Microiniezione di gonadi: un metodo di somministrazione di composti direttamente nella linea germinale di C. elegans

- Per prepararsi all'iniezione, utilizzare un piccone a vite senza fine per stendere una traccia di olio di alocarburi su un tampone di agarosio. Metti i vermi nell'olio e immobilizzali spingendoli delicatamente sul tampone di agar. Assicurarsi che l'olio copra completamente gli animali. Permette all'ossigeno di raggiungere i vermi prevenendo l'essiccazione. Quindi, posizionare il tampone di agarosio su un microscopio per iniezione e posizionare l'ago perpendicolarmente al verme, mirando all'estremità distale di un braccio della gonade.

Spingi delicatamente l'ago attraverso la cuticola e inietta il braccio della gonade con l'acido nucleico o il composto di interesse. Ogni braccio della gonade contiene un sincizio germinale che si svilupperà in singoli ovociti. Il materiale iniettato nella gonade distale sarà incorporato in quegli ovociti e influenzerà la generazione successiva.

Dopo aver iniettato le viti senza fine, sostituire l'olio con un tampone M9. Una volta che i vermi iniziano a muoversi, trasferiscili su una piastra di agar NGM con cibo batterico. Nel seguente protocollo, il metodo di microiniezione delle gonadi viene utilizzato per fornire un complesso Cas9 per mirare e modificare il gene dpy-10.

- Iniziare con la preparazione di C. elegans e pastiglie di agarosio come descritto nel protocollo del testo. Posizionare un tampone per iniezione di agarosio e un vetrino coprioggetto su un cannocchiale di dissezione. Usa un piccone a vite senza fine per stendere una piccola traccia di olio alocarbonico lungo un bordo del pad. Quindi, utilizzare il plettro a vite senza fine rivestito di olio per sollevare diversi vermi dalla piastra di agar NG e nella traccia dell'olio. Con un pelo sottile attaccato a una pipetta, come una ciglia o un baffo di gatto, posiziona i vermi in parallelo spingendo delicatamente i vermi nel tampone di agarosio. Fino a quando non si è a proprio agio con la procedura di microiniezione, montare e iniettare solo un verme alla volta.

Una volta in posizione e attaccati al tampone, sovrapponi i vermi con altre gocce di olio alocarbonico dalla punta del piccone. Posizionare il vetrino coprioggetti con i vermi montati sul microscopio per iniezione. A basso ingrandimento, posizionare i vermi perpendicolarmente all'ago per iniezione, che è stato riempito con la soluzione di RNP, come descritto nel protocollo di testo.

Passare a un ingrandimento elevato e riposizionare l'ago adiacente al braccio della gonade, corrispondente alla regione vicino ai nuclei nel pachitene medio-tardivo. Usando il micromanipolatore, muovi l'ago contro il verme, premendo leggermente la cuticola. Quindi, con una mano, picchiettare il lato del tavolino del microscopio per far oscillare l'ago attraverso la cuticola. Premere il pedale o il pulsante dell'iniezione, riempire lentamente il braccio delle gonadi con la miscela per iniezione e rimuovere l'ago. Ripetere il passaggio con l'altro braccio della gonade.

Una volta iniettati i vermi, rimuovere il vetrino coprioggetti nel tampone di agarosio e metterlo sotto un microscopio da dissezione. Utilizzando una pipetta capillare tirata, spostare l'olio dai vermi pipettando su di essi un tampone M9. Eseguire questo trattamento per liberare i vermi dall'agar. Dopo 10 minuti, quando i vermi si dimenano nel tampone, spostarli su una piastra di agar NG con batteri OP50 utilizzando la pipetta capillare tirata. Posizionare il piatto a 20 gradi Celsius per due o tre ore fino a quando i vermi si sono ripresi e si muovono. Una volta recuperati, trasferire singolarmente i vermi su piastre di agar NG con OP50 Quindi, trasferire le piastre in un incubatore a 25 gradi Celsius.