftalatos. A maioria das aplicações de qualidade do ar usa GC-FID para monitorar poluentes ambientais. GC também é usado para análise de headspace, onde os voláteis que são evaporados de um líquido são coletados e medidos. Isso é útil para as indústrias de cosméticos e alimentos e bebidas. GC também é usado para aplicações forenses, como detectar drogas de abuso ou explosivos. Além disso, a GC é útil na indústria petrolífera para medir hidrocarbonetos. As extensas aplicações fazem do GC um bilhão de dólares por ano no mercado mundial.

A Figura 3 mostra um exemplo de como a GC poderia ser usada na indústria alimentícia. A Figura 3 mostra um cromatógrafo de baunilha artificial (preta) e baunilha real (vermelho). GC pode ser usado para identificar a amostra real, que contém um grande pico de vanillina, mas não contém um segundo pico para etilvanillina.

Figure 3

Figura 3. Cromatograma GC-FID de amostras de baunilha. Tanto a imitação quanto a baunilha real mostram grandes picos em 4,7 min devido à baunilha, o principal componente da baunilha. No entanto, a baunilha de imitação também tem um grande pico de 5,3 min, o que é devido à etilvanillina, um composto não presente em grandes quantidades em baunilha real.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter