Saggio di formazione della colonia di agar morbido: un metodo per testare gli effetti di nuovi composti sulla proliferazione delle cellule tumorali

Overview

Questo video descrive un saggio di formazione di colonie di agar morbido per testare gli effetti di un inibitore enzimatico PADI e BB-Cl-amidina sulla tumorigenicità del cancro al seno in vitro. Questo saggio consente anche la valutazione quantitativa del potenziale di trasformazione cellulare nel contesto delle perturbazioni genetiche.

Protocol

1. Preparazione del 3% 2-idrossietile Agarose

1. In una bottiglia di vetro pulita e asciutta da 100 ml, aggiungere 0,9 g di agarosio 2-idrossietile (Agarosio VII) seguito da 30 ml di acqua distillata.
2. Microonde la miscela per 15 secondi e ruotare delicatamente. Ripetere questo passaggio almeno altre tre volte fino a quando la polvere di agarosio si dissolve completamente.
3. Autoclave il flacone contenente la soluzione per 15 min.
4. Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio in RT prima di un ulteriore utilizzo. Conservare la soluzione su RT.

2. Preparazione dello strato inferiore: 0,6% gel di agarosio

1. Preripidare diverse pipette da 5 ml e 10 ml in un incubatore a 37 °C per evitare che l'agarosio si solidifica nella pipetta durante la manipolazione.
2. Allentare parzialmente il coperchio della bottiglia e il microonde la soluzione prefattata di agarosio 3% 2-idrossietile per 15 secondi. Quindi, ruotare delicatamente la soluzione e il microonde per altri 15 secondi.
   ATTENZIONE: Fare attenzione quando si ruota la soluzione di agarosio perché la soluzione si alza quando esposta all'aria e può riversarsi.
3. Se c'è gel solido residuo nella bottiglia, microonde per qualche secondo in più.
4. Conservare la bottiglia contenente la soluzione di agarosio in un bagno d'acqua a 45 °C durante i passaggi successivi per evitare che la soluzione di agarosio si solidifica prematuramente.
5. Supporti MCF10DCIS caldi in un bagno d'acqua a 37 °C.
   NOTA: I supporti MCF10DCIS sono costituiti da DMEM/F12, 5% siero per cavalli, 5% streptomicina penicillina.
6. Trasferire 3 ml della soluzione di agarosio al 3% utilizzando le pipette preri warmed in un tubo conico sterile da 50 ml.
7. Aggiungere immediatamente 12 ml di mezzi MCF10DCIS caldi e invertire delicatamente il tubo conico per mescolare l'agarosio con il supporto. Cerca di non formare bolle in quanto interferirà con il conteggio della colonia più tardi.
8. Aggiungere delicatamente 2 ml di questa miscela in ogni pozzo di una piastra di coltura a 6 pozzi senza formare bolle d'aria.
9. Incubare la piastra di coltura a 6 poggiagli orizzontalmente su una superficie piana a 4 °C per 1 ora per consentire alla miscela di solidificarsi.
10. Dopo che la miscela si solidifica, posizionare la piastra in un incubatore di 37 °C per 30 minuti. Il livello inferiore è ora pronto per l'uso.

3. Preparazione dello strato contenente cellule: 0,3% gel di agarosa

1. Tripinare le cellule MCF10DCIS e diluirle a una concentrazione cellulare di 4 x 10⁴ /ml.
2. Assumere 2 ml di agarosio al 3% utilizzando pipette prerimerte e trasferirlo in un tubo conico sterile da 50 ml.
3. Aggiungere immediatamente 8 ml di supporti MCF10DCIS al tubo conico e invertire delicatamente per mescolare l'agarosio con il supporto. Evitare di formare bolle.
4. Assumere 2 ml delle cellule MCF10DCIS (4 x 10⁴ /ml) e trattare con BB-CLA (0 μM (DMSO) o 1 μM).
5. In una diluizione 1:1, mescolare le cellule con lo 0,6% di agarosio.
6. Assumere 1 ml della miscela cellula-agarosio e aggiungere delicatamente sullo strato inferiore della piastra di coltura a 6 pozzi (2 x 10⁴ cellule/ml).
7. Posizionare la piastra di coltura a 6 pozze di pozzo orizzontalmente su una superficie piana a 4 °C per almeno 15 minuti per consentire allo strato superiore di solidificarsi.
8. Dopo che la miscela si solidifica, posizionare la piastra in un incubatore di 37 °C per una settimana prima di aggiungere lo strato di alimentazione.

4. Preparazione dello strato di alimentatore: 0,3% gel di agarosio

1. Microonde la prefazione 3% 2-idrossietile agarosio soluzione per 15 sec.
2. Equilibrare la bottiglia di soluzione di agarosio in un bagno d'acqua a 45 °C.
3. Riscaldare il supporto MCF10DCIS in un bagno d'acqua a 37 °C.
4. Mescolare 1 ml di soluzione di agarosio al 3% con 9 ml di mezzi MCF10DCIS caldi in un tubo conico da 50 ml e invertire delicatamente per mescolare l'agarosio con il supporto. Evitare di formare bolle d'aria.
5. Trattare la miscela con BB-CLA (0 μM (DMSO) o 1 μM).
6. Aggiungere delicatamente 1 ml di questa miscela (senza formare bolle) in ogni pozzo della piastra di coltura a 6 pozzi contenente il fondo e gli strati morbidi.
7. Posizionare la piastra di coltura a 6 pozze di pozzo orizzontalmente su una superficie piana a 4 °C per almeno 15 minuti per consentire alla miscela di solidificarsi.
8. Dopo che lo strato dell'alimentatore si solidifica, posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C.
9. Ripetere questa procedura di alimentazione settimanalmente sovrapponendo 1 ml di soluzione allo 0,3% di agarosio/ mezzo / trattamento sullo strato di alimentatore esistente per reintegrare le cellule con nuovi mezzi fino a quando non viene osservata la formazione della colonia.
   NOTA: L'agar negli strati morbidi e alimentatori è molto morbido e, pertanto, i nutrienti aggiunti dallo strato di alimentazione si diffonderanno prontamente nello strato contenente cellule per raggiungere le cellule.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1