Overview
출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
데모 저자: 루이사 이크너
토양 내의 미생물 지역 사회에 대한 전통적인 분석 방법은 일반적으로 선택적 및 차동 매체 또는 직접 카운트 분석에 희석 및 도금 방법론을 활용하는 문화적 분석과 관련이 있습니다. 직접 카운트는 존재하는 박테리아의 총 수에 대한 정보를 제공하지만, 지역 사회 내에 존재하는 인구의 수 또는 다양성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 판 수는 총 문화 또는 선택 된 문화 인구의 열거를 허용하고, 따라서 존재하는 다른 인구에 대한 정보를 제공합니다. 그러나 토양 박테리아의 1% 미만이 쉽게 배율로 나오기 때문에 문화 정보는 그림의 한 조각만 제공합니다. 문화가 될 수 있는 공동체의 실제 분수는 문화적 수에 따라 선택된 매체에 따라 달라집니다. 단일 매체는 특정 매체에 가장 적합한 채우기를 선택합니다.
최근 몇 년 동안, 토양 샘플에서 추출 된 지역 사회 DNA를 연구의 장점이 명백해지고있다. 이 비문화 기반 접근 방식은 문화 기반 접근 방식보다 존재하는 실제 커뮤니티를 보다 더 대표하는 것으로 생각됩니다. 존재하는 인구의 모형에 관하여 정보를 제공하는 것 이외에, 이 접근은 또한 그들의 유전 잠재력에 관하여 정보를 제공할 수 있습니다. 다른 기술과 마찬가지로 DNA 추출로 얻을 수 있는 데이터에는 한계가 있습니다. 따라서 많은 연구자들은 현재 직접 및 문화적 수와 함께 DNA 추출을 사용하여 환경 샘플에서 얻은 데이터를 최대화합니다.
Principles
토양에서 DNA 추출은 두 가지 방법 중 하나로 수행될 수있다(표 1). 시투 방법에서 화학적 기반 및 기계적 기술의 조합이 사용된다. 이 추출을 위해 토양 덩어리가 추출 버퍼의 동등한 부피와 결합됩니다. 유리 구슬은 세제(나트륨 도데킬 황산염 또는 SDS)의 부피와 함께 현탁액에 첨가되고, 시료는 토양 입자로부터 분리를 용이하게 하기 위해 혼합되어 세포 용해를 촉진한다. 원심분리 후, 상피품은 DNA 생성물을 정화하기 위해 추가 추출 및 인큐베이션 단계를 받게 된다.
또는, 세포는 유전 물질을 추출하기 전에 토양 매트릭스로부터 먼저 분획(또는 분리)될 수 있다. 토양 샘플의 질량은 혼합 및 느린 원심 분리의 연속 주기를 겪습니다. 그러나, 펠릿을 얻기 위해 원심분리되는 그대로 세포를 유지하기 위해 비드-박동 단계는 여기에서 제거된다. lysozyme 기지를 둔 추출은 세포벽을 중단하고 정화를 위한 DNA를 해방하기 위하여 잠복과 함께 행해집니다.
이 원고와 비디오는 토양에서 DNA 추출의 사투 방법을 시연할 것이며, 이 절차는 세포 분획 방법에 비해 토양 샘플에서 DNA의 더 큰 농도를 산출하는 것으로 입증되었다.
| 출판하다 | 세균 분별 | 시투에서 세포 |
| DNA수량 | 1-5 μg/g | 1-20 μg/g |
| 지역사회 대표 | 세포 소취 때문에 덜 대표적 | 더 대표적인, 영향을 받지 않는 세포 소취 |
| DNA의 근원은 복구되었습니다 | 박테리아만 | 대부분 박테리아뿐만 아니라 곰팡이와 생장 동물 |
| DNA 전단의 정도 | 덜 전단 | 더 많은 전단 |
| DNA 단편의 평균 크기 | 50 kb | 25 kb |
| 혹은 오염의 정도 | 오염이 적다 | 더 오염된 |
| 방법론의 용이성 | 낮고 힘들다 | 더 빠르고 노동 집약적인 |
표 1. 토양에서 DNA의 회복을 위한 세균 분획 및 시상 용해 방법론의 비교.
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Procedure
1. 세균 성 지역 사회 DNA 추출
- 절차를 시작하려면 체질 토양 100 g의 무게를 측정합니다. 폴리 프로필렌 용기에 이것을 추가하고, 토양 매트릭스에서 박테리아의 방출을 촉진하기 위해 EDTA로 개정 된 트리스 버퍼로 구성된 추출 버퍼 100 mL을 추가 한 다음 손으로 흔들어.
- 다음으로, 유리 구슬 의 100 g의 무게, 믹싱 용기에 추가합니다. 15분 동안 비드 구타 장치 또는 기계식 손목 동작 셰이커를 사용하여 샘플을 5분 동안 양수합니다. 10mL 20% 나트륨 도데딜 황산염 또는 SDS를 혼합물에 넣고 1분 동안 교반합니다. 60 -65°C의 고온에서 60분 동안 배양한다.
- 별도의 50mL 튜브, 원심분리기 는 6,000 x g에서 10분 동안 샘플을 동등하게 분배합니다. 상체를 튜브에서 단일 멸균 용기로 옮기습니다. 다음으로, 추출 버퍼의 신선한 부피를 사용하여, 이전에 설명한 바와 같이 토양 펠릿에 추출을 반복한다.
- 다음으로, 가공된 상체의 총 부피, 약 200mL, 깨끗한 50mL 튜브에 30% 폴리에틸렌 글리콜 과 1.6M 염화나트륨의 용액으로 반부적으로 채워진 깨끗한 50mL 튜브를 첨가한다. 병을 손으로 여러 번 반전시켜 혼합하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 원심분리기 샘플은 DNA를 펠릿하는 데 20분 동안 10,000 x g로 샘플링합니다.
- 원심분리기 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거하고 부분적으로 정제된 핵산 펠릿을 남깁니다. 20mL의 TE 버퍼와 7.5M 칼륨 아세테이트 용액의 1.5mL를 추가하여 펠릿을 다시 한 번 재보펜합니다. 서스펜션을 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 단백질과 다당류를 침전시키기 위해 4°C에서 30분 동안 16,000 x g의 원심분리기.
- 다음으로, 샘플에 RNAAe와 단백질Ae K를 추가하고 손으로 부드럽게 섞어 잠시 앉습니다. 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1의 비율 혼합물)을 추출할 현탁액에 첨가하고 손으로 부드럽게 섞는다. 원심 분리기 는 13,000 x g에서 10 분 동안 준비합니다. 원심분리기에서 용기를 조심스럽게 제거하고 두 층을 주목한다.
- 바닥, 무거운 층은 페놀: 클로로폼:이소아밀 알코올 및 추출된 파편으로 구성되며, 상부 층은 수성이며 DNA를 함유하고 있다. 수성 상을 멸균 용기에 넣고 동등한 부피를 추가하고 DNA 강수량을 시작하기 위해 부드럽게 반전하십시오. 실온에서 서스펜션을 2시간 동안 배양합니다. 30 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리에 의해 정제 된 DNA를 펠렛. 펠릿 DNA가 혈관의 바닥에 보이지 않을 수도 있고 보이지 않을 수 있기 때문에 상체를 조심스럽게 제거한 다음 TE 버퍼의 1mL에서 다시 중단한다.
- 분광계 또는 DNA/RNA 정량화 형광형계를 사용하여 샘플에서 추출한 DNA 수준을 측정합니다. DNA의 양은 260 nm 판독에서 추정됩니다. 1.0의 흡광도 판독은 mL 당 DNA의 50 μg에 해당합니다. 농도가 너무 높으면 정확한 판독값을 위해 서스펜션 1에서 10 또는 분자 등급 물을 사용하여 1 에서 100으로 희석하십시오.
- DNA의 순도는 280 nm에서 280 nm에 260 nm에서 판독값의 비율에서 추정됩니다. 값이 1.7 > 비교적 순수한 DNA를 나타냅니다. 최대 이론값은 2.0입니다.
세균성 지역 사회 DNA 추출은 DNA가 단일 추출 절차 도중 지역 사회 내의 다중 세균성 종에서 얻어지는 프로세스입니다.
토양에 있는 미생물 지역 사회의 전통적인 분석은 일반적으로 다른 선택적인 매체에 희석 및 도금 방법론을 활용하여, 문화적 인 분석을 관련시켰습니다. 그러나, 많은 박테리아 실험실 조건 또는 선택 된 특정 성장 미디어 조건에 가난 하 게 성장, 그들은 놓치거나 심각 하 게 과소 대표 될 수 있습니다 의미.
최근, 토양 세균 성 샘플에서 지역 사회 DNA를 추출 하는 세균 성 지역 사회의 보다 포괄적인 샘플링을 허용 했다. 이러한 비문화 기반 접근법은 전통적인 문화 기반 방법보다 존재하는 실제 공동체를 보다 대표하는 것으로 여겨진다.
이 비디오는 세균성 지역 사회 DNA 추출의 비 배양 방법, 추출 된 DNA의 품질과 양을 확인하는 방법을 시연하고이 DNA가 세균 다양성을 연구하는 데 어떻게 활용될 수 있는지 탐구합니다.
토양에서 DNA 추출은 두 가지 방법 중 하나로 수행 될 수있다. 분획 방법에서, 세포는 먼저 유전 물질의 추출 전에 토양 매트릭스로부터 분리된다. 샘플은 펠릿에서 그대로 세포를 수집하기 위해 혼합 및 느린 원심 분리의 연속 주기를 받게됩니다.
리소지메스는 세포에 첨가되고 현탁액이 배양됩니다. 리소지메스는 세균세포벽을 분해하는 효소입니다. 세포벽 구조가 손상되면, DNA는 정제를 위해 해방될 수 있다. 그러나, 제2의 공동체 DNA 추출 방법, 시투 방법, 더 큰 DNA 농도를 산출하는 것으로 나타났다.
여기서, 토양의 질량은 Tris-EDTA 추출 버퍼 및 유리 구슬의 동등한 부피와 결합되고, 토양 입자로부터 세포의 분리를 용이하게 하기 위하여 공격적으로 혼합된다. 세제는 그 때, 일반적으로 나트륨 dodecyl 황산염, 또는 SDS를 추가하고, 견본은 DNA를 포함하여 세포의 lysing 및 그들의 내용물의 방출을 승진시키기 위하여 추가 혼합됩니다.
고온에서 잠복은 그 때 어떤 남아 있는 세균성 세포를 lyse하기 위하여 착수됩니다. 시료는 원심분리되고, 폴리에틸렌 글리콜 추출 및 배큐어는 DNA를 침전시키기 위해 상체에서 수행되며, 이는 그 후 펠릿으로 원심분리된다.
DNA는 단백질과 다당류의 DNA를 더 씻기 위해 TE 버퍼 및 칼륨 아세테이트에서 다시 중단된 다음 원심분리가 이러한 바람직하지 않은 성분을 pellet하기 위해 수행됩니다. DNA를 포함하는 수성 상체는 제거되고, 더 깨끗하고 DNA를 집중하기 위하여 페놀 클로로폼 추출 및 이소프로판올 강수량을 복종한다. 2 시간의 실온 잠복기 에 따라, DNA는 원심 분리및 분석까지 저장을 위한 TE 버퍼에서 재중단됩니다.
이제 우리는 세균 성 지역 사회 DNA 추출 뒤에 개념과 프로세스에 익숙해, 실험실에서 수행 되는 방법을 살펴 보자.
절차를 시작하려면 체질 토양 100 g의 무게를 측정합니다. 폴리 프로필렌 용기에 이것을 추가하고, 토양 매트릭스에서 박테리아의 방출을 촉진하기 위해 EDTA로 개정 된 트리스 버퍼로 구성된 추출 버퍼 100 mL을 추가 한 다음 손으로 흔들어.
다음으로, 유리 구슬 의 100 g의 무게, 믹싱 용기에 추가합니다. 비드 구타 장치 또는 기계손목 액션 셰이커를 사용하여 샘플을 5분 동안 양수합니다. 10mL 20% 나트륨 도데딜 황산염 또는 SDS를 혼합물에 넣고 1분 동안 교반합니다. 60 분 동안 고온에서 배양하십시오.
별도의 50mL 튜브, 원심분리기 는 6,000 x g에서 10분 동안 샘플을 분배합니다. 상체를 튜브에서 단일 멸균 용기로 옮기습니다. 다음으로, 추출 버퍼의 신선한 부피를 사용하여, 이전에 설명한 바와 같이 토양 펠릿에 추출을 반복한다.
다음으로, 30% 폴리에틸렌 글리콜과 1.6M 염화나트륨의 용액으로 반부적으로 채워진 깨끗한 50mL 튜브에 가공된 상체의 총 부피를 첨가한다. 병을 손으로 여러 번 반전시켜 혼합하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 원심분리기 샘플은 DNA를 펠릿하는 데 20분 동안 10,000 x g로 샘플링합니다.
원심분리기 튜브에서 상체를 조심스럽게 제거하고 부분적으로 정제된 핵산 펠릿을 남깁니다. 20mL의 TE 버퍼와 7.5M 칼륨 아세테이트 용액의 1.5mL를 추가하여 펠릿을 다시 한 번 재보펜합니다. 서스펜션을 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 단백질과 다당류를 침전시키기 위해 4°C에서 30분 동안 16,000 x g의 원심분리기.
다음으로, 샘플에 RNAAe와 단백질Ae K를 추가하고 손으로 부드럽게 섞어 잠시 앉습니다. 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올을 추출할 현탁액에 넣고 손으로 부드럽게 섞는다. 원심 분리기 는 13,000 x g에서 10 분 동안 준비합니다. 원심분리기에서 용기를 조심스럽게 제거하고 두 층을 주목한다.
바닥, 무거운 층은 페놀: 클로로폼:이소아밀 알코올 및 추출된 파편으로 구성되며, 상부 층은 수성이며 DNA를 함유하고 있다. 수성 상을 멸균 용기에 넣고 동등한 부피를 추가하고 DNA 강수량을 시작하기 위해 부드럽게 반전하십시오. 실온에서 서스펜션을 2시간 동안 배양합니다. 30 분 동안 16,000 x g에서 원심 분리에 의해 정제 된 DNA를 펠렛. 펠릿 DNA가 혈관의 바닥에 보이지 않을 수도 있고 보이지 않을 수 있기 때문에 상체를 조심스럽게 제거한 다음 TE 버퍼의 1mL에서 다시 중단한다.
분광계 또는 DNA/RNA 정량화 형광형계를 사용하여 샘플에서 추출한 DNA 수준을 측정합니다. DNA/RNA 불소계는 밀리리터당 나노그램 단위로 DNA 수준을 출력합니다. 농도가 너무 높으면 정확한 판독값을 위해 서스펜션 1에서 10 또는 분자 등급 물을 사용하여 1 에서 100으로 희석하십시오.
일단 DNA가 세균성 지역 사회에서 얻어지면, 이것은 다른 쪽에서 이용될 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램 중 일부는 여기에서 탐색됩니다.
지역 사회 DNA에서 추출 된 DNA의 분광 분석은 주어진 토양 샘플에 존재하는 세균 세포의 수에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 용액의 mL 당 ng에서 DNA의 추정 된 양은 용액에서 추출 된 DNA의 총 부피와 다시 관련 될 수있다, 토양의 g 당 DNA의 총 양을 제공하기 위해. 세포당 DNA의 이론적 값을 알면 토양 1g당 총 세포 수를 계산할 수 있습니다.
더 표적으로 한 응용을 위해, 세균성 지역 사회에서 추출된 DNA는 특정 종이 지역 사회 안에 존재하는지 결정하기 위하여 PCR를 복종할 수 있습니다. 예를 들면, 과학자는 토양 견본이 클로스트리듐 perfringens 또는 바실러스 탄트라시스와같은 특정 병원체를 포함하는지 여부를 확인할 수 있습니다.
마지막으로, 지역 사회에 존재하는 박테리아의 보다 포괄적인 이해를 얻기 위하여는, DNA 견본은 견본 내의 본래 박테리아의 더 깊은 분석을 허용하는 "omic" 및 생물정보 특성화를 복종할 수 있습니다. "Omics"는 유기체 또는 지역 사회에서 분자의 역할, 관계 및 행동을 탐구하는 다양한 기술을 설명합니다. 여기에는 유전자와 그 기능, 즉 "유전체학"과 "프로테오믹스", 단백질 및 그들의 역할에 대한 연구가 포함됩니다. 예를 들어, 샘플에서 16S RNA의 시퀀싱은 지역 사회 내의 특정 종의 metagenomic 측정을 허용하여 다양성에 대한 보다 상세한 추정치를 제공합니다. 이 접근은 과학자에게 지역 사회의 종 메이크업의 더 나은 이해를 줄 수 있습니다, 그리고 그들이 착수 할 수있는 역할.
당신은 세균 성 지역 사회 DNA 추출에 JoVE의 소개를 보았다. 이제 세균 성 지역 사회에서 DNA를 추출하는 방법, 이 DNA의 품질을 확인하는 방법, 그리고이 DNA가 세균 성 지역 사회 구성의 조사에 어떻게 사용될 수 있는지 이해해야합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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Applications and Summary
배양 된 식민지에서 또는 토양에서 추출 된 지역 사회 DNA는 샘플 내에서 원래 박테리아의 특성화를 허용하는 생물 정보학 및 "omic"접근 방식을 받을 수 있습니다. omic 접근은 metagenomics를 포함합니다 – 16S rRNA 시퀀싱을 통해 지역 사회 내의 "누구"의 결정. 이것은 지역 사회 내의 다양성에 대한 추정을 제공합니다.
원래 토양 샘플에서 세균 세포의 수를 계산할 수도 있다. 지역 사회 DNA는 토양에서 추출되고 분광 분석에 의해 정량화됩니다. 용액의 mL 당 μg DNA로 측정된 DNA의 추정양은 토양 의 g 당 총 DNA양을 주기 위해 용액에서 추출된 DNA의 총 부피와 다시 관련이 있다. 세포당 DNA의 이론적 가치를 알면 토양 1g당 총 세포 수를 계산할 수 있습니다.
본보기
토양은 토양 의 g 당 0.12 μg DNA를 가지고
각 세포에 DNA의 4 fg가 있는 경우에
추출된 지역 사회 DNA는 특정 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 실시하여 특정 종이 지역 사회 내에 존재하는지 확인할 수 있습니다. 예로는 클로스트리디움 퍼프린지 또는 바실러스 탄트라시스와같은 특정 세균성 병원균이 포함된다.
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