Microinyección de Gonad: Un método de entrega compuesta directamente en la línea germinosa de C. elegans

- Para prepararse para la inyección, utilizar una selección de gusanos para colocar una pista de aceite de halocarbono en una almohadilla de agarose. Coloque los gusanos en el aceite e inmovilizarlos empujándolos suavemente sobre la almohadilla del agar. Asegúrese de que el aceite cubra completamente a los animales. Permite que el oxígeno llegue a los gusanosmientras evita la desecación. 

Empuje suavemente la aguja a través de la cutícula e inyecte el brazo de la gónada con el ácido nucleico o compuesto de interés. Cada brazo gonad contiene un sínctio de línea germinal que se desarrollará en ocitos individuales.

Después de inyectar gusanos, reemplace el aceite con amortiguador M9. Una vez que los gusanos comiencen a moverse, transfiérelos a una placa de agar NGM con alimentos bacterianos. En el siguiente protocolo, el método de microinyección de gónadas se utiliza para entregar un complejo Cas9 para atacar y editar el gen dpy-10.

- Comience con la preparación de C. elegans y almohadillas de agarose como se describe en el protocolo de texto. Utilice una selección de gusanos para colocar una pequeña pista de aceite de halocarbono a lo largo de un borde de la almohadilla. montar e inyectar un gusano a la vez.

Una vez en posición y unido a la almohadilla, superponga los gusanos con otras gotas de aceite de halocarbono de la punta de la selección del gusano. Coloque el resbalón de la cubierta con los gusanos montados en el microscopio de inyección. Bajo una baja ampliación, coloque los gusanos perpendiculares a la aguja de inyección, que se ha llenado con la solución RNP, como se describe en el protocolo de texto.

Cambie a una ampliación alta y vuelva a colocar la aguja adyacente al brazo gonad, Correspondiente a la región cercana a los núcleos en paquiteno medio a tardío. Usando el micromanipulador, mueva la aguja contra el gusano, deprimiendo ligeramente la cutícula. Luego, con una mano, toque el lado de la etapa del microscopio para sacudir la aguja a través de la cutícula. Deprima el pedal de inyección o el botón, llene lentamente el brazo de la gónada con la mezcla de inyección, y retire la aguja.

Una vez inyectados los gusanos, retire el control de cubiertas en la almohadilla de agarose y colóquelo bajo un microscopio diseccionador. Realice este tratamiento para liberar los gusanos del agar. Después de 10 minutos, cuando los gusanos estén golpeando alrededor en el amortiguador, muévalos a una placa de agar NG con bacterias OP50 usando la pipeta capilar extraída. placas de agar con OP50 Entonces, transfiera las placas a una incubadora de 25 grados Celsius.