用于测量高分子配体亲和等温滴定量热

该程序的总体目标是展示一种使用等温滴定量热法 （ITC） 研究配体大分子结合的通用技术。这是通过首先制备不含杂质且缓冲液组成和 pH 值匹配的配体和大分子溶液来实现的。然后测定配体和大分子溶液的最终浓度。

接下来，设置 ITC 实验参数，然后进行数据收集。该过程的最后一步是分析和拟合数据。最终，通过对滴定数据进行图形分析来确定结合和热力学参数，从而获得显示配体大分子相互作用的结果。

与吸收和荧光滴定等现有方法相比，这种结合技术的主要优点是，可以从同一实验中确定结合的焓和熵。样品制备从测定大分子和配体的适当浓度开始。获得准确的 ITC 的关键步骤是计算这些浓度时要考虑的信息，可以在书面程序中找到。

在该演示中，研究了辅因子 N-A-D-P-H 与大肠杆菌染色体二氢叶酸还原酶的结合。首先在缓冲液中将冻干的大分子重构至所需浓度，然后将配体溶解在所需体积的缓冲液中。接下来，检查大分子和配体样品的 pH 值是否在缓冲液的正负 0.05 pH 单位范围内，并将染色体二氢叶酸还原酶和 N-A-D-P-H 溶液在微量离心管中离心 5 分钟。

在 8， 000 到 14， 000 RPM 时，这将使溶液中的任何颗粒沉淀，这可能会导致 ITC 热谱图基线中出现伪影。离心后。通过 uves 光谱法仔细检查大分子和配体溶液的浓度，并记录它们的确切浓度。

然后通过将制备好的储备大分子和配体溶液稀释至必要的实验浓度，配制适当体积的每种 ITC 溶液。最后，在将大分子和配体加载到 ITC 中之前，对样品进行脱气，以避免在滴定过程中因气泡或溶解气体释放而产生信号伪影。根据制造商的方案清洁样品池和注射注射器。

然后使用 Hamilton 注射器用 1.8 毫升蒸馏水冲洗样品池两到三次。处理注射器时要小心，因为长尖端很容易弯曲。接下来，用相同体积的缓冲液冲洗样品池数次。

样品池清洁后，将 1.8 mL 大分子溶液加载到池中。小心避免在溶液从细胞茎中出来时形成气泡，以停止添加样品。使用 Hamilton 注射器轻轻地在细胞两侧上下移动针头以敲击存在的气泡，以去除任何气泡。

取出注射器并从细胞顶部的孔中取出多余的体积。接下来，用蒸馏水填充参比池。然后使用管道将塑料注射器连接到注射注射器的填充口。

打开 VP 查看器 2000 控制台上的填充端口。用蒸馏水冲洗注射注射器，然后进行缓冲液冲洗。通过系统吸入空气，确保注射注射器完全排空。

将注射注射器的针头放入配体溶液中，然后将溶液吸入注射器中直至完全充满。继续将少量多余的体积吸入端口，并在立即关闭加注口后分离管路。拆下管路和塑料注射器吹扫装置，重新填充注射注射器两次，以消除注射器中的任何气泡。

从配体溶液中取出注射注射器，然后用化学湿巾擦去侧面的任何滴剂。小心不要将注射器尖端接触化学湿巾或敲击注射器，因为这可能会导致注射器体积损失。接下来，小心地将注射注射器放入样品池中。

使用 Micro Cal 提供的用于绑定系统的 V VP viewer 2000 程序设置运行 ITC 的参数。在染色体二氢叶酸还原酶 N-A-D-P-H 系统等强热信号下，大量小体积注射将提供更多数据点进行拟合。相反，对于热信号较弱的系统，最好使用少量大体积进样。

对于前 1 次或 2 次进样，将进样体积设置为 2 μL。这些注射最终将被丢弃，因为它们可能会因配体和大分子溶液之间的混合而产生虚假结果。输入进样间隔时间时，请等待几分钟，让系统达到平衡，并使热信号恢复到基线水平。

然后选择实验温度并输入注射器的搅拌速度，以便在实验参数设置后进行滴定期间配体和大分子的充分混合，开始实验。实验完成后，最终的热信号应接近饱和。根据制造商的方案清洁 ITC，并至少再重复滴定一到两次以获得可重现的数据。

最后，运行一个对照，将配体滴定到样品池中的缓冲液中，以确定数据配体拟合的稀释热，可以使用任何数据拟合程序中的宏轻松执行。此处使用 micro Cal 提供的 Origin 7 来演示数据拟合。开始加载第一个数据文件。

检查原始热谱图中是否有任何气泡或其他伪影迹象，是否存在任何伪影，例如基线中的峰值或在没有进样点的情况下出现峰。请注意这些数据点，因为它们应该被删除。接下来，加载配体稀释对照数据，并在此时从结合等温线中减去它。

去除所有虚假数据点，包括滴定中通常出现稀释伪影的前几个数据点。然后选择数据拟合模型。选择模型后，可以通过手动输入拟合参数的初始猜测来拟合数据，包括化学计量、焓和结合亲和力。

但是，如果从正交实验中知道任何参数的先验知识，则应输入这些值，因为它们将有助于避免数据在拟合过程中被困在本地 mini 中。一旦数据适合第一次滴定，对其余的等温线重复数据分析步骤。或者，可以使用诸如所述 fat 之类的程序对数据进行全局拟合，通过将 origin 中的数据保存为 dot dat 文件来开始全局拟合。

然后将数据导入到所述脂肪中。选择一个模型进行拟合并进行全局拟合，数据在单纯形和 Mark HAR Leven 拟合选项之间来回切换，直到全局卡方值达到最小值。本视频中演示的代表性 ITC 程序监测 N-A-D-P-H 与大肠杆菌染色体脱氢叶酸还原酶的结合。

随着热量的释放，N-A-D-P-H 与 de hydro 叶酸还原酶的放热结合在原始热图中很明显。每次连续进样时热量信号减弱表明结合饱和，这发生在滴定的前半部分。组分的纯度和缓冲液的良好匹配可以从图的饱和部分注意到，其中配体稀释热仅产生极小的热信号。

使用原始软件将数据拟合到单个站点模型，以揭示结合等温线然后，使用所述脂肪将两个数据集拟合到单个站点模型。残差的小值和随机模式表明热力学参数是合理的。这些参数也通过与通过正交方法获得的文献值进行比较来验证。

观看本视频后，您应该对如何使用微观 VP ITC 通过正确制备溶液、设置实验参数和分析数据来研究配体宏观 mo 结合有一个很好的了解。