En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

El objetivo general de este procedimiento es realizar un experimento de electroporación in vivo en ratones neonatos con el fin de introducir material genético de forma estable en las células de la retina. Esto se logra mediante la anestesia inicial, un ratón neonatal que se coloca en hielo durante aproximadamente cinco a 10 minutos. El segundo paso del procedimiento es identificar la unión de los párpados fusionados y abrir el ojo cortando a lo largo de esta unión.

A continuación, se realiza una incisión en el ojo para facilitar la inserción de la jeringa de microinyección. A continuación, se inserta la jeringa de microinyección a través de la incisión y se inyecta la solución de ADN en el espacio subretiniano. Finalmente, se coloca un electrodo de pinza en la cabeza del pop y se administran una serie de pulsos eléctricos.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transducción retroviral, es que la electroporación in vivo no requiere la generación y manipulación de agentes biológicos como herramientas para la administración de genes. Como resultado, la técnica requiere menos mano de obra, menos reactivos y se puede llevar a cabo en cualquier estación de trabajo aprobada para procedimientos con animales. Por lo general, las personas nuevas en la técnica tendrán dificultades porque se necesita tiempo y repetición para desarrollar una sensación de la colocación de la jeringa de microinyección en el espacio subretiniano.

Jimmy DeMilo, becario postdoctoral en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Debido a que la concentración de ADN requerida para la electroporación es relativamente alta, el ADN plasmídico deseado primero se amplifica con células incompetentes extraídas usando una maxi preparación, luego se purifica y se concentra a aproximadamente cinco microgramos por microlitro. Se añade un tinte verde rápido FCF como trazador de inyección.

Una vez que se ha preparado el ADN plasmídico, se anestesian a las crías de ratón recién nacidas en hielo durante aproximadamente cinco minutos, monitoreándolas hasta que se confirma la inconsciencia mediante la compresión de la almohadilla del pie. Cambie el área del ojo que se inyectará con alcohol de perfil isop al 70 % y use un microscopio de disección para identificar el epitelio de la unión FUS donde se unen los párpados. Con una aguja afilada de calibre 30, abra el ojo con cuidado cortando a lo largo del epitelio de unión fusionado sin aplicar una presión excesiva hacia abajo ni cortar más allá del alcance del párpado.

Una vez abierto el párpado y expuesto el ojo, se utiliza la punta de la aguja para hacer una pequeña incisión en la esclerótica cerca de la unión con la córnea teniendo cuidado de no penetrar demasiado profundamente y perforar el cristalino. Inserte la aguja de inyección con extremo romo en la incisión. Justo hasta que se sienta la resistencia de la pared escleral opuesta, inyecte lentamente 0,3 microlitros de la solución viscosa de ADN en el espacio subretiniano.

Teniendo cuidado de no presionar demasiado contra la pared escleral, gire al animal para verificar una distribución uniforme de la solución de ADN dentro de la retina. Primero, sumerja el electrodo de la pinza en PBS para maximizar la conductividad eléctrica. Luego, coloque la cabeza del cachorro inyectado entre los electrodos con el ojo inyectado adyacente al electrodo de polo positivo y el ojo no inyectado adyacente al electrodo de polo negativo.

Aplique cinco pulsos cuadrados usando un generador de pulsos, cada pulso de 80 voltios y 50 milisegundos de duración con un intervalo de 950 milisegundos entre pulsos. Finalmente, caliente a los cachorros bajo una lámpara de calentamiento hasta que se recuperen de la anestesia con hielo. Una vez recuperados, devuelva los cachorros electroporados a su madre en el tercer día después del parto.

La mayoría de las células electroporadas de EGFP se encuentran en la capa neuroplástica de la retina y no muestran características morfológicas distintivas de ninguna de las células gliales neurales diferenciadas de la retina. Para el día 14 postnatal, las células electroporadas se pueden encontrar en la capa nuclear externa y en la capa nuclear interna de la retina y en las diversas células marcadas. Ahora muestran las características morfológicas distintivas de las neuronas diferenciadas.

Al intentar este procedimiento, es importante realizar todos los pasos de manera suave y uniforme. Es muy fácil dañar las retinas durante la microinyección, y se requieren prácticas para desarrollar la destreza manual necesaria para evitar el daño tisular. Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica o la hibridación in situ, para determinar si la expresión de genes de interés está regulada hacia arriba o hacia abajo en las electrorretinas.