Saggio di formazione della colonia di agar morbido: un metodo per testare gli effetti di nuovi composti sulla proliferazione delle cellule tumorali

Per iniziare, prendi un'appropriata concentrazione di agarosio fuso in un tubo conico e aggiungi una quantità desiderata di mezzo di coltura calda ad esso. Invertire delicatamente per mescolare il contenuto. Aggiungere questa miscela in ogni pozzo di una piastra a sei pozza e lasciare che si solidifichiamo. Questo è lo strato inferiore. Successivamente, trattare le cellule tumorali con il composto di interesse e aggiungere la concentrazione richiesta di agarosio.

Ora, versare questa miscela contenente il numero desiderato di cellule per millilitro in ogni pozzo. Questo è un livello contenente celle. Una volta che il mezzo si solidifica, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per una settimana. Preparare uno strato di alimentatore mescolando l'agarosio al mezzo e integrare questa miscela con il composto di interesse. Aggiungere delicatamente questo strato di alimentatore in ogni pozzo, consentirgli di solidificarsi e incubare la piastra a 37 gradi Celsius.

Ripetere questa procedura di alimentazione settimanalmente per reintegrare le cellule con il mezzo fino a formare colonie. Se il composto di interesse è un inibitore della tumorigenicità, sopprimerà la crescita delle cellule con conseguente poche colonie nei pozzi. Nel seguente protocollo, eseguiremo un saggio di formazione di colonie di agar morbido per studiare l'effetto degli inibitori PADI sulla tumorigenicità delle cellule tumorali del seno.

Inizia questa procedura preparando il 3% di agarose 2-idrossietile. In una bottiglia di vetro pulita e asciutta da 100 millilitri, aggiungere 0,9 grammi di agarosio 2-idrossietile seguito da 30 millilitri di acqua distillata. Microonde la miscela per 15 secondi e ruotare delicatamente. Ripetere questo passaggio fino a quando la polvere di agarosio si dissolve completamente. Successivamente, autoclavare la soluzione contenente bottiglia per 15 minuti.

Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio a temperatura ambiente prima di un ulteriore utilizzo. Pre-riscaldare diverse pipette da cinque millilitri e 10 millilitri in un incubatore di 37 gradi Celsius per evitare che l'agarosio si solidifica nella pipetta durante la manipolazione. Allentare parzialmente il coperchio della bottiglia e microonde la soluzione prefattata di agarosio 2-idrossietile per 15 secondi. Quindi ruotare delicatamente la soluzione e il microonde per altri 15 secondi.

Fare attenzione quando si ruota la soluzione di agarosio perché la soluzione si alza quando esposta all'aria e può riversarsi. Se c'è gel solido residuo nella bottiglia, microonde per qualche secondo in più. Conservare la bottiglia contenente la soluzione di agarosio in un bagno d'acqua di 45 gradi Celsius durante i passaggi successivi per evitare che la soluzione di agarosio si solidifica prematuramente.

Successivamente, trasferire 12 millilitri di mezzi riscaldati utilizzando le pipette preri warmed in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Aggiungere immediatamente tre millilitri della soluzione di agarosio al 3% e invertire delicatamente il tubo conico per mescolare l'agarosio con il supporto. Quindi aggiungere delicatamente due millilitri di questa miscela in ogni pozzo di una piastra di coltura a sei pozzi senza formare bolle d'aria. Incubare la piastra di coltura a sei poggiagli orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per un'ora per consentire alla miscela di solidificarsi.

Dopo che la miscela si solidifica, posizionare la piastra in un incubatore di 37 gradi Celsius per 30 minuti. Il livello inferiore è ora pronto per l'uso.

Un aspetto difficile di questa procedura è assicurarsi che tutte le cellule siano distribuite equamente e che il gel di agarosio fuso non si solidificherà prima dell'aggiunta ad ogni pozzo, per garantire che le cellule vengano mescolate nel supporto prima di aggiungere il gel di agarosio liquido. Inoltre le pipette vengono preri riscaldate in anticipo per evitare che le soluzioni si solidificano durante la manipolazione.

Per preparare la cella contenente lo strato, provare prima le cellule MCF10DCIS e diluirle a una concentrazione cellulare di 40.000 cellule per millilitro. Quindi prendere otto millilitri di supporti usando pipette prerimerte e trasferirli in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Aggiungere immediatamente due millilitri di agarosio al tubo conico e invertire delicatamente per mescolare l'agarosio con il supporto. Evitare di formare bolle.

Successivamente, prendere due millilitri delle cellule e trattarle con due micromolare BB-cloro-amido in DMSO, o DMSO da solo come controllo. Dopo il trattamento, mescolare le cellule con uno 0,6% di agarosio in una diluizione uno a uno per fare una concentrazione finale di un micromolare BB-cloro-amido. Quindi prendere un millilitro della miscela cellula-agarosio e aggiungere delicatamente sullo strato inferiore della piastra di coltura a sei pozzetto.

Posizionare la piastra di coltura a sei poggiamenti orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti per consentire allo strato superiore di solidificarsi. Dopo che la miscela si solidifica, posizionare la piastra in un incubatore di 37 gradi Celsius per una settimana prima di aggiungere lo strato di alimentazione. Inizia a nutrire la preparazione dello strato microwaving la soluzione prefatti di agarosio 2-idrossietile 3% come prima e equilibrando la bottiglia di soluzione di agarosio in un bagno d'acqua di 45 gradi Celsius.

Mescolare un millilitro di soluzione di agarosio al 3% con nove millilitri di mezzi caldi in un tubo conico da 50 millilitri e invertire delicatamente per mescolare l'agarosio con il supporto. Evitare di formare bolle d'aria. Dopo aver trattato la miscela con BB-cloro-amidina, aggiungere delicatamente un millilitro della miscela in ogni pozzo della piastra di coltura a sei pozzetto contenente il fondo e gli strati morbidi. Quindi posizionare la piastra di coltura a sei poggiamenti orizzontalmente su una superficie piana a quattro gradi Celsius per almeno 15 minuti per consentire alla miscela di solidificarsi.

Dopo che lo strato dell'alimentatore si solidifica, posizionare la piastra in un incubatore di 37 gradi Celsius. Ripetere questa procedura di alimentazione settimanalmente sovrapponendo un millilitro della soluzione di trattamento medio di agarosio allo 0,3% sullo strato di alimentatore esistente per reintegrare le cellule con nuovi mezzi fino a quando non viene osservata la formazione della colonia.