Drosophila Aktivitätsmonitor (DAM): Eine Methode zur Messung der Bewegungsaktivität bei Fliegen

- Der Drosophila Activity Monitor, kurz DAM, hält zentrierte Aktivitätsröhren, die mit Fliegenfutter an einem Ende und einem luftdurchlässigen näher am anderen Ende ausgestattet sind. Dieses Setup beherbergt einzelne Fliegen während experimentiervierter oder sogar wochenlanger Experimente.

Platzieren Sie den DAM in einer kontrollierten Umgebung wie einem Inkubator mit eingestellter Temperatur, Feuchtigkeit und Lichtzyklus. Führen Sie das Experiment in einem dunklen Raum durch und verwenden Sie bei Bedarf eine Infrarotlichtquelle, um das Gerät zu handhaben, das im Gegensatz zu hellem Licht das zirkadiane System der Fliege nicht beeinflusst.

Um die Aktivität des Bewegungsapparates aufzuzeichnen, schließen Sie das Gerät an ein Computersystem an, das die Messwerte der DAM-Detektoren speichert. Die Elektronik des DAM erkennt kontinuierlich die Integrität eines Infrarotstrahls, der durch den Mittelpunkt jeder Röhre emittiert wird, und lädt regelmäßig Daten in das Computersystem hoch.

Wenn die Fliege innerhalb der Röhre hin und her geht, kreuzt sie den Infrarotstrahl. Diese Unterbrechungen werden vom DAM im Laufe der Zeit für jede Röhre gezählt und dienen als Maß für die Flugaktivität.

Im folgenden Protokoll werden wir das DAM-System verwenden, um zirkadiane Rhythmen bei Erwachsenen von Drosophila zu studieren.

- Schalten Sie vor dem Laden von Fliegen in Aktivitätsrohre die Inkubatoren ein, die für die Unterbringung der Aktivitätsmonitore verwendet werden. Passen Sie die Temperatur mit den Inkubatorsteuerungen an und stellen Sie das Licht-Dunkel-Regime mit dem Lichtregler des DAM-Systems oder dem eigenen Lichtsteuerungssystem des Inkubators entsprechend dem gewünschten experimentellen Design ein.

Als nächstes befeuchten Sie die Fliegen mit Kohlendioxid. Dann, mit einem feinen Pinsel, sanft eine einzelne Fliege in ein Aktivitätsrohr übertragen. Schnappen Sie sich die Mitte eines einzelnen Stücks Garn, das etwa einen halben Zoll mit feinem Zangen ist, und legen Sie das Garn in das Non-Food-Ende des Aktivitätsrohrs, um die Öffnung zu stopfen und zu verhindern, dass die Fliege während des Experiments entweicht, während sie gleichzeitig Luftstrom in das Rohr ermöglicht.

Halten Sie das Rohr auf der Seite, bis die Fliege erwacht, um zu verhindern, dass die Fliege an der Nahrung hängen bleibt. Legen Sie die Rohre in die Aktivitätsmonitore. Mit dem neueren, kompakteren Modell der TriKinetics Monitore ist es notwendig, die Rohre mit Gummibändern an Ort und Stelle zu halten, um sicherzustellen, dass der Infrarotstrahl das Rohr in der Mittleren Position passiert.

Schließlich legen Sie die Aktivitätsmonitore in die Inkubatoren und schließen Sie sie über die Telefondrähte an das Datenerfassungssystem an. Überprüfen Sie mit der SYSTEMerfassungssoftware DAM, ob alle Monitore richtig angeschlossen sind und dass von jedem von ihnen Daten gesammelt werden.

Nachdem die Fliegen in die Aktivitätsrohre geladen wurden und das Bewegungsaktivitätsüberwachungssystem fertig ist, können die Daten nun aufgezeichnet werden. Fliegen werden synchronisiert und eingespannt, indem sie für zwei bis fünf volle Tage dem gewünschten Licht/Dunkel oder LD und dem Temperaturregime aussetzen.

Für die Untersuchung von zirkadianen Rhythmen relativ zu diesem Protokoll ist die Zeit, in der die Lichter im Inkubator angehen, definiert als Zeitgeberzeit 0 und alle anderen Zeiten sind relativ zu diesem Wert. Unter Standard 12:12 LD Bedingungen weist der wilde Typ Drosophila melanogaster typischerweise zwei Anfälle von Aktivität aus; einer zentriert um ZT0, der als Morgenspitze bezeichnet wird, und ein anderer um ZT12, der als Abendgipfel bezeichnet wird.

Freilaufende Bewegungsrhythmusrhythmen werden unter konstanten Dunkel- und Temperaturbedingungen nach der Einschulungszeit gemessen. Die Einstellung für den Lichtzyklus kann jederzeit in der dunklen Phase am letzten Tag der LD geändert werden, so dass der folgende Tag des Experiments den ersten Tag der DD darstellt. Sieben Tage DD-Datenerfassung reichen aus, um die zirkadiane Periode und Amplitude oder Rhythmusstärke der Fliegen zu berechnen.

Im Allgemeinen ist eine Stichprobengröße von mindestens 16 Fliegen notwendig, um zuverlässige Freilaufzeiten für einen bestimmten Genotyp zu erhalten. Am Ende des Experiments werden mit der DAM-Systemsoftware gesammelte Binärdaten auf ein tragbares Datenspeichergerät, z.B. einen USB-Stick, heruntergeladen.

Die binären Rohdaten werden mit DAM Filescan102X verarbeitet und bei der Analyse zirkadianer Parameter in 15 und 30 Minuten oder bei der Analyse von Schlaf-/Ruheparametern in 15- und 30-Minuten-Abschnitte zusammengefasst.