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JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

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Preparazione del raccordo larvale

 
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Preparazione del raccordo larvale: un metodo per visualizzare i neuroni sensoriali intatti e le cellule epidermiche associate

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- Per orientare una larva per la dissezione del filetto, posizionarla in un piatto rivestito di silicone contenente salina fredda e identificarne i lati dorsale e ventrale. I tubi tracheali che corrono lungo la sua lunghezza segnano il lato dorsale, mentre le cinture denticolari addominali identificano il lato ventrale.

Quindi, con il lato ventrale verso l'alto, allungare delicatamente la larva e appuntare ogni estremità fino al fondo del piatto. Questa posizione manterrà intatti gli ammassi dorsali dei neuroni multidedritici sensoriali e le cellule epidermiche associate man mano che la dissezione procede.

Utilizzare le forbici sezionanti per tagliare lungo la linea mediana ventrale della larva. Fissare la cuticola al piatto per appiattire la preparazione e rimuovere le strutture interne per rivelare il tessuto muscolare sottostante. Quindi rimuovere con cura il muscolo appropriato per esporre l'epidermide e ottenere l'accesso a neuroni precedentemente oscurati preservandone la morfologia dendritica.

Nel protocollo di esempio, vedremo una dimostrazione dettagliata della preparazione del filetto larvale e della rimozione muscolare per visualizzare i neuroni sensoriali e le cellule epidermiche.

- Per iniziare, aggiungere abbastanza salina fredda a una piastra di elastomero siliconico per coprire la superficie inferiore. Aggiungere la larva del soggetto al piatto e posizionarla al microscopio stereo, garantendo un corretto posizionamento della luce. Posizionare la larva con il lato ventrale verso l'alto, che può essere identificato dalle cinture denticolari addominali.

Allungare la larva nella direzione anteriore-posteriore e, utilizzando spille per insetti, fissare la testa e la coda sul fondo del piatto. Con un paio di forbici di sezionamento fine, tagliare lungo la linea mediana ventrale della larva da un'estremità all'altra. Stendere la larva aperta e fissare il tessuto della cuticola ai quattro angoli in modo che giace piatto.

Usando le pin, rimuovere gli organi interni, tra cui il SNC, l'intestino e la trachea. Regolare i perni degli insetti in modo che il filetto sia teso, ma non allungato al massimo.

Individuare la linea mediana dorsale della larva, dove il tessuto muscolare è assente e quindi posizionare una pinga che sporge all'interno di questo confine. Far scorrere il prong tra il muscolo e l'epidermide, facendo attenzione a ridurre al minimo il contatto con l'epidermide.

- Per ridurre al minimo i danni all'epidermide, sezionare con le più piatte prong possibili. E provare a sezionare in soluzione salina contenente calcio. Ciò potrebbe aiutare a creare spazio tra il muscolo e l'epidermide.

- Quindi, tirare le forcep verso l'alto per rompere l'attacco del muscolo alla parete del corpo in un punto di ancoraggio. Ripetere questo processo per i restanti segmenti muscolari di interesse.

Riregolare le penne degli insetti per allungare al massimo il filetto larvale in tutte le direzioni.

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