Overview
מקור: פבלו סאנצ'סבוש 2, שון קורקורן2 וקאטיה ברוקנר1,2,3
1 אלי ו אדית המרכז הרחב לרפואת התחדשות וחקר תאי גזע
2 המחלקה לביולוגיה של תאים ורקמות,
3 המכון לחקר הלב וכלי הדם, אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו, סן פרנסיסקו, קליפורניה, ארה"ב
הגברה מהירה של קצות cDNA (RACE) היא טכניקה המאפשרת הגברה של cDNA באורך מלא מ- mRNA על ידי הרחבה עד הקצה 3 ' או 5 ', גם ללא ידע מוקדם של הרצף (Frohman et al., 1988). בניגוד ל-PCR רגיל, הוא משתמש רק בפריימר PCR ספציפי אחד ובפרייימר לא ספציפי שני שיקשור ללא הבחנה לרוב ה- mRNAs. תלוי אם האזור שיש להגביר הוא בקצה 3 ' או 5 ' של mRNA, פריימר השני נבחר לאגד את זנב polyA (3 'סוף) או מקשר סינתטי הוסיף לכל התמלילים (5 'סוף). שילובי פריימר אלה ידועים מניבים "חד צדדי" או "מעוגן" PCR עקב הגברת PCR באמצעות הרצף הידוע של צד אחד- 3' או 5 '(Ohara et al., 1989). הגישה מאפשרת לכידת mRNAs נדירים ספציפיים לגנים שאחרת היה קשה לזהות, למשל בגלל הביטוי הנמוך יחסית שלהם או רצף שלם לא ידוע (Frohman et al., 1988).
RACE מופעל עם שלב שעתוק הפוך (RT) כדי לסנתז DNA חינם נטוש יחיד (cDNA) מ- mRNA. לאחר מכן שני PCRs רצופים המגבירים את שברי cDNA מגן של עניין. כדי לבצע RACE, רצף הגן של עניין חייב להיות ידוע לפחות באופן חלקי, כפי שהוא נחוץ כדי לעצב את פריימרים ספציפיים לגנים (GSPs; פרומן, 1994; ליו וגורובסקי, 1993). כמו זוג פריימר השני הוא פריימר גנרי כי יהיה חישול לכל התמלילים הנוכחים במדגם, הספציפיות של תגובות PCR מופחת. RACE מבוצע באופן אידיאלי עם שני PCRs מקוננים כדי להקטין את הסיכויים להגביר את התעתיקים הלא ספציפיים (איור 1). בהתאם לכיוון ההגברה ביחס ל-GSP, הטכניקה מסווגת כ-5' או 3' RACE (איור 1).
3' RACE (איור 1A) מנצל את זנב הפולי(A) הנמצא ב- mRNAs כאתר איגוד כללי עבור פריימר שאינו ספציפי. זה מפשט את הטכניקה, כמו אפשר לסנתז cDNA באמצעות פריימרים אוליגו (dT). GSPs ממוקמים באזור 5 ' של התעתיקים. גרסה זו RACE מאפשרת זיהוי של גרסאות תעתיק שונים 3 ' UTRs (סקוטו לבינו ואח ', 2007a). במירוץ 5' (איור 1B), GSPs ממוקמים באזור 3 ' של הגן. כדי שתוכל להשתמש בפריימר לא ספציפי המאגד לכל התמלילים, מתאם המשמש כאתר איגוד פריימר כללי מצורף לקצוות RNA של 5 אינץ'. כדי לחבר את המתאם ל- mRNA, יש להסיר את המכסה '5' המגנה על mRNAs מפני exonucleases ומקדם תרגום (Bird et al., 2016). בניגוד ל-3' RACE, מירוץ 5' מסייע במציאת גרסאות דיפרנציאליות של 5' ו-UTRs חלופיים בגודל 5' (Scotto Lavino et al., 2007b).
כאן נבצע RACE 3' כדי לזהות ולבודד גרסאות תעתיק שונות באמצעות רצף 5 ' הידוע (איור 2A) המקודד על ידי הגן Drosophila dSmad2 (Smox). dSmad2, חלבון סמאד זבוב, הוא מתמר חשוב של איתות Activin-β, מסלול של TGF-β superfamily. dSmad2 מסדיר תהליכים תאיים מרובים, כגון התפשטות תאים, אפופטוזיס ובידול (Upadhyay et al., 2017). כמו תמלילים מעורבבים דיפרנציאלי של dSmad2 עשויים להיות פונקציות שונות זבוב הבוגר, צעד ראשון בחקר פונקציות פוטנציאליות אלה היא להעריך את כל וריאנטים תעתיק של dSmad2 בשלב התפתחותי זה.
Procedure
1. ניסוי שהוקם למירוץ 3'
- עצב פריימר ספציפי בגודל 5 אינץ' עבור גן מעניין (פריימר ספציפי לגנים 1, GSP-1). זה חייב להיות מאוד ספציפי, כפי שהוא פריימר היחיד המציג ספציפיות. לכן, פריימר ארוך יחסית יהיה עדיף (אורך אופייני סביב 24 נוקלאוטידים, Tm הנע בין 55-65 מעלות צלזיוס).
- עצב פריימר שני ומקונן (GSP-2), כלומר הפריימר צריך להיות ממוקם 3' של GSP-1. שלב זה הוא אופציונלי, אך ביצוע PCR שני עם פריימר מקונן יגדיל את התשואה והספציפיות של ה- PCR עבור גן העניין. הפריימרים המשמשים להגברת dSmad2 cDNAs מפורטים בטבלה 2.
2. סינתזה של cDNA
- חלץ RNA מדגימות, באמצעות שיטת חילוץ RNA או ערכה בהתאם לפרוטוקול היצרן. לטפל בדגימות עם DNase כדי למנוע הגברה של DNA גנומי. בדוגמה שלנו, חילצנו RNA מעשרה זבובים בוגרים שלמים.
- למדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume ולהתאים עם מים חינם RNase למקסימום של 100 ננוגרם / μl במידת הצורך.
- הכן את cDNA בתגובת תמלול הפוך (RT), באמצעות ערכה מומלצת ל- RACE. הכן תערובת אב, עם ריאגנטים הבאים לכל דגימה:
- 4 μl מאגר תמלול הפוך (5x)
- 2 μl אוליגו (dT)20 פריימר (אוליגו המורכב מ -20 deoxythymidines)
- 10 מיקרול RNA (מקסימום 1 מיקרוגרם)
- 3 μl ddH2O
- 1 μl הפוך תמלול
- סה"כ: 20 מיקרול - לדגור את התגובה במשך 90 דקות ב 42 מעלות צלזיוס. כלול שליטה שלילית השמטת תמלול הפוך.
- לנטרל את התמלול ההפוך על ידי דגירה ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- כדי לדלל את רמות הדנ"א עבור PCR יעיל, הוסף מאגר TE של 80 μl כדי להביא את נפח הנפח הכולל ל- 100 μl.
3. הגברה של שברי CDNA
- הכן את תערובת ההגברה הראשונה של ה- PCR באמצעות פולימראז טאק בעל אמינות גבוהה (HF):
- 4 μl 5x HF Tq פולימראז חוצץ
- 0.4 μl תערובת dNTP (10 מ"מ כל אחד)
- 1 μl GSP1 פריימר (10 מיקרומטר)
- 1 μl Oligo(dT)20 פריימר (10 מיקרומטר)
- תבנית CDNA של 1 מיקרול
- פולימראז DNA טאג'ן HF 0.2 μl
- 12.4 μl ddH2O
- סה"כ: 20 מיקרול - הפעל את ה- PCR באמצעות תוכנית PCR1 (טבלה 1). כלול פקד שלילי המשתמש כתבנית של מוצר ה- RNA המקורי ללא RT. יתר על כן, ניתן לכלול שליטה 'ללא פריימר'.
- אופציונלי: PCR מקונן כדי להגדיל את הספציפיות ואת כמות מוצרי cDNA. לדלל 1 μl של מוצרי PCR ושליטה שלילית 1:20 במאגר TE. השתמש בהם כתבנית עבור תגובות ה- PCR השניות:
- 4 μl 5x HF Tq פולימראז חוצץ
- 0.4 μl תערובת dNTP (10 מ"מ כל אחד)
- 1 μl GSP2 פריימר (10 מיקרומטר)
- 1 μl אוליגו(dT)20 פריימר (10 מיקרומטר)
- תבנית מוצר PCR 1 μl
- פולימראז DNA טאג'ן HF 0.2 μl
- 12.4 μl ddH2O
- סה"כ: 20 מיקרול - הפעלת ה- PCR השני באמצעות תוכנית PCR2 (טבלה 1)
4. בידוד של שברי CDNA
- הכינו ג'ל אגרוז 1-2% עם חיץ TAE, באמצעות אתידיום ברומיד או כתם DNA חלופי.
- לערבב 5 μl של מדגם עם 1 μl של 6x ג'ל טעינה חוצץ.
- לטעון את הדגימות ואת סולם DNA 1kb כסמן ולהפעיל את הג'ל ב 120 V במשך כ 45 דקות או עד חזית הצבע הוא ~ 75% של הדרך במורד הג'ל. ודא שהדגימות לא נגמרות מהג'ל.
- בדוק את רצועות הג'ל מתחת למנורת UV. לעיבוד נוסף של המוצרים, להשתמש UV בעוצמה נמוכה, לאתר את הרצועות המוגברות לחתוך אותם מן הג'ל באמצעות אזמל.
- לטהר את ה- DNA מן הג'ל באמצעות שיטה כמו להקפיא לסחוט או ערכה.
- אחסן את שברי cDNA המטוהרים ב- -20ºC או השתמש בהם באופן מיידי עבור יישומים נוספים, כגון רצף או שיבוט.
בדרך כלל, עם mRNAs חדשני רק חלק מהרצף המלא שלה ידוע. רצפי הנוקלאוטיד החסרים בקצות ה- mRNA ניתנים להקבע באמצעות שיטה מבוססת PCR הנקראת הגברה מהירה של קצות cDNA, או RACE.
באאוקריוטים, mRNAs בוגרים יש תכונות מבניות ייחודיות בשני הקצוות. בקצה של חמישה פריים, לרובם יש שאריות גואנוסין מתילציה המחוברות ל-mRNA באמצעות חיבור טריפוספט של חמישה פריים עד חמישה פריים. זה ידוע גם בשם כובע חמש-פריים. בקצה של שלושה פריים, לרוב האוקריוטים יש זנב של 20 עד 250 שאריות אדנילט, הנקרא זנב פולי(A).
כעת, אם רצף הנוקלאוטידים של אפילו קטע קטן ידוע בכל מקום בתוך ה- mRNA, ניתן להגביר את הרצף עד הקצה המשולש שלו באמצעות פריימר ספציפי לגנים ו בפריימר אוליגו (dT) לא ספציפי המהפנט לזנב הפולי (A) בקצה שלושת הפריים. קבוצת משנה זו של טכניקת RACE נקראת RACE תלת-פריים, והיא מאפשרת זיהוי של גרסאות תעתיק ואזורים שונים של שלושה פריים לא-תימודים, או UTRs.
ניתן להגביר את הרצף בקצה ה-5-15 באופן דומה. כדי לעשות זאת, זנב פולי(A) מחובר תחילה בקצה חמשת הפריים. לאחר מכן, באמצעות פריימר אוליגו(dT) לא ספציפי כי חישול לזנב המצורף פריימר ספציפי לגן, ניתן להגביר את הרצף עד הקצה חמישה פריים. קבוצת משנה זו של RACE ידועה בשם RACE חמישה פריים ומשמשת למציאת גרסאות דיפרנציאליות של חמישה פריים של חברים ו-UTRs חלופיים של חמישה פריים.
כדי לבצע RACE שלושה פריים כדי לזהות תעתיקים שונים המקודדים על ידי גן נתון, RNA מבודד תחילה מן האורגניזם או רקמת עניין. לאחר מכן, cDNA מסונתז מה- mRNAs המבודדים עם תגובת שעתוק הפוכה המשתמשת בפריימר אוליגו (dT) ואנזים תמלול הפוך, המייצר DNA משלים מתבנית RNA. לאחר מכן, מהמאגר שנוצר של cDNAs, הקצה הלא ידוע של cDNA שלושה פריים מורחב באמצעות PCR, תוך שימוש בפריימר אוליגו (dT) לא ספציפי פריימר ספציפי, ומוגבר במהלך תגובת PCR.
עם זאת, בשל האופי הגנרי של פריימר לא ספציפי וניצול שגוי אקראי על ידי פריימר ספציפי לגנים, הם יכולים חישול ל- cDNAs מחוץ למטרה, מה שגורם להם להגביר גם כן. כדי להתגבר על בעיה זו, סיבוב שני של PCR נערך באמצעות פריימרים מקוננים, אשר נקשרים במורד הזרם של הסט הראשון של פריימרים. קבוצה שנייה זו של פריימרים מגבירה עוד יותר את ה- cDNA של עניין אך לא את המוצר הלא ספציפי, ומגבירה את הספציפיות והתשואה של התגובה.
לבסוף, מוצרי PCR מופרדים באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose, אשר מפריד תעתיקים שונים של גן היעד בהתבסס על הגדלים שלהם, לייצר רצועות נפרדות. לאחר מכן ניתן לסלק, לטהר ולבסוף את רצועת העניין כדי להשיג את הרצף המלא של התמליל.
בסרטון זה, אנו להדגים את טכניקת RACE שלושה פריים לזהות ולבודד תמלילים שונים המקודדים על ידי הגן Drosophila dSmad2.
לפני תחילת הסינתזה וההגברה של cDNA, השתמש בתוכנת עיצוב פריימר כדי ליצור פריימר ספציפי חמישה פריים עבור גן העניין, dSmad2 בדוגמה זו. כדי להבטיח את פריימר הוא ספציפי מאוד, זה צריך להיות סביב 24 נוקלאוטידים ויש לי Tm הנע בין 55 ל 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עצב פריימר מקונן שני הממוקם שלושה פריים של הפריימר הראשון, שהוא גם ספציפי עבור רצף היעד.
בתור התחלה, לחלץ RNA מ 10 זבובים בוגרים שלמים עם ערכת מיצוי RNA זמין מסחרית. לאחר ש-RNA מופק, יש להזרים את הכדור ל-20 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז. לתגובה של 50 מיקרוליטר, הוסיפו 5 מיקרוליטרים של מאגר התגובה לכל צינור מדגם, והעלו את נפח התגובה על ידי הוספת 24 מיקרוליטרים של מים ללא נוקלאז. לאחר מכן, הוסף 1 מיקרוליטר של DNase I כדי למנוע הגברה של DNA גנומי. לבסוף, לדגור על הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
לאחר טיפול DNase, לנטרל את האנזים עם 1 microliter של EDTA 25 מילימולר בכל אחד הצינורות. הוסף את הדוגמה לעמודת סיבוב כדי לטהר את ה- RNA. לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-וולטום כדי למדוד את ריכוז הרנ"א. התאם את הריכוז ל-100 ננוגרם למיקרוליטר על-ידי הוספת מים ללא נוקלאז.
עכשיו, להכין תערובת מאסטר לתגובת שעתוק הפוך. בנוסף לדגימות הדנ"א של הבדיקה, כלול שליטה שלילית אחת על ידי השמטת תמלול הפוך מהצינור המתאים. לדגור על התגובות במשך 90 דקות ב 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לנטרל את התמלול ההפוך על ידי דגירה הצינורות ב 85 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, לדלל את רמות ה- DNA על ידי הוספת 80 microliters של מאגר TE לכל צינור כדי להביא את סך התגובה ל 100 microliters.
עכשיו כשה-CDNA מסונתז, להגביר את גן העניין באמצעות פי.סי.אר. כדי לעשות זאת, ראשית להכין את הסיבוב הראשון הגברה תערובת PCR. בנוסף לתבנית cDNA, כלול תגובת בקרה שלילית המשתמשת בתבנית מהמוצר שאינו מתמלל לאחור, וכן תגובה שאין לה פריימר ספציפי לגנים כפקד ללא פריימר.
לאחר התגובות מוכנות, לבצע הגברות PCR תרמוציקלר מצויד מכסה מחומם. לאחר מכן, לדלל את המוצרים 1 עד 20 על-ידי הוספת מיקרו-ליטר אחד של מוצרי PCR ל- 19 מיקרוליטרים של מאגר TE. באמצעות מוצרים מדוללים אלה, להכין את הסיבוב השני הגברה פי.סי.אר לערבב. לאחר מכן, השתמש בתרמו-מחזור כדי להפעיל את ה- PCR השני.
כדי לבודד את שברי PCR, להכין ג'ל אגרוז 1% על ידי הוספת 1 גרם של אגרוז לכל 100 מיליליטר של מאגר TAE. ממיסים את התערובת במשך שתי דקות במיקרוגל, ולאחר מכן מוסיפים כתם בטוח SYBR או אתידיום ברומיד. יוצקים את התערובת המותכת במגש ג'ל ומאפשרים לה להקבע.
בזמן שהג'ל מוגדר, טיפות מיקרוליטר פיפטה 1 של צבע טעינה 6X על פיסת parafilm המתאים למספר הדגימות. מוסיפים 5 מיקרוליטרים של דגימה לכל טיפה. עכשיו, לטעון את הדגימות, יחד עם סולם DNA 1 קילו-בסיס, על הג'ל. הפעל את הג'ל ב 120 וולט במשך כ 45 דקות או עד חזית הצבע הוא 75% של הדרך במורד הג'ל.
לאחר שהג'ל סיים לרוץ, בדוק את רצועות הג'ל מתחת לטרנזילומינטור UV. אתר את הרצועות וחתוך אותם באמצעות אזמל. טהר את מקטעי cDNA באמצעות ערכת טור ספין זמינה מסחרית. לאחר טיהור, שברי cDNA ניתן לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס או לשמש מיד לניתוח נוסף.
לפני ניסוי זה, שני תמלילים עבור Drosophila dSmad2 היו ביאורים במסד הנתונים הגנומי Drosophila, FlyBase. בהתבסס על ההשתתפות הצפויה של גן זה, שני מוצרים צריכים להיות מזוהים על ידי פרוטוקול RACE שלושה פריים.
התוצאות מניסוי זה, לעומת זאת, חושפות שלושה תמלילים שונים עבור dSmad2. בין המוצרים החזויים, תעתיק אחד הוא שלומי, ואחד בא לידי ביטוי ברמה נמוכה יותר. בנוסף, זוהה מוצר קטן יותר שלא נרשם בעבר, הנראה ב-750 זוגות בסיסים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
ישנם שני תמלילים מובאים עבור Drosophila dSmad2 ב FlyBase (איור 2A). התוצאות שלנו, לעומת זאת, לחשוף שלושה תמלילים שונים עבור dSmad2, החל בגודל בין 750 bp ל 1400 bp (איור 2B). הבדלים בעוצמת הרצועות מצביעים על רמות הביטוי היחסיות שלהן. בין המוצרים החזויים, תעתיק אחד הוא שלם (איור 2B, חץ שחור א), ואחד בא לידי ביטוי ברמה נמוכה יותר (איור 2B, חץ שחור B). בנוסף, זוהה מוצר קטן יותר שלא נרשם קודם לכן (איור 2B, חץ אפור C).
זיהוי של תמלילים נדירים כאלה אפשרי רק בשיטה רגישה כגון RACE. לאחר RACE, ניתן לשכפל את השברים שהושגו על ידי PCR כדי ללמוד את רצף התמלילים, למצוא את הדמיון שלו עם גרסאות תעתיק אחרות ולשכפל אותו לטרנסגנזה. ניסויים כאלה מסייעים לחקור את הפונקציות של וריאנטים תעתיק ספציפיים לרקמה או לשלב התפתחותי.
איור 1. שרטוטים של שתי הגישות השונות של RACE. א) מירוץ 3'. cDNA מסונתז באמצעות פריימרים אוליגו (dT). אותו פריימר אוליגו (dT) משמש בשילוב עם פריימר ספציפי לגנים בגודל 5' כדי להגביר את קצוות cDNA בגודל 3' באמצעות סבב אחד, או טוב יותר, של PCR. ב) מירוץ 5'. RNA הוא decapped הראשון כדי לשחרר את הקצה 5 '. בשלב שני, רצף RNA של מתאם נוסף לסוף 5 '. cDNA נוצר באמצעות פריימר משלים לרצף המתאם. אותו פריימר משמש בשילוב עם פריימר/s ספציפיים לגנים 3' כדי להגביר את ה- cDNA.
איור 2. A) RACE מאפשר הגברה של מספר תמלילים מאותו גן, המודגמים על ידי 3 ' RACE של Drosophila dSmad2. שילוב של פריימר לא ספציפי (Oligo dT) עם פריימר ספציפי לגנים (GSP) מניב cDNAs באורכים שונים (מוצר A, מוצר B) המתאימים לתעתיקים משולבים לחילופין (mRNA A, mRNA B). B) הפרדת מוצרי PCR של dSmad2 3' RACE על ג'ל אגרוז 1%. הנתיבים תואמים ל-(1) סולם DNA של 1 kb כסמן, (2) ללא בקרה שלילית של RT (מכילה RNA ו- primers), (3) ללא בקרה שלילית של פריימרים (מכיל תבנית cDNA) (4) תגובה מלאה של Race 3' עבור dSmad2 (מכיל. פריימרים ותבנית cDNA). הגברה של תמלילי dSmad2 על ידי 3' RACE מניב שלושה מוצרים נפרדים (חצים). שני cDNAs היו בגדלים חזויים סביב 1400 ו 1200bp (חצים שחורים A ו- B, המקבילים למוצר A ו- B ב (A)). בנוסף, זוהה cDNA קטן יותר שלא נרשם בעבר של ~ 750bp (חץ אפור, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
RACE מספק כלי מהיר, זול ורב עוצמה להשגת cDNAs מרצפים הידועים רק באופן חלקי, או מתעתיקים נדירים שאחרת קשה יותר להגביר. זה יכול לשמש גם כדי למצוא את רצף של תעתיקים לא ידועים מתוך גן ידוע כבר או לשכפל תמלילים כאלה למחקרים נוספים. בעקבות RACE, תמלילים כאלה יכולים להתבטא יתר על המידה במערכות מבוססות תאים או אורגניזמים מודל לחקור את תפקידם ב vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע # IOS-13552222 ומכוני הבריאות הלאומיים # 1R01GM112083 ו- 1R01GM131094 (ל- K.B.).
References
- Bird, J.G., Zhang, Y., Tian, Y., Panova, N., Barvík, I., Greene, L., Liu, M., Buckley, B., Krásný, L., Lee, J.K., et al. (2016). The mechanism of RNA 5′ capping with NAD+, NADH and desphospho-CoA. Nature 535, 444–447.
- Frohman, M.A. (1994). On beyond classic RACE (rapid amplification of cDNA ends). PCR Methods Appl. 4, S40–S58.
- Frohman, M.A., Dush, M.K., and Martin, G.R. (1988). Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.a. 85, 8998–9002.
- Liu, X., and Gorovsky, M.A. (1993). Mapping the 5′ and 3′ ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE). Nucleic Acids Res. 21, 4954–4960.
- Ohara, O., Dorit, R.L., and Gilbert, W. (1989). One-sided polymerase chain reaction: the amplification of cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5673–5677.
- Scotto Lavino, E., Du, G., and Frohman, M.A. (2007a). 3′ End cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1, 2742–2745.
- Scotto Lavino, E., Du, G., and Frohman, M.A. (2007b). 5′ end cDNA amplification using classic RACE. Nat Protoc 1, 2555–2562.
- Upadhyay, A., Moss-Taylor, L., Kim, M.-J., Ghosh, A.C., and O’Connor, M.B. (2017). TGF-β Family Signaling in Drosophila. Cold Spring Harb Perspect Biol 9, a022152.
