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結合:アンピシリン耐性をドナーからレシピエント大腸菌に移す方法

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大腸菌などの細菌細胞は、遺伝情報を細胞から細胞に移すことができる。結合は、細胞間の物理的な接触を必要とするという点で、転写や形質転換などのDNA伝達の他のメカニズムとは異なる。

続行するには、生殖能力を発現するドナー細胞、またはF因子およびそれなしでレシピエント細胞を発現するドナー細胞、Fマイナスセルが必要である。このプロセスには 2 つの手順が必要です。1つ目は、細胞間接触の直接的な確立である。これを行うには、ドナー細胞は、性ピラスと呼ばれる細胞外糸状構造を生成する。これは、コンジュゲーションは無性繁殖細菌の交配の一形態であるので、この名前が付けられていますが、ゲームが交換されず、子孫が形成されないため、それは真の性的生殖ではないことに留意すべきです。

第2のステップは、レシピエント細胞へのDNAの送達である。性ピラスが2つの細胞間の接触を確立した後、タイプIV分泌システムと呼ばれる導管が構築され、DNAの移動を可能にする。次いで、ドナー細胞は、OriTまたは転移の起源として知られている遺伝的要素の存在に基づいて選択される転写される外染色体DNAを複製し始める。新たに複製されたDNAの一端は、DNAタンパク質結合を介して導管に通される。DNAがさらに複製されると、チャネルを通してポンピングされ、OriTの近くに位置する遺伝子によってコードされるタンパク質の複合体によって促進される。DNAが完全に移された後、余分な染色体プラスミドを形成するか、またはレシピエント細胞の染色体に統合されてもよい。転送されたDNAのエンドポイントのいずれにしても、それがコードする遺伝子は発現されます。この遺伝子発現は、成功した結合を確認するために使用することができる。

例えば、ドナー株がアンピシリン耐性を発現し、共役DNAでこれをレシピエント細菌に渡すシナリオを考えてみましょうが、レシピエント株はドナーに存在しないテトラサイクリン耐性遺伝子も有する。この場合、細胞がテトラサイクリンとアンピシリンの両方を含むLB培地にメッキされると、コロニーは正常に共役細菌からのみ成長する必要があり、これは両方の耐性表現型を発現することになる。さらに成功した結合を確認するために、これらのコロニーからのプラスミドDNAを採取することができ、次に、移されたプラスミドに特異的なDNAのセクションをポリメラーゼ連鎖反応、またはPCRを使用して増幅することができる。PCR製品が標準サイズのはしごと一緒に電気泳動ゲル上で実行される場合、既知のサイズのPCR断片がゲル上に表示され、さらに成功した結合を確認する必要があります。この実験では、プラスミドを使用して、ドナー株からテトラサイクリン耐性レシピエント株への結合を介してアンピシリン耐性遺伝子を伝達する。この後、共役を確認するために、共役混合物は、形質転換細菌のみを残して両方の抗生物質を含むプレート上でインキュベートされる。最後に、成功した共役はPCRでさらに確認されます。

手順を開始する前に、ラボコートや手袋を含む適切な個人用保護具を着用してください。次に、70%のエタノールを使用してワークスペースを殺菌し、表面を拭き取ります。

この手順では、アンピシリン耐性遺伝子を大腸菌のWM3064株から大腸菌のJ53株に結合を介して転移する。ドナー株WM3064はテトラサイクリンおよびアンピシリンに対して耐性であり、成長するためにジアミノピメル酸、またはDAPを必要とする。レシピエント株J53はテトラサイクリンに対してのみ耐性であり、DAPが成長する必要はありません。これは、正常に共役細胞がテトラサイクリンとアンピシリンに耐性であるべきであり、DAPなしで成長できることを意味します。

凍結ドナー株グリセロールストックのスクラップでDAPの0.3ミリモルを含むLBの5ミリリットルを接種することにより、ドナー株培養を調製する。次いで、凍結レシピエント株グリセロールストックのスクラップを用いてDAPなしでLBブロスの5ミリリットルを接種してレシピエント株を調製する。これらの培養物を37°Cで一晩成長させ、220 RPMで揺れ動きます。培養物が2のOD 600に成長したら、それぞれから1ミリリットルの培養物を取り除き、これを2つの別々の1.5ミリリットルマイクロ遠心管に入れます。次いで、これらのアリコートを3000RPMで5分間遠心分離し、細菌細胞をペレットする。上清を廃棄し、1X PBSの250マイクロリットルで各ペレットを洗浄します。サンプルを再度遠心分離し、上清を廃棄した後、PBSの500マイクロリットルで各ペレットを再懸濁する。

共役手順を開始するには、まず50マイクロリットルのレシピエント細胞と50マイクロリットルのドナー細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に組み合わせ、上下にピペッティングして混ぜます。次に、レシピエント細胞培養のピペット100マイクロリットルをDAPを含む別の1Xテトラサイクリンプレート上に置く。次に、DAPを含む非選択的寒天プレート上にのみ、レシピエント細胞培養の100マイクロリットルをピペッティングして陰性コントロールを調製する。その後、コンジュゲーションと負のコントロールプレートを一晩37°Cでインキュベートします。

翌日、コロニーを採取して生殖細胞スクレーパーを採取し、結合板から細胞を収穫する。次に、コロニーを1X PBSの1ミリリットルを含む無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心管に移す。このプロセスを繰り返して、他のプレートから受信者セルを収集します。

この後、混合するサンプルを渦させる。混合した後、チューブを遠心分離機に移し、細胞を穏やかにペレットにする。上清を廃棄し、その後、PBSの1ミリリットルで細胞ペレットを洗浄し、細胞を再懸濁するためにチューブを渦。遠心分離によって再び細胞をペレット。再び上清を廃棄し、PBSの1ミリリットルで両方の細胞ペレットを再懸濁します。さて、無菌ピペット先端を用いて、1Xテトラサイクリンおよび1Xアンピシリンを含有するDAPを含まないLB寒天板上に共役反応細胞混合物の100マイクロリットルをプレートする。1Xテトラサイクリンと1Xアンピシリンを含むDAPを含まない別のLB寒天プレートにPBS中の同じ細胞混合物の100倍希釈の100マイクロリットルを使用してめっき方法を繰り返します。

最後に、1Xテトラサイクリンのみを有する単一のLB寒天プレート上に陰性対照細胞混合物のピペット100マイクロリットル。摂氏37度で一晩インキュベーションした後、コロニーが見えるはずです。無菌ピペット先端を使用して、共役反応プレートから単一のコロニーを選択し、両方の抗生物質を含む選択的LB培地の5ミリリットルを含むチューブに追加します。次いで、レシピエント細胞板から単一のコロニーを選択してコロニー分離を繰り返す。220 RPMで通気で摂氏37度で一晩これらの文化を成長させます。

翌日、70%のエタノールでベンチトップを拭き取り、インキュベーターからプレートを取り出します。DNAミニ準備キットを使用して、4からDNAを分離します。メーカーの指示に従って各培養の5ミリリットル。DNAミニ準備を完了した後、ヌクレアーゼフリー水の35マイクロリットルを使用してDNAを溶出します。最後に、残りの 0 を使用します。各培養物の5ミリリットルは、1対1の希釈のために100%グリセロールの0.5ミリリットルを追加することにより、1ミリリットルのグリセロールストックを調製する。必要になるまで保存のために、これらのアリコートをマイナス80度に置きます。

PCRによるコンジュゲーションの成功を確認するには、まずマイクロ遠心管に75マイクロリットルの2X PCRマスターミックスを加えてPCRマスターミックスを準備します。次いで、10マイクロモルフォワードプライマーとプラスミドからアンピシリン耐性遺伝子を増幅するように設計された10マイクロモルリバースプライマーのそれぞれに7.5マイクロリットルを加えます。次に、マイクロ遠心チューブに75マイクロリットルの2X PCRマスターミックスを追加し、10マイクロモルフォワードプライマーと10マイクロモルリバースプライマーのそれぞれを追加して、2番目のPCRマスターミックスを準備し、この場合はDNAギラゼ B.

次に、最初のマスターミックスの15マイクロリットルをPCRチューブに追加し、10ナノグラム、テンプレート実験DNAの約2マイクロリットルを同じチューブに追加します。ヌクレルリースフリー水で25マイクロリットルの最終容積まで反応を持ち込みます。これらの手順を繰り返して残りの 5 つの反応を生成し、チューブにここに示すコンポーネントが含まれるようにします。次に、これらの反応をブロックを98°Cに予熱したサーモサイクラーに移し、プログラムを開始します。PCRが完了したら、機械からチューブを取り外します。次に、各反応の2マイクロリットルを装填染料の2マイクロリットルと分子量マーカーの4マイクロリットルを1%のアガロースゲルの連続したウェルに積み込む。ゲルを150ボルトで20分間動かします。最後に、UVイルミレータを使用してゲルを視覚化します。

本実験では、コンジュゲーションを介したアンピシリン耐性遺伝子の正常な転移をPCRを介して確認した。ここで、約500塩基対サイズのバンドは、共役DNAおよびアンピシリンプライマーを含むウェル内で観察されるべきであるが、この例では2つである。ハウスキーピング遺伝子であるDNAジャイラゼBは、それぞれ共役DNAとレシピエント細胞DNAを持つウェル3と5にロードされた。これらのウェルで観察されたバンドは、DNAテンプレートが存在し、PCRが成功したことを確認するための陽性対照として機能します。レシピエント細胞DNAおよびアンピシリンプライマー対に対する反応を含むウェルにおいてバンドが観察されるべきではないが、この例では、レシピエント細胞がアンピシリン耐性ではないため、ウェル4である。さらに、テンプレートDNAを欠く反応ではバンドが観察されなくてはならない、ここで6と7をウェル。これらの条件が満たされれば、アンピシリン耐性遺伝子の正常な転移が確認され、大腸菌のWM3064株から大腸菌のJ53株にアンピシリン耐性を付与する。

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