Флуоресцентная маркировка Drosophila Структур сердца

Здравствуйте, меня зовут Никита Ари из лаборатории Ральфа Бура по программе «Развитие и старение» в Институте медицинских исследований Бернхема. Я Гиллер, тоже из нижней лаборатории. Сегодня мы покажем вам процедуры флуоресцентного мечения структур сердца Лаваля и взрослых пресолнечных структур сердца.

Мы используем эту процедуру в лаборатории для подготовки сердечных трубок к морфологическому и структурному анализу с помощью конфокальной или флуоресцентной микроскопии с целью флуоресцентного мечения структур сердца у взрослых дрозофил. Во-первых, сделайте один разрез между грудной клеткой и брюшной полостью у полунеповрежденного взрослого человека, чтобы отделить сегменты тела. Затем обрежьте нависающие брюшные края взрослой кутикулы.

Затем перенесите и пометьте взрослые особи или препарированные личинки первичными и вторичными антителами. После маркировки нанесите промытые взрослые экземпляры, придерживая края кутикулы и положив их сердцевиной вниз на каплю векторного щита на покровном листе, переверните покровное стекло на каплю среднего цвета, окруженное двумя покровными листами на предметном стекле, чтобы сформировать мост. Теперь сердца подвешены вертикально для установки личиночных сердец.

Перенесите образцы на предметное стекло подфюзеляжными сторонами вниз, установите два защитных стекла с каждой стороны предметного стекла. Наконец, сформируйте перемычку с помощью третьего покровного листка, поместив его сначала на покровный лист возле задних концов личинок. Теперь сердца готовы к визуализации.

Перед началом этой процедуры приготовьте следующий расслабляющий буфер A DH, содержащий A DH, как описано в другом видеопротоколе этой серии, с 10 миллимолярным фиксатором EGTA, состоящим из 4% формальдегида в одном X-P-B-S-P-B-S, TX, и соответствующим образом разведенными первичными антителами и флуоресцентно меченными вторичными антителами. В PBS TX препарируйте взрослую и личинку дрозофилы, чтобы обнажить сердечные трубки, следуя полуинтактному препарату сердца дрозофилы, показанному в видеопротоколах, визуализирующих бьющееся сердце у дрозофилы и личинки дрозофилы. Но с модификациями используйте насыщенный кислородом DH во время вскрытия личинки и немного сместите задние штифты от вентральной средней линии.

Разрежьте по вентральной средней линии. Не удаляйте ткани перед фиксацией в следующих этапах. Начните процедуру маркировки с проверки под микроскопом, что все сердца ритмично сокращаются и расслабляются в насыщенном кислородом А ДГ. Затем быстро замените DH на расслабляющий буфер и повторно осмотрите каждую сердечную трубку, чтобы убедиться, что сокращения подавлены.

Приступайте к исправлению сердец, заменив расслабляющий буфер на фиксирующий. Выдерживать при комнатной температуре в течение 20 минут с легким встряхиванием. Обратите внимание, что для личиночных препаратов встряхивание не является необходимым ни на каком этапе и может даже нанести вред целостности сердечной ткани.

По истечении 20 минут снимите фиксатор и промойте образцы три раза в течение 10 минут каждый раз с помощью P-B-S-T-X. При комнатной температуре при непрерывном встряхивании для взрослых сделайте один разрез между животом и грудной клеткой аккуратно и чисто. Разделите оба сегмента тела, чтобы обеспечить минимальное повреждение передней области сердца.

Будьте осторожны, чтобы не разрезать передний отдел брюшной полости, где находится коническая камера сердца. Рассмотрите образец под микроскопом, чтобы убедиться, что был сделан чистый разрез. Затем тщательно обрежьте все нависающие брюшные края кутикулы живота, чтобы то, что осталось, было более эллиптическим и менее круглым.

Для личиночных сердец с помощью тонких щипцов аккуратно удалите жировое тело. Выполняйте это с особой осторожностью. Поскольку сердце личинки особенно хрупкое и имеет очень слабую поддержку со стороны других мышц или соединительной ткани, не удаляйте ветви трахеи, так как это может повредить сердце.

Далее инкубируют с первичным антителом, которое разводят в PVS TX и дозируют по 50 микролитров на лунку 96-луночного планшета. Взрослым мухам следует провести обрезанную тыльную кутикулу за края, не касаясь центрально расположенной сердечной трубки, и перенести на пластину. Поместите не более 12 экземпляров в лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов при непрерывном перемешивании.

Держите образцы личинок за край с помощью щипцов и перенесите в P-B-S-T-X заполненными. Ну и опять же, не стоит встряхивать личинки экземпляров в конце инкубации. Удалите первичный раствор антитела.

Промойте сердца три раза в течение 10 минут каждый раз 100 микролитрами P-B-S-T-X комнатной температуры после последнего промывания на 100 микролитры вторичного антитела в PBS tx с добавлением Alexa 5 9 4 Phin. Держите образцы под крышкой, чтобы предотвратить обесцвечивание флюоро-4, и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Удалите вторичный раствор антител и промойте сердца три раза в течение 10 минут каждый раз 100 микролитрами P-B-S-T-X комнатной температуры.

Наконец, удалите TRITTON X 100, прополоскав сердца в 100 микролитрах PBS в течение 10 минут. Образцы можно хранить в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких дней перед установкой. Во-первых, подготовьте слайд к монтажу.

Нанесите на микроскоп три равномерно расположенные по 10 мкл капли векторной защитной среды. Поместите две крышки размером 18 на 18 миллиметров на внешние капли, удерживая крышки на расстоянии от 10 до 15 миллиметров друг от друга.

Кроме того, поместите 20 микролитров векторного щита в центр третьего покровного стекла. Далее придерживайте рассеченную взрослую муху за крайние края кутикулы. Чтобы аккуратно извлечь его из моющего раствора ПВС, аккуратно положите его сердцем вниз на каплю монтажного средства на третьем покровном листе не более пяти сердечек на каплю на покровном листе.

После помещения сердечек на каплю, которая находится на крышке, проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что все сердечки обращены вниз. Теперь осторожно переверните защитный листок с сердечками и быстро поместите его на предметное стекло, удерживающее пару защитных стеблей, таким образом, чтобы капля перевернутого покровного стекла, содержащего сердечные трубки, слилась с каплей векторного щита, лежащей в пространстве между защитными стеклами. Соедините таким образом, три покровных листка образуют мост.

Сердца будут подвешены между средней крышкой и микроскопом. Проведите под мостом проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что сердца взрослых мух теперь обращены вверх с помощью лака для ногтей. Зафиксируйте покровные стекла по их краям.

Теперь сердца готовы к визуализации с помощью флуоресцентной или конфокальной микроскопии. Чтобы установить сердечки личинок, поместите каплю объемом около 20 микролитров BTA shield на предметное стекло микроскопа с помощью тонких щипцов. Обхватите личинки по краям кутикулы и аккуратно перенесите ее в каплю.

Ориентируйте личинок спинной стороной вниз с помощью вольфрамовых игл. Размещайте на одной горке до двух личинок. Далее вытащите каждый экземпляр из монтажной среды и выровняйте личинки параллельно.

С каждой стороны выровненных сердец с помощью щипцов наденьте чехол-лист. Сначала положите третью крышку сверху, положив одну сторону на переднюю крышку и опустив ее вниз к задней крышке. Таким образом, образуя мост.

Капиллярные силы вызывают поток векторного щита сзади вперед, что способствует правильному выравниванию сердца личинки. Наконец, зафиксируйте все покровные листы на месте по краям лаком для ногтей и тщательно заполните пространство между покровными листами 20-30 микролитрами векторного защитного пломба лаком для ногтей и храните при температуре четыре градуса Цельсия для кратковременного хранения или при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение более длительного периода времени. При правильном выполнении все компоненты и связанные с ними ткани дорсального сосуда должны оставаться неповрежденными и легко визуализироваться.

Фоновая флуоресценция должна быть минимальной для взрослых. Вентральный продольный мышечный слой очень хорошо окрашивается и выдает существенный сигнал. Однако лежащие в основе кольцевые кардиомиоциты, как правило, не производят такой интенсивный сигнал, как тот, который исходит из вышележащего вентрального слоя.

Миоциты передней конической камеры взрослого сердца содержат значительное количество сократительного материала, и, следовательно, эта область представляется наиболее прочной по отношению к остальной части сердечной трубки. На изображении сердца личинки видно спиралевидное миофибриллярное расположение. Как и в случае с сократительными кардиомиоцитами взрослого человека, мы только что показали ваш протокол подготовки и окрашивания овулярных сердец для флуоресцентной и конфокальной микроскопии.

При выполнении этой процедуры важно не забывать ограничивать любое ненужное обращение. Это обеспечит более неповрежденную и сохранную структуру сердца. Этот протокол служит только отправной точкой.

Как и любая другая иммуногистохимия, разные антитела требуют разных условий и должны быть оптимизированы индивидуально. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи с окрашиванием.