השתנה Annexin V / Propidium אפופטוזיס יודיד Assay לקבלת הערכה מדויקת של מוות של תאים

המטרה הכוללת של הניסוי היא להתגבר על בעיות עכשוויות עם טכניקות צביעה קונבנציונליות של Annexin 5 ו-Propidium iodide להערכת מוות תאים על ידי אפופטוזיס ו/או נמק. מצאנו שגישות צביעה קונבנציונליות של מגוון רחב של קווי תאים ותאים ראשוניים מביאות לעד 40% אירועים חיוביים כוזבים. אירועים חיוביים כוזבים אלה נובעים מצביעת RNA ציטופלזמי.

לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו מפחית באופן דרסטי את מספר המקרים החיוביים השגויים על ידי הכנסת שלבי קיבוע ופירוק RNA בשלבים ספציפיים בהליך הצביעה, התאים הראשונים נצבעים ב-X בחמש ובפרידיום יודיד כדי לזהות מוות תאים לפי הנהלים המקובלים. לאחר מכן, התאים מקובעים עם 1% פורמלדהיד, מה שמגביר את החדירות של קרום הפלזמה. לבסוף, התאים הקבועים מטופלים ב-RNA A על מנת לפרק RNA ציטופלזמי, תוך ביטול חיובי כוזב הגורם לצביעה של פרופידיום יודיד.

כמו ביולוגים רבים של התאים, השתמשנו בשיטות ציטומטריית זרימה קונבנציונליות של נקסין חמש ופרופידיום יודיד לאיתור מוות של תאים אפופטוטיים ונמקיים. למרבה הצער, לאחרונה גילינו ששיטה זו מובילה למספר משמעותי של אירועים חיוביים כוזבים עד 40% במגוון קווי תאים ותאים ראשוניים. שיטה מעודכנת זו מתגברת על אזהרות אלה.

הגישה שלנו מנצלת את קיבוע התאים ועיכול ה-RNA בשלבים ספציפיים לאורך ההליך כדי להסיר באופן סלקטיבי את ה-RNA הפלזמי של cyop, צביעה שמובילה ישירות לאירועים חיוביים כוזבים אלה, לקצור את התאים לניתוח לצורך הניסוי. בסרטון הזה אנו משתמשים במקרופאגים גולמיים. לדוגמה, צנטריפוגה של הדגימות ב-335 Gs למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מפזרת את הסופרנטנט ומשהה מחדש את התאים בשני מיליליטר של XPBS אחד.

ואז לשטוף את התאים שוב באותם תנאים. הפעם, החייאה תלויה את התאים במיליליטר אחד של X NX אחד וחמישה מאגר קשירה. לאחר צנטריפוגה של הדגימות וניקוי הסופרנטנט שוב השעו את התאים בנפח סופי של 100 מיקרוליטר של מאגר הקישור X NX Xin חמש.

הוסף שין חמש לכל דגימת תא בהתאם להמלצות היצרן. לדוגמה, בסרטון זה, 2.5 מיקרוליטר של שין חמש זי מתווספים לכל צינור תחתון עגול מפוליסטירן. דגרו את הצינורות בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של X NX אחד בחמישה מאגרים מחייבים לכל צינור תגובה. כעת אמורים להיות כ-200 מיקרוליטר של תמיסה בכל צינור. לאחר מכן, הכינו דילול של 1 עד 10 של פרופידיום, יודיד או PI במאגר X NX.In חמישה מחייבים, הוסיפו ארבעה מיקרוליטר של ה-PI המדולל לכל צינור, והניבו ריכוז סופי של שני מיקרוגרם למיליליטר pi בכל דגימה.

דגרו שוב את הצינורות בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר תקופת הדגירה הזו, שטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר של x ו-x אחד וחמישה מאגרים מחייבים וצנטריפוגה את הדגימות ב-335 Gs למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושפכו את החבט. השעו מחדש את התאים בעוד 500 מיקרוליטר של X NX אחד וחמישה מאגר מחייב עם 500 מיקרוליטר של 2% פורמלדהיד.

ליצירת תמיסת פורמלדהיד של 1%, ערבבו את הצינורות בתנועה עדינה. תקן את הדגימות על קרח למשך 10 דקות לאחר התיקון. הוסף מיליליטר אחד של XPBS אחד לכל דגימה וערבב בעדינות על ידי צנטריפוגה של התאים ב-425 Gs למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס שלוש פעמים במהלך הכביסה.

הכן דילול של 1 עד 100 של RNA A ב-XPBS אחד, השהה מחדש את הגלולה על ידי החלקת הצינורות והוסף 16 מיקרוליטר של ה-RNA המדולל, תמיסה כדי לתת ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את התאים במיליליטר אחד של XPBS אחד וערבבו בעדינות על ידי החלקה ואז צנטריפוגה את הצינורות ב-425 GS למשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הדגימות מוכנות כעת לניתוח. לחלופין, ניתן להשתמש בדגימות לשלבי הצביעה הבאים אם צביעת N-X-M-P-I מתבצעת במקביל להליכים אחרים. תמונות ציטומטר זרימת זרם תמונה מייצגות מראות את היקף הצביעה החיובית השגויה בשלוש אוכלוסיות תאים ייחודיות.

מקרופאגים גולמיים של קו תאים נפוץ אחד ושני קווי תאים ראשוניים המשקפים מקרופאגים של מח עצם ומקרופאגים ראשוניים של דגי זהב. השימוש במקרופאגים ראשוניים של דגי זהב מדגיש את הישימות של טכניקה זו במגוון פלטפורמות תאיות. אירועים חיוביים אמיתיים מציגים את הקו-לוקליזציה הצפויה בתוך התא הגרעיני בין PI ל-drac.

חמש, צבע חדיר מאוד לממברנה שמכתים במדויק את התא הגרעיני של תאים חיים ומתים כפי שמעיד הצביעה הצהובה. כאן, הדיוק של צביעה גרעינית PI הוערך על סמך מידת הדמיון שלו ל-D dr 5 BRDU 7 A.A, D DPI, ו-DRAC 5 הראה דמיון של יותר מ-99% ביכולתם לצבוע במדויק את הגרעין בקו תאי המקרופאגים הגולמי 2 64 0.7. לעומת זאת, צביעת PI ציטופלזמית המתרחשת בעת שימוש בפרוטוקולים קונבנציונליים הובילה לירידה ניכרת באחוזי הדמיון של צביעה גרעינית ביחס ל-d dr five.

באיור זה ניתן לראות כי שילוב של 50 מיקרוגרם למיליליטר RNAs A מסיר צביעת PI לא גרעינית ומגדיל משמעותית את מידת הדמיון ביחס לצביעה d dr five בתאי מקרופאג כליה ראשוני של דג זהב. תמונות מייצגות של מקרופאגים ראשוניים בכליות באיור זה מראות את אובדן צביעת ה-RNA בתא הציטופלזמי עם הטיפול ב-RN a. חלקות פיזור אלה של מקרופאגים ראשוניים של כליות דג זהב מראות הפחתה משמעותית של אירועים נמקיים אפופטוטיים כוזבים בתאים שהוכנו עם פרוטוקול נקסין PI שונה.

הפרוטוקול החדש מראה כי 84.9% מהתאים הם ברי קיימא. השערים שורטטו על סמך דגימות זרם תמונה מקבילות המעריכות תכונות פלואורסצנטיות ומורפולוגיות. בדוגמה אחת, אבות מוקדמים מונוציטים ומקרופאגים בוגרים נצבעו על ידי ה-NX המותאם בחמישה פרוטוקול PI המתואר בסרטון זה, או על ידי השיטה הקונבנציונלית עבור תא דמות זה שנצבע על ידי הפרוטוקול השונה הראה ירידה חזותית במספר אירועי PI חיוביים עקב הסרת אירועים חיוביים כוזבים על ידי טיפול ב-RNAs.

יתר על כן, השפעה זו הייתה בולטת יותר בתאי מקרופאגים בוגרים גדולים מאשר בתאי אב מוקדמים קטנים יותר. מסקנות המבוססות על פרוטוקולים קונבנציונליים היו מצביעות בטעות על מתאם חיובי במוות תאי עבור תת-קבוצות מקרופאגים בוגרות יותר בעקבות הליך צביעה זה, ניתן לבצע שלבים נוספים כגון צביעה תוך-תאית או פני השטח כדי לענות על שאלות ספציפיות לגבי תת-האוכלוסיות בתוך התא המבודד שלך. הרלוונטיות של טכניקה זו חורגת משאלות מבוססות חסינות, למשל, רלוונטית גם למערכות ניסיוניות המשתמשות בתאים העוברים תאי לחץ גנוטוקסיים המטופלים בעצירת מחזור התא, תרופות כגון תימידין או הידרוקסיאוריאה, ומחקרים על תאים עובריים שבהם התקדמות התפתחותית מאופיינת בשינויים בדידים בסינתזת RNA תאית.