Ensaio do fatoômetro de quatro vias: um método para avaliar respostas odorant-cued em Drosophila

- Um olfactômetro de quatro vias é uma câmara fechada com portas de mão única em cada canto, através do qual pode entregar até quatro odores, criando quadrantes com perfis de odor distintos. Inicie um experimento transferindo moscas acordadas para a câmara. Evite anestesia, pois isso pode afetar seu comportamento durante o experimento.

Exponha as moscas ao ar limpo e observe seus movimentos para garantir que nenhum odor esteja contaminando o olfactômetro e afetando o comportamento da mosca. Em seguida, prepare os odores de teste em frascos separados e conecte-os à câmara principal através das portas de mão única. Exponha as moscas aos odores por um período pré-definido, removendo o estímulo após o término do julgamento.

Moscas tendem a evitar quadrantes com odores repelentes enquanto se movem em direção e se instalam em quadrantes com odores atraentes. Meça as respostas comportamentais odor-cued das moscas, rastreando suas posições ao longo do tempo enquanto exploram o olfactômetro.

No protocolo a seguir, usaremos um olfactômetro de quatro quadrantes com um sistema de entrega de ar para analisar o comportamento da mosca em resposta ao propionato etílico, um odorante repelente e vinagre de cidra de maçã, que é atraente.

- Com pelo menos cinco minutos de antecedência, ligue o controlador de temperatura e coloque-o a 25 graus Celsius. Em seguida, conecte as câmaras de odor à arena através de um tubo de plástico. Verifique a taxa de fluxo de ar em cada quadrante da arena usando um medidor de fluxo eletrônico. Certifique-se de que o controle e o odor e as correntes de ar estão funcionando a 100 mililitros por minuto.

- As moscas são muito sensíveis ao fluxo de ar, e é fundamental que o fluxo de ar para cada quadrante seja verificado antes de cada experimento.

- Agora, limpe a arena e as placas de vidro usando 70% de etanol. Limpe todas as peças duas a três vezes e deixe-as secar totalmente antes de prosseguir. Em seguida, aperte as placas de vidro para a arena.

Agora, coloque a arena carregada de moscas na câmara apertada.

Após o período de aclimatação, execute um experimento de controle de 5 a 10 minutos em que as moscas são expostas a quatro correntes de ar de controle.

- É fundamental testar o comportamento das moscas de controle para apenas limpar o ar. Isso verificará rapidamente que todas as condições de fundo são normais.

- Se necessário, descarte as moscas e limpe a arena novamente. Substitua todos os tubos. Continue repetindo o teste de controle com novas coortes até que os animais não mostrem preferência por nenhum dos quatro quadrantes. Em seguida, conecte a câmara de odorante de teste à configuração usando uma válvula de três vias, ou reconecte o tubo e execute um experimento de teste por 5 a 10 minutos. Para gravações experimentais mais longas, pare e reinicie rapidamente o programa de rastreamento a cada 20 minutos, ou os arquivos de dados serão muito grandes.

Entre os testes, descarte as moscas, limpe a arena e as placas de vidro com 70% de etanol, e substitua os tubos do conector. Mantenha o fluxo de ar seco indo para lavar continuamente o sistema. Para eficiência, é bom ter duas arenas para que a limpeza possa ser feita durante as corridas.

- Se vários experimentos forem executados no mesmo dia, prestem extrema cuidado para garantir que nenhum odor seja deixado no sistema de uma corrida anterior. Este normalmente não é um problema com baixas concentrações de odor ou com CO2. Mas para estímulos altamente concentrados, até uma diferença de 24 horas entre as corridas de experimentos pode ser necessária.