Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

In diesem Video wird gezeigt, wie man ein konfokales Mikroskop mit Videoaufnahmerate aus handelsüblichen Komponenten aufbaut. Ein scannendes konfokales Mikroskop beruht auf der koordinierten Bewegung zweier Scanspiegel, um den Strahl über die Rasterebene zu verschieben. Licht vom ersten Spiegel wird horizontal über den ersten Satz von Relaislinsen gescannt, die es wieder auf einen feststehenden Punkt auf dem zweiten Scanspiegel fokussieren. Derselbe Scannvorgang wird anschließend über die Scan- und Tubuslinsen weitergeleitet, wodurch der nun erweiterte Lichtstrahl auf die hintere Öffnung der Objektivlinse gerichtet wird.

Der zweite Spiegel, dessen Bewegung im Vergleich zum ersten Spiegel langsam ist, scannt gleichzeitig die Y-Achse, wodurch eine Abtastung oberhalb und unterhalb der dargestellten Ebene ermöglicht und ein rechteckiges Raster auf der Probenoberfläche erzeugt wird. Der Hauptvorteil dieses Protokolls gegenüber dem Kauf eines kommerziell erhältlichen Mikroskops liegt in den geringen Kosten und der Möglichkeit, das Instrument an die spezifischen Anforderungen eines Bildgebungsprojekts anzupassen. Bei der Arbeit mit jedem Laser ist es unerlässlich, geeignete Sicherheitsmaßnahmen zu ergreifen, um Verletzungen des Auges zu verhindern.

Tragen Sie nach Möglichkeit stets die geeigneten Laserschutzbrillen. Zuschauer und/oder Forscher, die nicht aktiv am Justieren oder Arbeiten mit dem Strahl beteiligt sind, sollten immer eine Brille tragen. Entfernen Sie alle glänzenden und reflektierenden Uhren oder Schmuckstücke.

Am wichtigsten ist es, den Strahllauf stets zu überwachen und zu kontrollieren, indem Sie den Strahlengang mit einem Strahlstopper oder einer befestigten Visitenkarte abschließen. Dies ist besonders wichtig beim Justieren der Spiegel, da der Strahlverlauf schwer vorhersehbar sein kann. Zudem sollten Sie niemals Ihre Augen auf Strahlhöhe bringen.

Schalten Sie den Laser aus, wenn Sie die Strahlebene überqueren müssen, bevor Sie das Mikroskop zusammenbauen. Stellen Sie sicher, dass sämtliche für den Aufbau erforderlichen Geräte vorhanden sind, einschließlich der optischen Grundplatte und 90-Grad-Winkelhalterungen, aller Spiegel, Linsen und Dichroiken sowie der entsprechenden Klemmen und Montagevorrichtungen, beider Scanspiegel und des Photodetektors. Es ist außerdem hilfreich, einen Funktionsgenerator bereitzuhalten, um die Scan-Bewegung zu testen und die Spiegel während der Justage zu verstellen.

Es wird außerdem dringend empfohlen, die optische Grundplatte zur Stabilisierung festzuschrauben. Beginnen Sie den Aufbau des Mikroskops, indem Sie die Pigtail-Faser in der optischen Halterung platzieren und diese Baugruppe in die Mitte der optischen Grundplatte setzen. Dies entspricht dem Ursprung des blauen Strahls, wie hier dargestellt.

Schalten Sie die Lichtquelle ein. Verwenden Sie die Justierschrauben, um den Strahl grob so einzustellen, dass er sowohl horizontal als auch vertikal gerade verläuft. Platzieren Sie eine Blende vor dem Faserkollimator.

Als Nächstes justieren Sie die Höhe der Blende, sodass der Strahl durch die Mitte verläuft. Danach bewegen Sie die Blende entlang des Strahlengangs vom Ablenker weg. Überprüfen Sie die Ausrichtung des Strahls.

Verwenden Sie die beiden Justierschrauben, um den Strahl bei Bedarf neu auf die Blende auszurichten. Bringen Sie den montierten Diic-Spiegel so in den Strahlengang, dass der Laserstrahl auf der Mitte des Spiegels positioniert ist. Drehen Sie den Spiegelhalter, um den Strahl in einem Winkel von etwa 90 Grad zu reflektieren, und stellen Sie sicher, dass die Strahlhöhe unverändert bleibt.

Befestigen Sie den Spiegel an dem Tisch, indem Sie die Schrauben an der Halterung festziehen. Bringen Sie anschließend den montierten resonanten galvanometrischen Spiegel in den Laserstrahlengang ein, wobei darauf zu achten ist, dass der Laserstrahl genau in der horizontalen Mitte der Spiegeloberfläche positioniert ist.

Drehen Sie die Spiegelhalterung, um den Laserstrahl in einem Winkel von 90 Grad zu reflektieren. Passen Sie anschließend die Reflexion an dem Spiegel grob so an, dass die vertikale Höhe des Laserstrahls erhalten bleibt. Nehmen Sie danach zwei Irisblenden und platzieren Sie sie direkt vor dem resonanten Galvo.

Dann unter Verwendung des vom resonanten Galvanometerspiegel reflektierten Laserstrahls als Referenz stellen Sie deren vertikale Höhe wie zuvor ein. Befestigen Sie nun mithilfe der Gewindebohrungen auf der optischen Grundplatte als visuelle Führung die beiden Irisblenden in einer geraden Linie. Justieren Sie den ersten Spiegel im Strahlengang, also den dichroitischen Spiegel, um den Strahl auf der ersten Iris zu zentrieren.

Danach justieren Sie den zweiten Spiegel im Strahlengang. Stellen Sie den resonanten Galvo so ein, dass der Strahl im Zentrum der zweiten Blende liegt. Passen Sie iterativ diese beiden Spiegel an, bis der Strahl durch beide Blenden ausgerichtet ist.

Sicherstellen, dass der von dem resonanten Galvanometer-Spiegel reflektierte Laserstrahl weiterhin in der Nähe der Spiegelmitte reflektiert wird. Falls der Strahl abgelenkt ist, justieren Sie die Halterung des Faserkollimators und wiederholen Sie die Einstellungen, bis der Strahl zentriert auf beiden offenen Irisblenden liegt. Der nächste Schritt besteht darin, die beiden Relaislinsen so zu platzieren, dass sie die erste stationäre telezentrische Ebene auf die zweite stationäre telezentrische Ebene abbilden.

Für dieses spezielle Mikroskop haben die ausgewählten Linsen im ersten Relais die gleiche Brennweite F, sodass der Abstand zwischen den beiden Spiegeln hier einfach vier F beträgt. Für diesen Aufbau entspricht F 90 Millimetern, sodass die Vier-F-Position 360 Millimeter vom Scanspiegel entfernt liegt. Um sicherzustellen, dass die Linsen exakt in der Strahlachse zentriert sind, platzieren Sie die erste Linse in den Strahlengang und betrachten Sie den Laserstrahlfleck auf der nächsten Blende im Strahlengang. Danach justieren Sie die Linsenhöhe so, dass das vertikale Zentrum des Strahls mit dem Zentrum der Blende übereinstimmt.

Danach die horizontale Strahlposition justieren, um den Strahl auf die Irismitte auszurichten. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der zweiten Linse. Anschließend wird der Scanspiegel eingerichtet und das Mikroskop gedreht, um die einfache Platzierung und Ausrichtung von Bauteilen zu ermöglichen, die andernfalls vertikal justiert werden müssten.

Um die genaue Position der zweiten telezentrischen Ebene zu finden, stecken Sie den resonanten Galvo in seine Scan-Einheit ein und schalten Sie ihn ein. Verwenden Sie eine Visitenkarte, um dem Verlauf des Scan-Strahls durch die beiden Linsen zu folgen. Die zweite telezentrische Ebene befindet sich etwa vier F vom residenten Galvo entfernt und kann als der Ort identifiziert werden, an dem der Scan-Strahl stillzustehen scheint.

Markieren Sie das Steckbrett unterhalb dieser Position mit einem Bleistift. Sobald die telezentrische Ebene identifiziert wurde, stellen Sie die Eingangsspannung des Scanspiegels auf null Volt ein und schalten Sie die Spiegelsteuerungshardware ein, damit sich der Spiegel in seine neutrale Position einpendelt. Bringen Sie dann den Standard-Scanning-Galvanometerspiegel exakt an der Position der telezentrischen Ebene an.

Stellen Sie die Spiegelposition so ein, dass der Strahl in der Fern-Ebene genau die Mitte des Scanspiegels trifft, und ziehen Sie die Spiegelhalterung fest. Lösen Sie nun die Verriegelungsschraube, die den Galvanometer-Spiegel hält, und drehen Sie ihn, um sicherzustellen, dass der Strahl vertikal verläuft. Schalten Sie nun den Laser und die Scanelektronik aus.

Trennen Sie die Faser und die Scanspiegel ab. Befestigen Sie dann mit 90-Grad-Breadboard-Halterungen die zweite Breadboard-Platte an der ersten.

Schließlich drehen Sie das gesamte Mikroskop vorsichtig, sodass die neue Grundplatte flach liegt, und befestigen Sie das Mikroskop mit der Klammer in dieser Position. Schließen Sie hier den Galvo und den Laser wieder an und denken Sie daran, den Galvo auf null Volt zurückzustellen. Der verbleibende Teil der ehemals vertikalen Aufbauten kann nun problemlos auf der flachen Grundplatte durchgeführt werden.

Als Nächstes richten wir den zweiten Satz Relaislinsen ein, der formell als Scannlinse und Tubuslinse bezeichnet wird. Weitere wichtige Informationen zur Auswahl der richtigen Linsenkombination finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Beginnen Sie mit dem Aufbau der Linsen.

Legen Sie zunächst die Spiegel bereit, die benötigt werden, um den Strahl zur Objektivlinse zu lenken. Platzieren Sie den ersten großen Zollspiegel nahe der Kante der optischen Bank und drehen Sie die Spiegelhalterung, um den Laserstrahl ungefähr um 90 Grad abzulenken. Justieren Sie die Reflexion an dem Spiegel so, dass die vertikale Strahlhöhe konstant bleibt.

Danach den anderen Zollspiegel an der gegenüberliegenden Kante der Versuchsplatte platzieren, um den Strahl in einem 90-Grad-Winkel abzulenken, und mithilfe der Justierschrauben fixieren. Als Nächstes zwei Irisblenden aufbauen und die beiden Spiegel wie zuvor justieren, um den Strahl zu zentrieren. Danach die Scanlinse im Abstand ihrer Brennweite zum Galvo in den Strahlengang stellen und ihre horizontale und vertikale Position anpassen.

Um den Laserpunkt auf der ersten Blende zwischen den beiden Spiegeln zu zentrieren. Platzieren Sie vorsichtig die große Zoll-Tubuslinse in geeignetem Abstand zur Scannlinse und justieren Sie ihre horizontale und vertikale Position, um den Strahl auf der ersten Blende zu zentrieren. In diesem Aufbau wird die Tubuslinse in einem Abstand von 75 Millimetern plus 300 Millimetern platziert, nachdem alle Komponenten angebracht sind.

Befestigen Sie das Galvo am Ausgang eines standardmäßigen elektrischen Funktionsgenerators oder einer Steuerschaltung und stellen Sie die Spitze-zu-Spitze-Spannungen auf ein bis drei Volt ein. Beginnen Sie dann mit dem Abtasten der beiden Spiegel mithilfe einer Visitenkarte. Positionieren Sie den Laserstrahl in der stationären Ebene, 300 Millimeter hinter der Tubuslinse.

Bringen Sie die Objektivlinse in den Strahlengang ein und positionieren Sie die rückwärtige Apertur der Objektivlinse so nahe wie möglich an der stationären Ebene. Richten Sie den Probentisch ein und stellen Sie sicher, dass die verschiebbare Z-Achsenhalterung während ihrer gesamten Bewegungsstrecke nicht mit der Objektivhalterung kollidiert. Zum Einrichten des konfokalen Aufbaus trennen Sie zunächst alle Stromversorgungen und Lichtwellenleiter, bevor Sie den Pinhole und den Detektor installieren.

Drehen Sie die Mikroskopanordnung so, dass sie erneut auf der Grundplatte aufliegt und den resonanten Scanspiegel hält. Nachdem Sie die Faser wieder mit dem Kollimator und dem Standard-Scanspiegel sowie den Strom-, Versorgungs- und Steuerkabeln verbunden haben, legen Sie wie zuvor auf der Probebühne null Volt an die Steuerspannung an, die den Standard-Galvanometer-Scanner antreibt, und platzieren Sie eine Probe eines hellen Farbstoffs, der zwischen zwei Deckgläsern eingeschlossen ist. Schalten Sie dann die Laserquelle ein und stellen Sie den Farbstoff scharf.

Stellen Sie die Laserleistung so ein, dass die Fluoreszenz mithilfe einer Visitenkarte so hell wie möglich wird. Verfolgen Sie die fluoreszierende Emission von der Probe über das Objektiv, das Scansystem bis zum Dichroischen Spiegel, der den Laserstrahl reflektiert und die fluoreszierende Emission durchlässt. Finden Sie dieses Fluoreszenzsignal auf der anderen Seite des dichroischen Spiegels.

Dunkeln Sie nun das Raumlicht ab. Platzieren Sie einen Spiegel hinter dem dichroitischen Spiegel, um die Emission in einem 90-Grad-Winkel zu reflektieren. Leiten Sie dann mithilfe einer Blende mit Spiegel den Fluoreszenzstrahl so gerade und parallel zur Grundplatte wie möglich.

Anschließend wird die Konfokal-Blendenanordnung unter Verwendung der räumlichen Filterkäfighalterung von Thor Labs eingerichtet. Dieses Diagramm veranschaulicht den Aufbau. Der Scanspiegel befindet sich in stationären Ebenen, die tele mit einem stationären Objektiv sind.

Linsenpaare in der rückwärtigen Apertur-Ebene zwischen den stationären Ebenen wirken als Relais für die gescannten Strahlen. Das erste Linsenpaar weist gleiche Brennweiten auf und bildet ein 1:1-Teleskop. Das zweite Linsenpaar, offiziell als Scanlinse und Tubuslinse bekannt, muss nicht gleiche Brennweiten haben und dient oft als Strahlexpander-Teleskop, um sicherzustellen, dass die Rückapertur des Objektivs überfüllt wird.

Das von der Probe emittierte Licht gelangt über das Scansystem zurück und wird durch den Dichroischen Spiegel geleitet. Eine kurze Fokussierlinse oder eine Objektivlinse bündelt das Emissionslicht durch die konfokale Lochblende, das anschließend von einer Linse kollimiert wird. Eine letzte Linse fokussiert das konfokal gefilterte Emissionslicht auf eine Photomultiplierröhre.

Platzieren Sie die räumliche Filtereinheit entlang des Emissionsstrahlengangs, wobei darauf zu achten ist, dass die erste Fokussierlinsenhalterung mittig auf dem Emissionsstrahl ausgerichtet ist. In diesem Fall wurde eine räumliche Filtereinheit mit einer Lochblende von 100 Mikron gewählt. Anschließend wird eine Linse mit kurzer Brennweite in der Einheit montiert und die Z-Verschiebehaltung so lange verschoben, bis eine scharfe Fokussierung auf der Oberfläche der Lochblende beobachtet werden kann.

Stellen Sie sicher, dass die gesamte Einheit entlang der geraden Linie ausgerichtet ist, die durch den fluoreszierenden Strahl vorgegeben wird. Befestigen Sie die Einheit am Steckbrett. Führen Sie nun mithilfe der Justierschrauben des Translationsstages eine zweidimensionale Suche über die Oberfläche der Lochblendenhalterung durch, um den Punkt zu finden, an dem das fluoreszierende Signal durch die Lochblende maximiert ist.

Als Nächstes setzen Sie die Beschichtungslinse auf die Käfighalterung. Verwenden Sie eine Visitenkarte, um nach der Pinhole die fluoreszierende Linie zu finden, die durch die konfokale Einheit verläuft, und schieben Sie die Beschichtungslinse entlang der Stäbe, bis die emittierte Fluoreszenz so kollimiert wie möglich ist. Bauen Sie die Photomultiplier-Röhrenanordnung auf. Setzen Sie eine Linse mit 50 Millimeter Brennweite in den Strahlengang der Fluoreszenzemission ein und bestimmen Sie ihren Brennpunkt.

Markieren Sie diese Position auf der Steckplatte. Schalten Sie nun den Laser vollständig aus und positionieren Sie die Fotomultiplierröhre so, dass ihr Fenster möglichst nahe am markierten Brennpunkt liegt. Verbinden Sie anschließend mithilfe von justierbaren Linsenhaltern die Baugruppe mit der Fokussierlinse.

Wickeln Sie dunkles Klebeband um alle freiliegenden Strahlengänge nach dem Lochblende, schalten Sie den Laser ein und halten Sie dessen Leistung äußerst niedrig. Schalten Sie die Photomultiplier-Röhre ein und lesen Sie deren Spannung am Oszilloskop ab. Erhöhen Sie, während die Laserintensität gesteigert wird, die Spannung, bis ein spikeartiges Signal und/oder eine DC-Offset auf dem Oszilloskopbildschirm sichtbar wird.

Bestätigen Sie, dass dieses Signal tatsächlich aus der Fluoreszenz hervorgeht, indem Sie die Laserleistung ausschalten oder den Strahlengang blockieren, um einen Signalverlust zu beobachten. Richten Sie abschließend das Lochblende iterativ für ein maximales Signal auf dem Oszilloskop aus. Indem zunächst die Z-Position der Fokussierlinse verändert und anschließend der YZ-Translationsstadium justiert wird, ist die Hardware des Videoraten-Mikroskops vollständig eingerichtet.

Zunächst schalten Sie die Fotomultiplierröhre aus. Schließen Sie nun die kundenspezifischen Steuerplatinen und den Computer wie in dem beigefügten schriftlichen Protokoll dargestellt an. Dieses System kann zur Durchführung einer konfokalen Scanning-Mikroendoskopie angepasst werden.

Indem Sie die Bühne durch eine Faserhalterung ersetzen, beachten Sie bitte den begleitenden Text oder die Details. Das fertige aufrechte konfokale Scanning-Mikroskop und das Mikroendoskop sollten wie hier gezeigt aussehen. Die Laser- und Emissionsstrahlen wurden als visuelle Hilfestellung eingezeichnet.

Während des Mikroendoskopiebetriebs hält eine Fasermontage die Bildfaser für Experimente an ihrem Platz. Diese Fasermontage könnte bei Bedarf leicht durch einen XY-Stage ersetzt werden. Eine aufrechte Mikroskopplattform, die hier gezeigt ist, zeigt ein repräsentatives Testbild eines kleinen Buchstabens M, der auf einer weißen Visitenkarte gedruckt ist, aufgenommen mit einer Framegrabberkarte mit Videosignalrate, um Bilder aus dem eingehenden Signal zu erzeugen. Gedeckt.

Das weiße Papier enthält Fluoreszenzstoffe, die leicht durch UV- und blaues Licht angeregt werden und dadurch einen hellen Hintergrund hinter dem dunklen Bereich erzeugen. Der Buchstabe M und ein Emissionsfilter mit einem Zentrum bei 515 Nanometern wurden gewählt, um diese Fluoreszenzemission zu erfassen. Eine geringfügige Verzerrung des Bildes ist insbesondere in der Nähe der seitlichen Bildränder erkennbar.

Diese Verzerrung ergibt sich aus dem sinusförmigen Abtastmuster des acht Kilohertz GVO-Spiegels und wird im beigefügten Dokument ausführlich erörtert. Dieser Film zeigt Beispiel-Daten mit Video-Rate, die durch Abtasten einer Visitenkarte gewonnen wurden. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein konfokales Scanning-Mikroskop mit Video-Rate aufbaut und justiert.

Beachten Sie, dass die Arbeit mit Laserlicht äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Entfernen aller reflektierenden Schmuckstücke sowie das Vermeiden von Arbeiten auf Augenhöhe mit der Strahlachse, während Sie dieses Verfahren durchführen.