Evasão de zebrafish e ensaio thigmotaxis: um método de alto rendimento para examinar o comportamento larval em resposta ao estímulo visual aversivo

- Para começar, coloque cinco larvas em cada pista de uma placa de seis pistas de agarose. Adicione água adicional de ovo, mas não encheque demais as pistas. A água do ovo contém azul de metileno, o que impede o crescimento do molde. Deixe as larvas aclimatar por pelo menos 10 minutos para reduzir seu estresse.

Agora coloque a placa do poço em uma câmara de imagem sobre uma tela de laptop. Concentre a câmera na placa do poço. Encha a pista completamente com água de ovo.

Em seguida, regise o comportamento das larvas colocadas no fundo em branco tirando imagens de lapso de tempo. Exibir uma barra vermelha em movimento na tela do laptop e tirar imagens de lapso de tempo das larvas em resposta à barra vermelha em movimento.

A forma vermelha é percebida como uma ameaça, um estímulo aversivo, e causa o estresse das larvas. Em resposta, eles evitam a barra e demonstram thigmotaxis positivos. Thigmotaxis positivo é a resposta do peixe ao estímulo que busca contato com a parede e nada na beira da pista.

No protocolo de exemplo, analisaremos as respostas evasão e thigmotactic de larvas de zebrafish tratadas com compostos farmacêuticos ou toxinas ambientais.

- Para iniciar a captura da imagem, mova cuidadosamente as larvas da placa de Petri para a pista de agarose para ajudar a reduzir o estresse das larvas. Até 20 larvas podem ser colocadas em cada pista, mas cinco larvas por pista são tipicamente usadas para facilitar o rastreamento mais preciso da velocidade de natação e reduzir o número de larvas que são necessárias por experimento.

Encha as pistas com água de ovo com ou sem produtos farmacêuticos ou tóxicos dependendo do experimento. Não preencha as pistas até que sejam colocadas nos armários de imagem para evitar o transbordamento. Deixe 10 minutos para as larvas se aclimatarem. Após o período de aclimatação, posicione quatro placas à mão diretamente em cima da tela do laptop.

Neste momento, as pistas podem ser cobertas com água de ovo ou tratamento químico para que seja nivelado com o topo da pista, para eliminar sombras nas bordas das pistas nas imagens.

Programe o computador para fotografia de lapso de tempo, tirando fotos a cada seis segundos para um total de 300 imagens por experimento. Defina a câmera em uma resolução mais baixa para imagens em velocidade de vídeo. Enquanto a resolução inferior limita as gravações a uma única placa multi-poço, as gravações de vídeo são apropriadas para eventos rápidos de natação.

Use uma apresentação do PowerPoint como um estímulo aversivo para as larvas. Nesta demonstração, o PowerPoint começa com um fundo branco em branco por 15 minutos, seguido por 15 minutos de uma barra vermelha em movimento na metade superior da placa. Para evitar a evaporação do líquido dentro das pistas de agarose, mantenha o tempo máximo de imagem abaixo de uma hora.