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Extracción de ADN de la comunidad de colonias bacterianas
 

Extracción de ADN de la comunidad de colonias bacterianas

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Comunidad bacteriana la extracción de ADN es un proceso por el cual ADN se obtiene de varias especies bacterianas dentro de una comunidad durante un procedimiento de extracción solo.

Análisis tradicionales de las comunidades microbianas en el suelo generalmente han implicado ensayos culturales, utilizando la dilución y galjanoplastia metodología en diferentes medios selectivos. Sin embargo, muchas bacterias crecen mal en condiciones de laboratorio o en las específicas medios condiciones de crecimiento seleccionadas, significando pueden ser perdidas o seriamente subrepresentados.

Recientemente, ha permitido extraer ADN de comunidad de muestras bacterianas del suelo para un muestreo más amplio de comunidades bacterianas. Este enfoque basado en la cultura no es probablemente más representativa de las comunidades reales presentes que métodos basados en la cultura tradicional.

Este video muestran un método no-cultura de la comunidad bacteriana la extracción de ADN, cómo comprobar la calidad y cantidad de ADN extraído y explorar cómo este ADN puede utilizarse para estudiar la diversidad bacteriana.

Extracción de ADN de suelo puede realizarse de dos maneras. En el método de fraccionamiento, las células se separan primero de la matriz del suelo antes de la extracción del material genético. La muestra entonces se somete a ciclos sucesivos de la mezcla y lento centrifugación para recoger las células intactas en un pellet.

Lisozimas se añaden a las células, y la suspensión se incuba. Lisozimas son enzimas que degradan las paredes celulares bacterianas. Una vez que se ha comprometido la estructura de la pared celular, el ADN puede entonces liberarse para la purificación. Sin embargo, un segundo método de comunidad de extracción de ADN, el método en situ , se ha demostrado para producir una mayor concentración de ADN.

Aquí, una masa de suelo se combina con un volumen equivalente de buffer de extracción Tris-EDTA y perlas de vidrio y agresivamente para facilitar la separación de las células de las partículas del suelo. Luego se añade un detergente, generalmente dodecil sulfato de sodio, o SDS y la muestra se mezcla aún más para promover la lisis de las células y la liberación de su contenido, incluyendo el ADN.

Incubación a una temperatura alta se realiza entonces a lyse las células bacterianas restantes. Las muestras son centrifugadas y una extracción de glicol de polietileno y la incubación se realiza en el sobrenadante para precipitar el ADN, que luego se centrifuga en un pellet.

El ADN se resuspendió en Buffer TE acetato de potasio para lavar el ADN de las proteínas y polisacáridos, y centrifugación se lleva a cabo a estos componentes indeseables de la pelotilla. El sobrenadante acuoso que contiene el ADN se extrae y sometido a una precipitación de extracción y isopropanol de fenol-cloroformo más limpio y concentrar el ADN. Después de un período de incubación de temperatura de dos horas, el ADN se centrifugó y resuspendió en Buffer TE para el almacenamiento hasta su análisis.

Ahora que estamos familiarizados con los conceptos y procesos detrás de comunidad bacteriana la extracción de ADN, echemos un vistazo a cómo se realiza en el laboratorio.

Para comenzar el procedimiento, pesar 100 g de suelo tamizado. Agregue esto a un recipiente de polipropileno y añadir 100 mL de tampón de extracción compuesta por Tris buffer modificado con EDTA para promover la liberación de bacterias de la matriz del suelo, luego agitar a mano.

A continuación, pesar 100 g de perlas de vidrio y agregar al recipiente de mezcla. Agitar la muestra durante 5 min mediante una tira a dispositivo o agitador de muñeca-acción mecánica. Añadir 10 mL 20% sodio dodecil sulfato, o SDS, a la mezcla y agite por un minuto adicional. Incubar a una temperatura alta durante 60 minutos.

Igualmente distribuir la muestra entre tubos separados 50 mL y centrifugar 10 min a 6.000 x g. transferir el sobrenadante de los tubos a un único contenedor estéril. A continuación, repetir la extracción en el sedimento del suelo como se describió anteriormente, utilizando un nuevo volumen de tampón de extracción.

A continuación, añadir el volumen total de procesados sobrenadante a un tubo de 50 mL limpio llenado a mitad de volumen con una solución 30% glicol de polietileno y 1,6 M de cloruro de sodio. Invertir las botellas varias veces con la mano para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. muestras de centrifugar a 10.000 x g por 20 min a la pelotilla de la DNA.

Retire el sobrenadante con cuidado el tubo de centrífuga, dejando atrás el pellet de ácidos nucleicos parcialmente purificada. Añadir 20 mL de Buffer TE y 1,5 mL de una solución de acetato de potasio de 7.5 M para Resuspender el precipitado, entonces el vórtice. Coloque la suspensión en hielo por 5 min centrifugar a 16.000 x g durante 30 min a 4 ° C para precipitar las proteínas y los polisacáridos.

A continuación, agregue una RNasa y proteinasa K a la muestra, mezclar suavemente con la mano y dejar reposar para el momento. Añadir un volumen equivalente de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico a la suspensión para extraer y mezclar suavemente con la mano. Centrifugar la preparación durante 10 minutos a 13.000 x g. Retire con cuidado el recipiente de la centrífuga y nota las dos capas.

La parte inferior, la capa más pesada se compone de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico y extrae desechos, y la capa superior es la acuosa y contiene el ADN. Colocar la fase acuosa en un recipiente estéril, agregar un volumen equivalente de isopropanol e invierta suavemente para iniciar la precipitación de ADN. Incubar la suspensión a temperatura ambiente durante 2 h. pelotilla de la DNA purificada por centrifugación a 16.000 x g por 30 minutos Retire con cuidado el sobrenadante como ADN concentrado puede o puede no ser visible en la parte inferior de la nave y luego resuspender en 1 mL de tampón TE.

Utilizando un espectrofotómetro o un Fluorímetro de cuantificación de ADN/ARN, medir el nivel de la DNA extraída de la muestra. Fluorimeters de ADN/ARN dará salida a los niveles de ADN en unidades de nanogramos por mililitro. Si la concentración es demasiado alta para lecturas precisas, diluir la suspensión de 1 a 10, o 1 a 100 con agua de grado molecular.

Una vez que el ADN se obtiene de una comunidad bacteriana, este puede ser utilizado en un número de maneras diferentes. Algunas de esas aplicaciones son exploradas aquí.

Spectrophotographic análisis de la DNA extraído de comunidad ADN pueden proporcionar una penetración en el número de células bacterianas presentes en una muestra de suelo dado. Puede relacionar con la cantidad estimada de ADN en ng por mL de solución en el volumen total del ADN extraído en solución, para dar la cantidad total de ADN por g de suelo. Conocer el valor teórico de ADN por célula, se puede calcular el número total de células por g de suelo.

Para más usos, apuntados la DNA extraída de comunidades bacterianas puede ser sometida a la PCR para determinar si una especie en particular está presente dentro de la comunidad. Por ejemplo, los científicos puede identificar si las muestras de suelo contienen patógenos específicos, tales como Clostridium perfringens o Bacillus anthracis.

Finalmente, para obtener una comprensión más completa de las bacterias presentes en una comunidad, muestras de ADN pueden ser sometidas a la caracterización "omic" y bioinformáticas que permitan análisis más profundo de la bacteria original dentro de la muestra. "Ómicas" describen una gama de tecnologías que explorar roles, relaciones y acciones de las moléculas en los organismos o comunidades. Esto incluye los estudios de genes y su función, o "Genómica" y "Proteómica", el estudio de proteínas y sus funciones. Por ejemplo, secuenciación del ARN 16S de las muestras puede permitir una determinación de metagenómica de especie específica dentro de la comunidad, dando una estimación más detallada de la diversidad. Este enfoque puede dar a los científicos una mejor comprensión de la composición de especies de una comunidad, y qué funciones pueden realizar.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a comunidad bacteriana la extracción de ADN. Ahora debería entender cómo extraer ADN de una comunidad bacteriana, cómo comprobar la calidad de este ADN, y cómo este DNA puede ser utilizado para las investigaciones de la composición de la comunidad bacteriana. ¡Gracias por ver!

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