Overview
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
הפגנה סופרת: לואיזה איקנר
שיטות ניתוח מסורתיות עבור קהילות מיקרוביות בתוך קרקעות כללו בדרך כלל בדיקות תרבותיות המשתמשות במתודולוגיית דילול ו ציפוי על מדיה סלקטיבית ודיפרנציאלית או בדיקות ספירה ישירות. ספירות ישירות מציעות מידע על המספר הכולל של החיידקים הקיימים, אך לא נותנות מידע על מספר האוכלוסיות הקיימות בקהילה או על מגווןן. ספירת הלוחות מאפשרת ספירה של אוכלוסיות תרבותיות או נבחרות מוחלטות, ולכן מספקות מידע על האוכלוסיות השונות הקיימות. עם זאת, מאז פחות מ 1% של חיידקי הקרקע הם culturable בקלות, מידע תרבותי מציע רק חלק מהתמונה. החלק האמיתי של הקהילה שניתן לתרבות תלוי במדיום שנבחר לספירה תרבותית. כל מדיום יחיד יבחר עבור האוכלוסיות המתאימות ביותר למדיום המסוים הזה.
בשנים האחרונות ניכרו היתרונות של חקר הדנ"א הקהילתי המופק מדגימות קרקע. גישה זו המבוססת על תרבות נחשבת לייצוגית יותר של הקהילה עצמה מאשר גישות המבוססות על תרבות. בנוסף למתן מידע על סוגי האוכלוסיות הקיימות, גישה זו יכולה גם לספק מידע על הפוטנציאל הגנטי שלהם. כמו בכל טכניקה, יש מגבלות על הנתונים שניתן להשיג עם מיצוי DNA. לכן, חוקרים רבים משתמשים כעת בהפקת DNA בשילוב עם ספירות ישירות ותרבותיות כדי למקסם את הנתונים המתקבלים מדגימה סביבתית.
Principles
הפקת דנ"א מהאדמה יכולה להתבצע באחת משתידרכים (טבלה 1). בשיטת in inu, נעשה שימוש בשילוב של טכניקות כימיות ומכאניות. עבור מיצוי זה, מסה של אדמה משולבת עם נפח שווה ערך של חוצץ החילוץ. חרוזי זכוכית מתווספים לאחר מכן להשעיה יחד עם נפח של חומר ניקוי (נתרן דודסיל סולפט, או SDS, משמש בדרך כלל), ואת המדגם מעורבב כדי להקל על ההפרדה מחלקיקי הקרקע ואחריו דגירה בטמפרטורה גבוהה כדי לקדם תמוגה התא. לאחר צנטריפוגה, supernatant נתון צעדי מיצוי ודגירה נוספים על מנת לטהר את מוצר ה- DNA.
לחלופין, תאים עשויים להיות מופרדים תחילה (או מופרדים) מטריצת הקרקע לפני הפקת החומר הגנטי. מסה של דגימת קרקע עוברת מחזורים רצופים של מיזוג וצנטריפוגה איטית. עם זאת, הצעד של הכאת החרוזים מסולק כאן, על מנת לשמור על תאים שלמים, אשר צנטריפוגה כדי להשיג גלולה. מיצוי מבוסס ליזוזים מבוצע לאחר מכן בשילוב עם דגירה כדי לשבש את קירות התא ולשחרר DNA לטיהור.
כתב יד ווידאו זה ידגים את השיטה במקום של הפקת DNA מהאדמה, שכן הליך זה הוכח להניב ריכוזים גדולים יותר של DNA מדגימות קרקע ביחס לשיטת פירוק התא.
| בעיה | שבר חיידקי | בסיטו ליסיס |
| תפוקת ה- DNA | 1-5 מיקרוגרם/גרם | 1-20 מיקרוגרם/גרם |
| נציג הקהילה | פחות מייצג בגלל סופת תאים | נציג יותר, סופת תאים לא מושפעת |
| מקור הדנ"א התאושש | רק חיידקים | בעיקר חיידקים אבל גם פטריות ופרוטוזואה |
| מידת גזל ה-DNA | פחות גימה | גימה נוספת |
| גודל ממוצע של שברי DNA | 50 קילו | 25 קילו |
| מידת זיהום הומוס | פחות מזוהם | מזוהם יותר |
| קלות המתודולוגיה | נמוך, מייגע | מהיר יותר, פחות עתיר עבודה |
טבלה 1. השוואה של שבר חיידקי ומתודולוגיות תמוגות תמוגה במקום להתאוששות ה- DNA מהאדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הפקת דנ"א של קהילת החיידקים
- כדי להתחיל את ההליך, לשקול 100 גרם של אדמה מסונת. הוסף את זה לכלי פוליפרופילן, ולהוסיף 100 מ"ל של חיץ החילוץ המורכב חיץ טריס מתוקן עם EDTA כדי לקדם את שחרור החיידקים מטריצת הקרקע, ולאחר מכן ללחוץ ביד.
- לאחר מכן, לשקול 100 גרם של חרוזי זכוכית, ולהוסיף אלה לכלי ערבוב. להסעיר את המדגם במשך 5 דקות באמצעות מכשיר להכות חרוזים או שייקר פעולה פרק כף היד מכני במשך 15 דקות. מוסיפים 10 מ"ל 20% נתרן דודסיל סולפט, או SDS, לתערובת, ולאחר מכן להתסיס במשך דקה נוספת. דגירה בטמפרטורה גבוהה של 60 - 65 °C (60 °F) במשך 60 דקות.
- באותה מידה לחלק את המדגם בין צינורות נפרדים 50 מ"ל, וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 6,000 x g. מעבירים את הסופר-נט מהצינורות למיכל סטרילי אחד. לאחר מכן, חזור על החילוץ על גלולה הקרקע כפי שתואר בעבר, באמצעות נפח טרי של חיץ החילוץ.
- לאחר מכן, הוסף את הנפח הכולל של supernatant מעובד, כ 200 מ"ל, צינור 50 מ"ל נקי מלא לחצי נפח עם פתרון של 30% פוליאתילן גליקול ו 1.6 M נתרן כלורי. הפוך את הבקבוקים מספר פעמים ביד לערבב, ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות. דגימות צנטריפוגות ב 10,000 x g במשך 20 דקות כדי גלולה את ה- DNA.
- הסר את supernatant בזהירות מן צינור צנטריפוגה, משאיר מאחור את גלולה חומצת גרעין מטוהר חלקית. הוסף 20 מ"ל של מאגר TE ו- 1.5 מ"ל של פתרון אצטט אשלגן 7.5 M כדי תוסיף מחדש את הכדור ולאחר מכן מערבולת. מניחים את ההשעיה על הקרח למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (55 °F) כדי לזרז חלבונים ופוליסכרידים.
- לאחר מכן, מוסיפים RNAse ו- proteinase K לדגימה, מערבבים בעדינות ביד, ותנו לשבת לרגע. הוסף נפח שווה ערך של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל (תערובת יחס של 25:24:1) להשעיה שיש לחלץ, ומערבבים בעדינות ביד. צנטריפוגה ההכנה במשך 10 דקות ב 13,000 x g. הסר בזהירות את הכלי מן הצנטריפוגה, ולשים לב לשתי השכבות.
- השכבה התחתונה והכבדה יותר מורכבת מהפנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל ופסולת שחולצה, והשכבה העליונה היא מימית ומכילה את ה- DNA. מניחים את השלב מימי לתוך כלי סטרילי, מוסיפים נפח שווה ערך של איזופרופנול, ולהפוך בעדינות כדי ליזום משקעים DNA. לדגור על המתלים בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. פלט את הדנ"א המטוהר על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 30 דקות. הסר בזהירות את supernatant כמו DNA גלולה עשוי או לא יכול להיות גלוי בתחתית הכלי, ולאחר מכן resuspend ב 1 מ"ל של מאגר TE.
- באמצעות ספקטרופוטומטר או פלורימטר כימות DNA/ RNA, למדוד את רמת ה- DNA שחולץ מהדגימה. כמות הדנ"א מוערכת מקריאת 260 ננומטר. קריאת ספיגה של 1.0 שקולה ל-50 מיקרוגרם דנ"א למ"ל של פתרון. אם הריכוז גבוה מדי לקריאות מדויקות, לדלל את ההשעיה 1 עד 10, או 1 עד 100 באמצעות מים מולקולריים.
- טוהר הדנ"א מוערך מהיחס בין הקריאה ב-260 ננומטר לזה ב-280 ננומטר. ערך > 1.7 מצביע על דנ"א טהור יחסית. הערך התיאורטי המרבי הוא 2.0.
מיצוי דנ"א קהילתי חיידקי הוא תהליך שבאמצעותו מתקבל DNA ממיני חיידקים מרובים בתוך קהילה במהלך הליך מיצוי יחיד.
ניתוחים מסורתיים של קהילות מיקרוביות בקרקע כללו בדרך כלל בדיקות תרבותיות, תוך שימוש במתודולוגיית דילול ו ציפוי על מדיה סלקטיבית שונה. עם זאת, חיידקים רבים גדלים בצורה גרועה בתנאי מעבדה או בתנאי המדיה לצמיחה הספציפיים שנבחרו, כלומר הם עלולים להחמיץ או ייצוג חסר חמור.
לאחרונה, חילוץ דנ"א קהילתי מדגימות חיידקי קרקע אפשר דגימה מקיפה יותר של קהילות חיידקים. גישה זו שאינה מבוססת תרבות נחשבת לייצוגית יותר של הקהילות עצמן מאשר שיטות מבוססות תרבות מסורתיות.
וידאו זה מדגים שיטה שאינה תרבותית של מיצוי DNA קהילתי חיידקי, כיצד לבדוק את האיכות והכמות של DNA שחולץ, ולחקור כיצד ניתן להשתמש ב- DNA זה כדי לחקור מגוון חיידקי.
הפקת דנ"א מהאדמה יכולה להתבצע באחת משתי דרכים. בשיטת השבר, תאים מופרדים תחילה מטריצת הקרקע לפני הפקת החומר הגנטי. המדגם נתון לאחר מכן מחזורים רצופים של מיזוג וצנטריפוגה איטית על מנת לאסוף תאים שלמים בכדור.
לאחר מכן מוסיפים ליזוזים לתאים, והמתלים דוגרים. ליזוזים הם אנזימים שמפרקים את קירות תאי החיידקים. לאחר שמבנה דופן התא נפרץ, הדנ"א עשוי להשתחרר לטיהור. עם זאת, שיטה שנייה של מיצוי DNA קהילתי, שיטת in situ, הוכח להניב ריכוז DNA גדול יותר.
כאן, מסה של אדמה משולבת עם נפח שווה ערך של חיץ החילוץ Tris-EDTA וחרוזי זכוכית, ומעורבב באגרסיביות כדי להקל על הפרדת התאים מחלקיקי הקרקע. לאחר מכן מתווסף חומר ניקוי, בדרך כלל נתרן דודסיל סולפט, או SDS, והדגימה מעורבבת עוד יותר כדי לקדם את ליסינג התאים ולשחרר את התוכן שלהם, כולל DNA.
דגירה בטמפרטורה גבוהה מתבצעת לאחר מכן כדי לתבל את כל תאי החיידק הנותרים. דגימות הן צנטריפוגה, ופוליאתילן גליקול מיצוי ודגורה מבוצע על supernatant על מנת לזרז את ה- DNA, אשר לאחר מכן צנטריפוגה לתוך גלולה.
הדנ"א נמצא מחדש במאגר TE ואשלגן אצטט על מנת לשטוף עוד יותר את הדנ"א של חלבונים ופוליסכרידים, ואז צנטריפוגה מתבצעת כדי גלולה רכיבים לא רצויים אלה. סופרנט מימי המכיל את ה- DNA מוסר, וחשף מיצוי פנול-כלורופורם ומכלכי איזופרופנול כדי לנקות ולרכז את ה- DNA. לאחר תקופת דגירה בטמפרטורת החדר של שעתיים, ה- DNA הוא צנטריפוגה ו resuspended במאגר TE לאחסון עד ניתוח.
כעת, כאשר אנו מכירים את המושגים והתהליכים שמאחורי מיצוי דנ"א קהילתי חיידקי, בואו נסתכל על אופן ביצועו במעבדה.
כדי להתחיל את ההליך, לשקול 100 גרם של אדמה מסונת. הוסף את זה לכלי פוליפרופילן, ולהוסיף 100 מ"ל של חיץ החילוץ המורכב חיץ טריס מתוקן עם EDTA כדי לקדם את שחרור החיידקים מטריצת הקרקע, ולאחר מכן ללחוץ ביד.
לאחר מכן, לשקול 100 גרם של חרוזי זכוכית, ולהוסיף אלה לכלי ערבוב. להסעיר את המדגם במשך 5 דקות באמצעות מכשיר מכות חרוזים או שייקר פעולה מכני פרק כף היד. מוסיפים 10 מ"ל 20% נתרן דודסיל סולפט, או SDS, לתערובת, ולאחר מכן להתסיס במשך דקה נוספת. דגירה בטמפרטורה גבוהה במשך 60 דקות.
באותה מידה לחלק את המדגם בין צינורות 50 מ"ל נפרדים, וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 6,000 x g. מעבירים את הסופר-נט מהצינורות למיכל סטרילי אחד. לאחר מכן, חזור על החילוץ על גלולה הקרקע כפי שתואר בעבר, באמצעות נפח טרי של חיץ החילוץ.
לאחר מכן, הוסף את הנפח הכולל של supernatant מעובד צינור 50 מ"ל נקי מלא לחצי נפח עם פתרון של 30% פוליאתילן גליקול ו 1.6 M נתרן כלורי. הפוך את הבקבוקים מספר פעמים ביד לערבב, ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות. דגימות צנטריפוגות ב 10,000 x g במשך 20 דקות כדי גלולה את ה- DNA.
הסר את supernatant בזהירות מן צינור צנטריפוגה, משאיר מאחור את גלולה חומצת גרעין מטוהר חלקית. הוסף 20 מ"ל של מאגר TE ו- 1.5 מ"ל של פתרון אצטט אשלגן 7.5 M כדי תוסיף מחדש את הכדור ולאחר מכן מערבולת. מניחים את ההשעיה על הקרח למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (55 °F) כדי לזרז חלבונים ופוליסכרידים.
לאחר מכן, מוסיפים RNAse ו- proteinase K לדגימה, מערבבים בעדינות ביד, ותנו לשבת לרגע. הוסף נפח שווה ערך של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל כדי לחלץ, ומערבבים בעדינות ביד. צנטריפוגה ההכנה במשך 10 דקות ב 13,000 x g. הסר בזהירות את הכלי מן הצנטריפוגה, ולשים לב לשתי השכבות.
השכבה התחתונה והכבדה יותר מורכבת מהפנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל ופסולת שחולצה, והשכבה העליונה היא מימית ומכילה את ה- DNA. מניחים את השלב מימי לתוך כלי סטרילי, מוסיפים נפח שווה ערך של איזופרופנול, ולהפוך בעדינות כדי ליזום משקעים DNA. לדגור על המתלים בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. פלט את הדנ"א המטוהר על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 30 דקות. הסר בזהירות את supernatant כמו DNA גלולה עשוי או לא יכול להיות גלוי בתחתית הכלי, ולאחר מכן resuspend ב 1 מ"ל של מאגר TE.
באמצעות ספקטרופוטומטר או פלורימטר כימות DNA/ RNA, למדוד את רמת ה- DNA שחולץ מהדגימה. פלואורומטרים DNA / RNA יפלט רמות DNA ביחידות של ננוגרם למיליליטר. אם הריכוז גבוה מדי לקריאות מדויקות, לדלל את ההשעיה 1 עד 10, או 1 עד 100 באמצעות מים מולקולריים.
ברגע שהדנ"א מתקבל מקהילה חיידקית, ניתן להשתמש בו במספר דרכים שונות. חלק מהיישומים האלה נחקרים כאן.
ניתוחים ספקטרופיוגרפיים של הדנ"א המופק מהדנ"א הקהילתי יכולים לספק תובנה לגבי מספר תאי החיידקים הנמצאים בדגימת קרקע נתונה. הכמות המשוערת של DNA בng לכל mL של פתרון יכול להיות קשור בחזרה לנפח הכולל של DNA שחולץ בפתרון, כדי לתת את הכמות הכוללת של DNA לכל גרם של אדמה. לדעת את הערך התיאורטי של DNA לכל תא, המספר הכולל של תאים לכל גרם של אדמה ניתן לחשב.
עבור יישומים ממוקדים יותר, DNA המופק מקהילות חיידקים יכול להיות נתון PCR כדי לקבוע אם מין מסוים קיים בתוך הקהילה. לדוגמה, מדענים עשויים לרצות לזהות אם דגימות קרקע מכילות פתוגנים ספציפיים, כגון קלוסטרידיום פריינגנס או בצילוס אנתרקיס.
לבסוף, כדי לקבל הבנה מקיפה יותר של החיידקים הקיימים בקהילה, דגימות DNA יכולות להיות כפופות לאפיון "אומי" וביואינפורמטי המאפשר ניתוח מעמיק יותר של החיידקים המקוריים בתוך הדגימה. "Omics" מתאר מגוון טכנולוגיות שחוקרות תפקידים, מערכות יחסים ופעולות של מולקולות באורגניזמים או בקהילות. זה כולל את המחקרים של הגנים ותפקודם, או "גנומיקה", ו "פרוטאומיק", חקר חלבונים ותפקידיהם. לדוגמה, רצף של 16S RNA מהדגימות יכול לאפשר קביעה מטגנומית של מינים ספציפיים בתוך הקהילה, מתן הערכה מפורטת יותר של מגוון. גישה זו יכולה לתת למדענים הבנה טובה יותר של איפור המינים של קהילה, ומה תפקידים הם עשויים להיות התחייבות.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב להפקת דנ"א קהילתי חיידקי. עכשיו אתה צריך להבין איך לחלץ DNA מקהילה חיידקית, איך לבדוק את האיכות של DNA זה, וכיצד DNA זה יכול לשמש לחקירות של הרכב הקהילה חיידקים. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
דנ"א קהילתי ממושבות בתרבית או המופק מהאדמה יכול להיות נתון לביואינפורמטיקה וגישות "אומיות" המאפשרות אפיון של החיידקים המקוריים בתוך הדגימה. הגישות האומיות כוללות מטגנומיקה – קביעה של "מי" נמצא בתוך הקהילה באמצעות רצף 16S rRNA. זה נותן הערכה של המגוון בתוך הקהילה.
ניתן לחשב גם את מספר תאי החיידקים בדגימת הקרקע המקורית. דנ"א קהילתי מופק מאדמה ומכומת על ידי ניתוחים ספקטרוסקופיים. הכמות המשוערת של DNA הנמדד כ- DNA מיקרוגרם לכל mL של פתרון קשורה בחזרה לנפח הכולל של DNA המופק בתמיסה כדי לתת כמות כוללת של DNA לכל גרם של אדמה. על ידי ידיעת הערך התיאורטי של DNA לתא, ניתן לחשב את המספר הכולל של תאים לכל גרם של אדמה.
דוגמה
לאדמה יש 0.12 מיקרוגרם דנ"א לכל גרם של אדמה
אם לכל תא יש 4 fg של DNA
ה- DNA הקהילתי שחולץ יכול להיות נתון לניתוח PCR באמצעות פריימרים ספציפיים כדי לקבוע אם מין מסוים קיים בתוך הקהילה. דוגמאות כוללות פתוגנים חיידקיים ספציפיים כגון קלוסטרידיום פרינגנס או בצילוס אנתרקיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
