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Phage Transduction: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz vom Spender auf den Empfänger E. coli

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Bakterien können sich schnell an eine sich schnell verändernde Umgebung anpassen, indem sie genetisches Material austauschen, und eine Möglichkeit, dies zu tun, ist die Transduktion, der Austausch von genetischem Material, das durch bakterielle Viren vermittelt wird. Ein Bakteriophagen, oft abgekürzt als Phagen, ist eine Art von Virus, das Bakterien infiziert, indem es zuerst an der Oberfläche des Wirts befestigt und dann seine DNA in die Bakterienzelle injiziert. Es degradiert dann die eigene DNA der Wirtszelle und repliziert ihr virales Genom, während die Maschinerie der Zelle entführt wird, um viele Kopien ihrer Proteine zu synthetisieren. Diese Phagenproteine bauen sich dann selbst zusammen und verpacken die Phagengenome zu mehreren Nachkommen. Aufgrund der geringen Genauigkeit des DNA-Verpackungsmechanismus verpackt der Phagen jedoch gelegentlich Fragmente bakterieller DNA in das Phagenkapsid. Nach der Induktion der Lyse des Wirts werden die Phagennachkommen freigesetzt und, sobald ein solcher Phagen eine andere Wirtszelle infiziert, überträgt es das DNA-Fragment seines vorherigen Wirts. Diese kann sich dann rekombinieren und dauerhaft in das Chromosom des neuen Wirts einfließen lassen, wodurch der Gentransfer zwischen den beiden Bakterien vermittelt wird.

Um die Phagentransduktion im Labor durchzuführen, bedarf es eines Spenderstamms, der ein Gen von Interesse enthält, einen Empfängerstamm, dem es fehlt, einen Phagen, der sowohl die Stämme infizieren kann, als auch eine Methode zur Auswahl der transduzierten Bakterien. In den meisten Fällen wird dies ein selektives festes Wachstumsmedium sein, das das Wachstum von transduzierten Bakterien unterstützt, aber das Wachstum von nicht-transduced hemmt. Zunächst wird der Spenderstamm, der das Gen von Interesse enthält, in einem flüssigen Wachstumsmedium kultiviert. Wenn sich alle Bakterien aktiv in der Logphase ihres Wachstums aufteilen, wird die Kultur mit dem Zielphagen geimpft. Nach drei bis vier Stunden Inkubation, wenn fast alle Bakterien die Phagenpartikel gelysiert und freigesetzt haben, wird das Spenderphagenlysat in eine frisch gewachsene Kultur des Empfänger-Bakterienstamms geimpft. Nach einer kurzen Inkubation von einer Stunde sollte die Kultur nun eine Mischung aus transduzierten und nicht transduzierten Bakterienzellen enthalten, die auf die transduzierten Zellen abgeschirmt wird, indem ein Bruchteil der Suspension auf ein geeignetes selektives, festes Wachstumsmedium verteilt wird. Nach einer weiteren Inkubation sollten die transduzierten Zellen wachsen und sich vermehren, um sichtbare Kolonien zu ergeben. Diese Kolonien können dann für eine weitere Analyse mit einer Vielzahl von Methoden ausgewählt werden, um eine erfolgreiche Transduktion weiter zu bestätigen, wie Kolonie-PCR, DNA-Sequenzierung oder quantitative PCR.

Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, ziehen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstungen an, einschließlich laborierter Kleidung und Handschuhe. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie die Oberfläche ab.

Danach drei Ein-Milliliter-Aliquots LB-Salzlösung vorbereiten. Bereiten Sie nun eine Spenderstammkultur vor, indem Sie 100 Mikroliter E. coli zu einer 15 Milliliter konischen Durchstechflasche hinzufügen, die fünf Milliliter LB-Wachstumsmedium mit 500 Mikrogramm Ampicillin enthält. Dann wachsen die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung und Schütteln bei 220 Rpm. Wischen Sie am nächsten Tag die Bankspitze mit 70% Ethanol ab, bevor Sie die Kultur aus dem zitternden Inkubator entfernen. Als nächstes verdünnen Sie die Nachtkultur eins bis 100, indem Sie 10 Mikroliter Spenderstamm zu 990 Mikrolitern frischem LB hinzufügen, die mit Salzlösung ergänzt werden.

Lassen Sie die bakterielle Verdünnung bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden mit Belüftung und Schütteln bei 220 Rpm wachsen. Sobald die Zellen die frühe Log-Phase erreicht haben, entfernen Sie die Kultur aus dem Inkubator, fügen Sie 40 Mikroliter P1-Phagen in die Kultur ein und brüten sie erneut an. Überwachen Sie die Zellen ein bis drei Stunden lang, bis die Kultur lysiert ist. Als nächstes 50 bis 100 Mikroliter Chloroform in das Lysat geben und durch Wirbeln mischen. Zentrifugieren Sie dann das Lysat, um Schmutz zu entfernen und den Überstand in ein frisches Rohr zu übertragen. Fügen Sie dem Überstand ein paar Tropfen Chloroform hinzu und lagern Sie es bei vier Grad Celsius für nicht mehr als einen Tag.

Um das Transduktionsverfahren zu beginnen, erhalten Sie eine Ein-Milliliter-Kultur der Empfänger-Sorte. Als nächstes übertragen Sie 100 Mikroliter Spenderphagen lysiert in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius, wobei die Kappe 30 Minuten geöffnet ist, damit die verbleibende Chloroform verdampfen kann. Während der Spender phagen lysiert, pellet der Empfänger die Zellen durch sanfte Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 300 Mikroliter frischem LB mit 100 Millimolaren Magnesiumsulfat und fünf Millimolar Calciumchlorid wieder auf.

Als nächstes richten Sie die Transduktionsreaktion ein, indem Sie 100 Mikroliter des Empfängerstamms und 100 Mikroliter des Spenderphagenlysats in einem Mikrozentrifugenrohr kombinieren. Richten Sie dann die Negativkontrolle ein, indem Sie 100 Mikroliter des Empfängerstamms und 100 Mikroliter des LB mit Magnesiumsulfat und Calciumchlorid kombinieren. Nach der Inkubation 200 Mikroliter eines molaren Natriumcitrats und einen Milliliter LB in beide Schläuche geben und durch sanftes Pipetieren nach oben und unten mischen. Nachdem die Schläuche eine Stunde lang inkubiert wurden, pellet enden die Zellen vorsichtig per Zentrifugation.

Nach der Zentrifugierung den Überstand entsorgen und die pelletierten Zellen in 100 MikroliterLB mit 100 Millimolar-Natriumcitrat wieder aufsetzen. Wirbel die Lösungen und Pipette die gesamte transduced Probe auf eine LB Agarplatte mit 1X Ampicillin. Schließlich pipette das gesamte Volumen der negativen Kontrollzellmischung auf eine LB-Agarplatte ohne Ampicillin. Nachdem Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um drei bis vier Kolonien von der Transduktionsplatte zu pflücken und auf eine neue LB-Agarplatte mit 1X Ampicillin und 100 Mikrolitern eines molaren Natriumcitrats zu streifen. Wiederholen Sie diese Beschichtungsmethode für die Negativkontrolle auf einer anderen LB-Agarplatte, die nur 100 Mikroliter eines molaren Natriumcitrats enthält. Dann bebrüten die Teller bei 37 Grad Celsius über Nacht, damit Kolonien ohne Phagen wachsen können.

Wischen Sie am nächsten Tag die Bankspitze mit 70% Ethanol ab, bevor Sie Ihre Platten aus dem Inkubator entfernen. Mit einer sterilen Pipettenspitze drei Kolonien von der Transduktionsplatte pflücken und jeweils in ein separates Rohr mit fünf MilliliterN LB-Medien geben. Wählen Sie dann drei Kolonien aus der negativen Kontrollplatte aus und fügen Sie sie einer anderen Röhre hinzu, die fünf Milliliter LB-Medien enthält. Wachsen Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung und Schütteln bei 220 Rpm. Nach der Sterilisation der Tischplatte, wie zuvor gezeigt, verwenden Sie ein DNA-Miniprep-Kit, um DNA von 4,5 Milliliter jeder Kultur gemäß den Anweisungen des Herstellers zu isolieren. Dann die DNA mit 35 Mikroliter nukleasefreiem Wasser zu deuten und die resultierende Konzentration per Laborspektrophotometer zu messen. Schließlich bereiten Sie Glycerin-Bestände vor, indem Sie die verbleibenden 0,5 Milliliter beider bakteriellen Lösungen auf 0,5 Milliliter 100% Glycerin aufstocken.

Um die Transduktion zu bestätigen, bereiten Sie zunächst zwei qPCR-Mastermischungen für 24 qPCR-Reaktionen vor. Für den ersten Master-Mix fügen Sie 150 Mikroliter qPCR-Puffermischung in ein Mikrozentrifugenrohr und 12 Mikroliter einer Vorwärts- und Reverse-Primer hinzu, die entwickelt wurden, um das Ampicillin-Resistenzgen zu verstärken. Als nächstes bereiten Sie einen zweiten qPCR-Master-Mix vor, indem Sie 150 Mikroliter qPCR-Master-Mix zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzufügen und dann jeweils 12 Mikroliter einer Vorwärtsgrundierung und einer Reverse Primer hinzufügen, die entwickelt wurden, um ein Housekeeping-Gen zu verstärken.

Kombinieren Sie für jede qPCR-Reaktion 100 Mikrogramm experimentelle DNA aus jeder Reaktion mit 14,5 MikroliterqPCR-Master-Mix. Bereiten Sie nun die verbleibenden Reaktionen vor, wie zuvor gezeigt. Übertragen Sie die Reaktionen auf einen thermocycler vorgewärmt auf 94 Grad Celsius und dann das Programm initiieren. Verwenden Sie schließlich die von qPCR erzeugten Zyklusquantifizierungswerte oder Cq, um die normalisierte Transduktionseffizienz des Ampicillinresistenzgens zu berechnen.

Die Zyklusquantitation oder Cq-Werte für die Gene von Interesse wurden für jede der negativen Kontrollen und transduzierten Proben tabellarisch dargestellt. Niedrige Cq-Werte, in der Regel unter 29 Zyklen, wie die transduced Samples in diesem Beispiel zeigen hohe Mengen der Zielsequenz.

Ein Housekeeping-Gen, das auch hier tabellarisch dargestellt wird, wird als Ladekontrolle verwendet, um die Menge der DNA in jeder Reaktion zu normalisieren und als positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass die qPCR funktioniert. Sofern die gleichen Mengen des Haushaltsgens geladen werden, wird es in jeder Probe relativ gleich schnell gefunden.

Um den Delta-Cq-Wert für jede Probe zu berechnen, subtrahieren Sie den Cq-Wert des Housekeeping-Gens für jede Probe vom Cq-Wert des entsprechenden Zielgens. Der Delta-Cq der ersten Negativkontrolle ist beispielsweise 13.54. Verwenden Sie dann diesen Wert, um die normalisierte Transduktionseffizienz jeder Probe mit der hier gezeigten Formel zu berechnen. Schließlich kann die durchschnittliche normalisierte Transduktionseffizienz für jede Stichprobengruppe berechnet werden.

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