Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Per iniziare, posizionare cinque larve in ogni corsia di una piastra di agarosio a sei corsie. Aggiungere acqua aggiuntiva all'uovo, ma non riempire esula le corsie. L'acqua delle uova contiene blu metilene, che impedisce la crescita della muffa. Lasciare che le larve si acclimatino per almeno 10 minuti per ridurre il loro stress.
Ora posizionare la piastra del pozzo in una camera di imaging sullo schermo di un laptop. Mettere a fuoco la fotocamera sulla piastra del pozzo. Riempire completamente la corsia con acqua delle uova.
Successivamente, registrare il comportamento delle larve posizionate sullo sfondo vuoto scattando immagini time-lapse. Visualizzare una barra rossa in movimento sullo schermo del laptop e prendere le immagini time lapse delle larve in risposta alla barra rossa in movimento.
La forma rossa è percepita come una minaccia, uno stimolo avverso e causa stress alle larve. In risposta, evitano la barra e dimostrano tigmotassi positivi. La tigmotaxis positiva è la risposta del pesce allo stimolo che cerca il contatto con il muro e nuota sul bordo della corsia.
Nel protocollo di esempio, analizzeremo l'elusione e le risposte tigmotattiche delle larve di zebrafish trattate con composti farmaceutici o tossine ambientali.
- Per iniziare la cattura dell'immagine, spostare attentamente le larve dalla piastra di Petri alla corsia di agarosio per aiutare a ridurre lo stress delle larve. Fino a 20 larve possono essere posizionate in ogni corsia, ma cinque larve per corsia vengono in genere utilizzate per facilitare il tracciamento più accurato della velocità di nuoto e ridurre il numero di larve necessarie per esperimento.
Riempire le corsie con acqua delle uova con o senza prodotti farmaceutici o sostanze tossiche a seconda dell'esperimento. Non riempire completamente le corsie fino a quando non vengono posizionate negli armadi di imaging per evitare lo straripamento. Attendere 10 minuti per l'acclimatazione delle larve. Dopo il periodo di acclimatazione, posizionare quattro piastre a mano direttamente sopra lo schermo del laptop.
In questo momento, le corsie possono essere sormontate con acqua d'uovo o trattamento chimico in modo che sia livellata con la parte superiore della corsia, per eliminare le ombre sui bordi delle corsie nelle immagini.
Programmate il computer per la fotografia time lapse, scattando foto ogni sei secondi per un totale di 300 immagini per esperimento. Impostate la fotocamera a una risoluzione inferiore per l'imaging a velocità video. Mentre la risoluzione inferiore limita le registrazioni a una singola piastra multi-pozzo, le registrazioni video sono appropriate per l'imaging di eventi di nuoto rapido.
Utilizzare una presentazione di PowerPoint come stimolo avverso per le larve. In questa dimostrazione, PowerPoint inizia con uno sfondo bianco vuoto per 15 minuti, seguito da 15 minuti di una barra rossa mobile nella metà superiore della piastra. Per evitare l'evaporazione del liquido all'interno delle corsie di agarosio, mantenere il tempo massimo di imaging al di sotto di un'ora.
