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Konjugation: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz vom Spender auf den Empfänger E. coli

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Bakterielle Zellen, wie E. coli,sind in der Lage, genetische Informationen von Zelle zu Zelle zu übertragen. Konjugation unterscheidet sich von anderen Mechanismen der DNA-Übertragung, wie Transduktion oder Transformation, insofern, als sie physischen Kontakt zwischen den Zellen erfordert.

Um fortzufahren, erfordert konjugation eine Spenderzelle, die die Fruchtbarkeit oder F, Faktor und eine Empfängerzelle ohne sie, eine F minus Zelle ausdrückt. Der Prozess erfordert zwei Schritte. Die erste ist die Etablierung eines direkten Zell-zu-Zell-Kontakts. Dazu erzeugt die Spenderzelle eine extrazelluläre fadenförmige Struktur, die als Sexpilus bezeichnet wird. Es wird dies genannt, da Konjugation eine Form der Paarung für asexuell reproduzierende Bakterien ist, aber es sollte beachtet werden, dass es sich nicht um eine wahre sexuelle Fortpflanzung handelt, da keine Gameten ausgetauscht werden und keine Nachkommen gebildet werden.

Der zweite Schritt ist die Lieferung von DNA an die Empfängerzelle. Nachdem der Sexpilus den Kontakt zwischen zwei Zellen herstellt, wird ein Kanal namens Typ IV-Sekretionssystem gebaut, das die Übertragung von DNA ermöglicht. Die Spenderzelle beginnt dann, die extrachromosomale DNA zu replizieren, die basierend auf dem Vorhandensein eines genetischen Elements, das als OriT oder Herkunft der Übertragung bekannt ist, ausgewählt wird. Ein Ende der neu replizierten DNA wird durch DNA-Proteinbindung in den Kanal eingefädelt. Da die DNA weiter repliziert wird, wird sie durch den Kanal gepumpt, erleichtert durch einen Komplex von Proteinen, die von Genen in der Nähe des OriT kodiert sind. Sobald die DNA vollständig übertragen ist, bildet sie entweder ein zusätzliches Chromosomenplasmid oder sie kann sich in das Chromosom der Empfängerzelle integrieren. Unabhängig vom Endpunkt der übertragenen DNA werden dann die Gene, die sie kodiert, exprimiert. Diese Genexpression kann verwendet werden, um eine erfolgreiche Konjugation zu bestätigen.

Betrachten Sie beispielsweise ein Szenario, in dem der Spenderstamm ampicillin-Resistenz ausdrückt und diese in der konjugierten DNA an das Empfängerbakterium weitergibt, aber der Empfängerstamm hat auch ein Tetracyclin-Resistenzgen, das nicht im Spender vorhanden ist. In diesem Fall, wenn die Zellen auf LB-Medien plattiert werden, die sowohl Tetracyclin als auch Ampicillin enthalten, sollten Kolonien nur aus erfolgreich konjugierten Bakterien wachsen, die beide Resistenz-Phänotypen exdrücken. Um eine erfolgreiche Konjugation weiter zu bestätigen, kann Plasmid-DNA aus diesen Kolonien geerntet werden und dann kann ein dna-spezifisch für das übertragene Plasmid mit Polymerase-Kettenreaktion oder PCR verstärkt werden. Wenn das PCR-Produkt auf einem Elektrophorese-Gel neben einer Leiter von Standardgrößen ausgeführt wird, sollte ein PCR-Fragment bekannter Größe auf dem Gel sichtbar sein, was eine erfolgreiche Konjugation bestätigt. In diesem Experiment wird ein Plasmid verwendet, um das Ampicillinresistenzgen über Konjugation von einem Spenderstamm auf einen tetracyclinresistenten Empfängerstamm zu übertragen. Danach, um die Konjugation zu bestätigen, wird das Konjugationsgemisch auf einem Teller inkubiert, der beide Antibiotika enthält und nur die transformierten Bakterien zurücklässt. Schließlich wird die erfolgreiche Konjugation mit PCR weiter bestätigt.

Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, ziehen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich laborierter Kleidung und Handschuhe. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol, um die Oberfläche abzuwischen.

Bei diesem Verfahren wird das Ampicillinresistenzgen vom WM3064-Stamm von E. coli über Konjugation auf den J53-Stamm von E. coli übertragen. Der Spenderstamm WM3064 ist resistent gegen Tetracyclin und Ampicillin und erfordert Diaminopimelsäure, oder DAP, um zu wachsen. Die Empfängersorte J53 ist nur gegen Tetracyclin resistent und erfordert kein DaP-Wachstum. Dies bedeutet, dass erfolgreich konjugierte Zellen gegen Tetracyclin und Ampicillin resistent sein und ohne DAP wachsen können.

Bereiten Sie die Spenderstammkultur vor, indem Sie fünf Milliliter LB mit 0,3 Millimoles DAP mit einem Schrott des gefrorenen Spenderstamms Glycerin-Bestand impfen. Bereiten Sie dann die Empfängersorte vor, indem Sie fünf Milliliter LB-Brühe ohne DAP mit einem Schrott des gefrorenen Empfängerstamms Glycerinbrühe impfen. Wachsen Sie diese Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung und Schütteln bei 220 RPM in einem schütteren Brutkasten. Sobald die Kulturen auf eine OD 600 von zwei gewachsen sind, entfernen Sie jeweils einen Milliliter Kultur und legen Sie diese in zwei neue separate 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren. Dann zentrifugieren Sie diese Aliquots bei 3000 U/min für fünf Minuten, um die Bakterienzellen zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie jedes Pellet mit 250 Mikrolitern 1X PBS. Zentrifugieren Sie die Proben erneut und setzen Sie nach dem Wegwerfen des Überstandes jedes Pellet in 500 Mikroliter PBS wieder auf.

Um das Konjugationsverfahren zu beginnen, kombinieren Sie zunächst 50 Mikroliter Empfängerzellen mit 50 Mikrolitern Spenderzellen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und mischen Sie sich durch sanftes Auf- und Abpfeifen. Als nächstes Pipette 100 Mikroliter der Empfängerzellkultur auf eine weitere 1X Tetracyclinplatte, die DAP enthält. Bereiten Sie als Nächstes Ihre Negativkontrolle vor, indem Sie 100 Mikroliter der Empfängerzellkultur nur auf eine nicht selektive Agarplatte, die DAP enthält, pipetieren. Dann inkubieren Sie die Konjugations- und Negativkontrollplatten über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag einen sterilen Zellschaber nehmen und Zellen von der Konjugationsplatte ernten, indem Sie Kolonien sammeln. Dann übertragen Sie die Kolonien in ein steriles 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, das einen Milliliter 1X PBS enthält. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Empfängerzellen von der anderen Platte zu sammeln.

Danach wirbeln die zu mischenden Proben aus. Nach dem Mischen die Rohre in eine Zentrifuge geben, um die Zellen sanft zu pelleten. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie dann die Zellpellets in einem Milliliter PBS und wirbeln Sie die Rohre, um die Zellen wieder aufzuhängen. Pellet die Zellen wieder durch Zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand erneut und setzen Sie beide Zellpellets in einem Milliliter PBS wieder aus. Jetzt, mit einer sterilen Pipettenspitze, Platte 100 Mikroliter der Konjugationsreaktionszellmischung auf eine LB Agarplatte ohne DAP enthält 1X Tetracyclin und 1X Ampicillin. Wiederholen Sie das Beschichtungsverfahren mit 100 Mikrolitern einer zehnfachen Verdünnung desselben Zellgemisches in PBS auf eine andere LB-Agarplatte ohne DAP, die 1X Tetracyclin und 1X Ampicillin enthält.

Schließlich Pipette 100 Mikroliter der negativen Kontrollzellmischung auf eine einzelne LB-Agarplatte mit 1X Tetracyclin nur. Nach einer nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius sollten die Kolonien sichtbar sein. Mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne Kolonie aus der Konjugationsreaktionsplatte pflücken und in ein Rohr geben, das fünf Milliliter selektiver LB-Medien enthält, die beide Antibiotika enthalten. Wiederholen Sie dann die Kolonieisolation, indem Sie eine einzelne Kolonie aus der Empfängerzellplatte auswählen. Wachsen Sie diese Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung bei 220 RPM.

Am nächsten Tag die Bankspitze mit 70% Ethanol abwischen und die Platten aus dem Inkubator entfernen. Verwenden Sie ein DNA-Mini-Vorbereitungskit, um DNA von 4 zu isolieren. 5 Milliliter jeder Kultur nach den Anweisungen des Herstellers. Nach Abschluss der DNA-Mini-Vorbereitung, elute die DNA mit 35 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Verwenden Sie schließlich die verbleibende 0. 5 Milliliter jeder Kultur, um einen Milliliter Glycerinvorräte zuzubereiten, indem 0,5 Milliliter 100% Glycerin für eine Eins-zu-eins-Verdünnung hinzugefügt werden. Platzieren Sie diese Aliquots bei minus 80 Grad Celsius, bis sie gelagert werden.

Um die erfolgreiche Konjugation durch PCR zu bestätigen, bereiten Sie zunächst einen PCR-Master-Mix vor, indem Sie 75 Mikroliter 2X PCR-Master-Mix zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzufügen. Fügen Sie dann 7,5 Mikroliter eines 10 Mikromolaren Vorwärtsprimers und einer 10 Mikromolaren-Reverse-Primer hinzu, die entwickelt wurde, um das Ampicillin-Resistenzgen aus dem Plasmid zu verstärken. Als nächstes bereiten Sie einen zweiten PCR-Master-Mix vor, indem Sie 75 Mikroliter 2X PCR-Master-Mix zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzufügen und dann 7,5 Mikroliter eines 10 Mikromolaren-Vorwärtsprimers und 10 Mikromolaren-Reverseprimers hinzufügen, die entwickelt wurden, um ein Housekeeping-Gen, in diesem Fall DNA, zu verstärken. Gyrase B.

Fügen Sie nun 15 Mikroliter des ersten Master-Mix zu einer PCR-Röhre hinzu und fügen Sie dann 10 Nanogramm, etwa zwei Mikroliter der versuchsexperimentellen DNA der Schablone, in dieselbe Röhre ein. Bringen Sie die Reaktion auf ein Endvolumen von 25 Mikrolitern mit nukleasefreiem Wasser. Wiederholen Sie diese Schritte, um die verbleibenden fünf Reaktionen zu erzeugen, so dass die Rohre die hier gezeigten Komponenten enthalten. Übertragen Sie nun diese Reaktionen auf einen Thermocycler, bei dem der Block auf 98 Grad Celsius vorgeheizt ist, und starten Sie dann das Programm. Entfernen Sie nach Abschluss der PCR die Rohre von der Maschine. Dann laden Sie zwei Mikroliter jeder Reaktion gemischt mit zwei Mikroliter Nutzfarbstoff und vier Mikroliter eines Molekulargewichtsmarkers in aufeinander folgende Brunnen eines 1% Agarose-Gels. Stellen Sie das Gel auf 150 Volt für 20 Minuten. Schließlich visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Beleuchtung.

In diesem Experiment wurde die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens über die Konjugation mittels PCR bestätigt. Hier bei der Konjugatierten DNA und ampicillin primer sollte ein etwa 500 Basispaargroßes Band beobachtet werden, gut zwei in diesem Beispiel. Ein Housekeeping-Gen, DNA-Gyrase B, wurde in Brunnen drei und fünf mit konjugierter DNA bzw. Empfängerzell-DNA geladen. Bänder, die in diesen Brunnen beobachtet werden, wirken als positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass die DNA-Vorlage vorhanden war und dass PCR erfolgreich war. Bänder sollten im Brunnen, der die Reaktion für die Empfängerzell-DNA und das Ampicillin-Primerpaar enthält, nicht beobachtet werden, gut vier in diesem Beispiel, da die Empfängerzellen nicht ampicillinresistent sind. Zusätzlich sollten keine Bänder in den Reaktionen ohne Vorlagen-DNA beobachtet werden, Brunnen sechs und sieben hier. Wenn diese Bedingungen erfüllt sind, wird dies die erfolgreiche Übertragung des Ampicillin-Resistenzgens bestätigen, was eine Ampicillinresistenz vom WM3064-Stamm von E. coli auf den J53-Stamm von E. coliverleiht.

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