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流细胞学和荧光活化细胞分拣(FACS):血性B淋巴细胞的分离
 

流细胞学和荧光活化细胞分拣(FACS):血性B淋巴细胞的分离

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免疫系统通过产生白细胞(也称为白细胞)来保护身体免受病原体入侵。当病原体成功感染生物体时,各种白细胞被激活,这种协调反应称为免疫反应。

通常,研究人员能够识别针对病原体被激活的免疫细胞的特定类型和数量是很有用的。流式细胞学是一种技术,它允许研究人员根据表面表达的特定表位分离细胞。这是使用荧光铬标记的单克隆抗体,结合已知的免疫细胞特异性表位,并在激发时,这些结合的氟铬发出一个波长的光,可以通过流动细胞仪检测和评分。

流量细胞仪由三个系统组成。流体系统将细胞在一个流中传输,以便它们一个接一个地在激光前面通过。光学系统由激光器和探测器组成,这些激光和探测器能够识别荧光道的存在或不存在。最后,电子系统将收集到的光学数据转换成电子文件进行分析。

流式细胞学的一个延伸是荧光激活细胞分拣机,或FACS,它允许特定细胞群的富集,以便可以独立研究。细胞分选使用流体流中的振动喷嘴完成,形成微液滴,每个液滴包含单个细胞。然后,探测器确定是否从每个液滴发射荧光灯,并根据这些信息,电磁铁为每个电池提供负电荷或正电荷。接下来,一个强大的电场将不同的充电液滴分类到单独的容器中。最终,其中一个容器将包含基于特定细胞表面分子的表达的均匀细胞群。

在本视频中,您将学习如何使用流细胞测定从小鼠脾脏组织和FACS分离白细胞,为B淋巴细胞选择。

首先,戴上实验室手套和适当的防护服。接下来,先用洗涤剂洗一把解剖剪刀和钳子,然后用70%的乙醇清洗,然后用干净的纸巾擦干。

然后,将49毫升汉克的平衡盐溶液(HBSS)加入50毫升的管子中。加入一毫升胎儿小牛血清,或FCS,以创建一个HBSS 2%FCS溶液,并通过轻轻上下移液混合约10次。

接下来,将安乐死小鼠放在解剖板上的苏普因位置。用剪刀和钳子,进行纵向腹腔切除术以进入腹腔。使用钳子将腹部右侧的肠道移到一侧,以暴露胃和脾脏。脾脏附着在胃上。然后,用移液器,将五毫升的HBSS 2%FCS放入培养皿中。使用钳子,小心地从胃中分离脾脏,并将脾脏放入培养皿中。

要分离免疫细胞,首先将脾脏放在培养皿中的40微米细胞滤网上。用柱塞压碎脾脏,将其分离到盘子里。然后,将分离的脾脏和液体从培养皿移入15毫升的离心管中。在 370 次 g 下在 10 摄氏度下将管离心 7 分钟,然后小心取回管,以免干扰颗粒。

现在,去除上清液,避免颗粒,并将液体丢弃在适当的废物容器中。然后,在离心管中加入两毫升ACK解毒缓冲液,以重新悬浮和赖解红细胞。等待两分钟,然后加入HBSS 2%FCS,以获得15毫升的总体积。重复离心。小心取回管子并丢弃上清液。再次在五毫升的HBSS 2%FCS中重新悬浮颗粒。

要计算再悬浮的细胞,用五微升的Trypan Blue稀释细胞悬浮液的五微升。然后,轻轻地在盖玻璃和马拉塞兹幻灯片之间沉积一个五微升的这个稀释的细胞悬浮液。现在,在放大倍率为40倍的显微镜下,计算存在的细胞数量。然后,通过添加适当的HBSS 2%FCS,将细胞浓度调整到每毫升10至第7个细胞。

要染色免疫细胞,首先将六个 FACS 管标记为 1 到 6。然后,将200微升的细胞溶液转移到六个管中的每一个。在370次g下,在10摄氏度下将这些管子离心7分钟,并去除上清液。

然后,将六个新的 FACS 管标记为一到六,将 200 微升的 HBSS 2% FCS 放入每个管中。根据表一,在每个管中加入适量的抗体,准备六种新型抗体混合物。混合一种是未染色的细胞,没有添加抗体。混合2到5个每个包含不同的单个抗体的补偿设置。混合六包含用于分拣的多染色细胞的所有四种抗体。

接下来,将这些抗体混合物转移到相应的编号FACS管中。在摄氏4度或黑暗冰面孵育这些溶液20分钟。接下来,在每个管中加入一毫升HBSS 2%FCS,然后再次离心。丢弃上清液,然后在 200 微升的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒。最后,将悬浮颗粒转移到新的标记的 FACS 管中。

要执行 FACS,请先打开分拣机。然后,选择细胞仪菜单并单击流体启动。按照屏幕上的说明操作。

在"流"选项卡上,单击红十字以打开流,然后等待 15 分钟,使流稳定下来。调整流的振幅,直到在流选项卡上看到明显的分离下降。然后,单击甜点以完成振幅调整。将中性密度或 ND 滤波器 1.0 插入激光前。

打开屏幕顶部的细胞仪菜单,然后选择 CST,它代表细胞仪设置和跟踪。为了执行日常质量控制,首先按照制造商的说明,在 FACS 管中稀释带有 FACS 介质的 CST 磁珠。然后,将管加载到机器中,并通过单击 CST 选项卡上的运行来执行 CST 控制。

CST 控制完成后,将 ND 1.0 过滤器替换为细胞仪上的 ND 2.0 滤波器。接下来,按照制造商的说明在 FACS 介质中稀释滴延迟磁珠,然后将管加载到 FACS 中。为确保正确排序,请先点击电压,然后点击滤光片,执行下降延迟。光学滤光片的右象限应等于 100%,表示机器已登记 100% 的滴。如有必要,向左或向右调整细胞仪上的红色激光螺钉,以获得 100% 的右侧象限。请务必确保流落入收集管中。为此,通过单击废品抽屉,然后测试排序来执行测试排序。检查侧流落入收集管。否则,请调整分拣卡舌下的电压,直到调整。

通过选择浏览器选项卡并单击共享视图导航到实验模板。然后,打开 Accudrop_DROP DELAY 实验并单击排序布局按钮。现在,通过操纵流速来更改采集仪表板上的阈值速率,直到流量达到每秒 3,000 个事件。单击电压,然后单击光学滤波器。左象限应等于零,右象限等于 100。

最后,在排序布局窗口中,单击排序,然后单击"取消"。左象限应等于 100,右象限等于零。如果左象限小于 95,请单击自动延迟以指示软件自动增加电压,以获得左象限中 100% 的降数。

为了开始流动细胞学,我们将首先使用未染色的细胞来定义细胞形态和氟铬的负峰。为此,请在机器中放置包含未染色单元格的管 1,并在采集仪表板选项卡下放置单击加载。在细胞计选项卡中,调整正向和侧散射电压,直到将细胞群视为屏幕上的密集点。淋巴细胞是小细胞,因此它们具有低前散射和低侧散射。

接下来,通过调整细胞计选项卡中氟铬的电压来去除背景荧光,直到全球工作表选项卡中处于负值的细胞群处于第一个十年。在细胞仪菜单中,单击视图配置并验证是否存在所有荧光铬。接下来,将管二放入细胞仪中,然后点击负载。调整细胞仪选项卡中的光谱重叠,直到负总体和正总体中位数在全局工作表选项卡中对齐。在"获取"选项卡上,将事件设置为将参数记录为 10,000,然后单击记录。用管三、四、五重复这些步骤。

接下来,负载管六,其中包含多染色细胞。要分离B淋巴细胞,首先设置参数,根据细胞的形态对细胞进行排序。在第一个窗口中,在 x 轴上的 y 轴和 SSC-A 侧散射区域上绘制 FSC-A 正向散射区域。在散点图中,每个点表示一个单元格。单击全局工作表上的多边形门,然后选择具有低正向散点和中间侧散射的填充。在新的点绘图窗口中,右键单击窗口并从菜单中选择显示填充,然后单击 P1。

然后,在新窗口中,通过在 x 轴上的 y 轴和 CD45 上绘制可行性来将可行的 CD45 正细胞门。使用多边形门圈圈具有低活力和高 CD45 信号的单元格,然后选择 P2 以在新窗口中显示所选单元格。在下一个窗口中,CD45阳性白细胞的门,不包括T淋巴细胞。在 x 轴上使用 CD45,在 y 轴上使用 CD3 3,用高 CD45 信号和低负 CD3 信号圈总体,然后选择 P3。最后,识别B淋巴细胞的CD19阳性细胞的门。在 x 轴上的 CD19 和 CD3 时,用高 CD19 信号和低负 CD3 信号圈出总体,然后选择 P4。

现在设置所有排序参数。接下来,在排序布局窗口中,选择您感兴趣的单元格群 - P4,这是门控的第四个总体,并告诉计算机仅对 B 淋巴细胞进行排序。将目标事件设置为 10,000 个单元格,并将精度设置为纯度。我们只对一个人口进行排序。但是,可以同时对最多四个不同的群体进行排序。准备就绪后,单击"排序"并确定。然后,等待单元格排序。

一旦细胞分拣完成,通过将10微升的分拣细胞移入带有90微升HBSS 2%FCS的新FACS管中,执行纯度控制。将管放入细胞仪中,单击负载,然后单击记录以分析细胞的表型,以验证浇注策略是否按预期工作。

现在,我们将分析已排序的细胞,以确定从小鼠脾脏分离的白细胞中 B 淋巴细胞的百分比。首先,双击 FlowJo 图标,并将每个管的文件拖到所有示例窗口中。

单击多边形并重新创建上一节中使用的门控策略。接下来,单击布局编辑器,将感兴趣的 B 淋巴细胞群从管 6 和纯度控制拖到布局编辑器选项卡中。在此示例中,右上角的绘图表示从脾细胞总悬浮液中排序的 B 淋巴细胞,右下角的图是纯度控制。细胞应只出现在纯度控制感兴趣的群体中。

要检查已排序单元格中 B 淋巴细胞的纯度,请单击表编辑器。从管六和在表中的纯度控制拖动 B 淋巴细胞群。在统计菜单上,选择CD45阳性细胞的频率,以测试该细胞群的纯度。然后,单击"创建表"。参数值将显示在新表中。在纯度控制窗口中,检查CD45阳性细胞内B淋巴细胞的频率,应高于98%。

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