Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive, In Vivo Gewebeanalyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die funktionelle Charakterisierung von in vivo Gewebe durch die Kombination von hochauflösenden Strukturinformationen mit quantitativen spektralen Daten. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Krebsbiologie beantworten, wie z.B. die Quantifizierung der Auswirkungen der Therapie auf die Mikrostruktur und die Durchblutung des Gewebes. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mit einer einzigen Sonde sowohl Bild- als auch Spektroskopiedaten vom selben Ort gesammelt werden können.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Magen-Darm-Krebstherapie, da die Sonde mit herkömmlichen Endoskopietechniken kompatibel ist. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da kleine Unregelmäßigkeiten bei der Sondenplatzierung die Datengenauigkeit erheblich beeinträchtigen können. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir erkannten, wie wichtig es ist, ein hochauflösendes bildgebendes Verfahren mit einer quantitativen Spektroskopie zu kombinieren.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Vorbereitungsschritte aufgrund der Komplexität sowohl der Konstruktion als auch der Kalibrierung schwer zu erlernen sind. Um mit dem Zusammenbau der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie des multimodalen Mikroendoskops zu beginnen, montieren Sie einen dichroitischen Spiegel mit 470 Nanometern in einem 30-Millimeter-Käfigwürfel. Befestigen Sie die Käfigmontagestangen an der Vorder-, Rechts- und Linksseite des Käfigwürfels.

Befestigen Sie einen spannungsfreien Sicherungsring an einer Käfig-Gewindeplatte und schrauben Sie einen Linsentubus in den Sicherungsring. Befestigen Sie eine weitere Käfigplatte an dem Objektivtubus, der mit der ersten Käfigplatte ausgerichtet ist. Befestigen Sie als Nächstes einen UV-verstärkten Aluminiumspiegel in einer rechtwinkligen Spiegelhalterung.

Befestigen Sie vier Stangen an der Vorderseite der Spiegelhalterung und zwei Stangen diagonal an der rechten Seite der Halterung. Schieben Sie den Linsentubus auf die linke Seite des Käfigwürfels. Verbinden Sie die rechte Seite der Spiegelhalterung mit der Objektivtubusbaugruppe.

Schieben Sie eine Z-Achsen-Verschiebungshalterung auf die rechte Seite der Baugruppe. Befestigen Sie ein 10-fach achromatisches Objektiv an der Translationshalterung. Befestigen Sie als Nächstes eine Faseradapterplatte an einer XY-Achsen-Translationsobjektivhalterung.

Schieben Sie die Halterung auf die Baugruppe vor der Objektivlinse. Befestigen Sie mit Sicherungsringen einen geeigneten Anregungsfilter und Emissionsfilter in den Linsentuben. Schrauben Sie den Anregungsfilter-Linsentubus in die Vorderseite des Käfigwürfels.

Und der Emissionsfilter-Objektivtubus steckt in die Vorderseite der rechtwinkligen Spiegelhalterung. Befestigen Sie mit Epoxidharz eine 455 Nanometer große LED an der Käfigplatte vor dem Anregungsfilter. Schieben Sie eine Käfigplatte vor jedes Filterlinsenrohr.

Befestigen Sie eine achromatische Doublet-Tubuslinse mit einem Sicherungsring in einem anderen Linsentubus, so dass der Pfeil an der Außenseite der Linse auf die Außengewindeseite des Objektivtubus zeigt. Befestigen Sie die Tubuslinse an der linken Käfigplatte, platzieren Sie eine weitere Käfigplatte vor der Tubuslinse. Befestigen Sie mit einem spannungsfreien Sicherungsring eine USB-Monochrom-Kamera an der Käfigplatte.

Um mit dem Zusammenbau der subdiffusen Reflexionsspektroskopie zu beginnen, befestigen Sie eine Käfigplatte mit Gewinde an der Vorderseite einer Wolfram-Halogenlichtquelle mit Epoxidharz. Setzen Sie vier Käfigmontagestangen in die Käfigplatte ein und schieben Sie eine Z-Achsen-Verschiebungshalterung auf die Stangen. Schrauben Sie eine 20-fach achromatische Objektivlinse in die Z-Achsen-Translationshalterung.

Verbinden Sie eine Faseradapterplatte mit einer Translationshalterung für die XY-Achse und schieben Sie die Halterung auf die Baugruppe vor der Objektivlinse. Befestigen Sie abschließend beide Baugruppen mit entsprechenden Montagevorrichtungen dicht beieinander auf einem optischen Tisch. Um mit dem Bau des Schaltgeräts für die Trennung des Quellendetektors zu beginnen, schrauben Sie eine SMA-Faseradapterplatte mit Außengewinde in einen Aluminium-Motorarm.

Befestigen Sie einen Motorarmadapter an der Rückseite des Motorarms. Schrauben Sie dann einen Schrittmotor in ein Motorgehäuse aus Aluminium. Schrauben Sie die Motorarmbaugruppe auf die Motorstange und ziehen Sie die Feststellschraube fest.

Schrauben Sie als Nächstes drei Faseradapterplatten in einen optischen Schalter und schrauben Sie dann die Frontplatte auf den optischen Schalter. Fädeln Sie die Schrittmotorstange durch das mittlere Loch des optischen Schalters. Platzieren Sie einen Schrittmotortreiber über der Mittellinie einer roten Platine ohne Polster.

Schließen Sie den Treiber an eine geeignete Stromversorgung und den Schrittmotor an. Befestigen Sie den optischen Schalter am optischen Tisch. Schließen Sie ein 550-Mikrometer-Patchkabel mit 0,22 na an den Motorarm an.

Schließen Sie das andere Ende an ein USB-Spektrometer an. Um die faseroptische Sonde anzuschließen, schließen Sie das zentrale 1-Millimeter-Bildfaserkabel an die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie-Modalitätsbaugruppe an. Befestigen Sie das linke 200-Mikrometer-Multimode-Kabel an der Modalitätsbaugruppe für die subdiffuse Reflexionsspektroskopie.

Fahren Sie von links fort und schließen Sie die restlichen Multimode-Kabel der Reihe nach an die linken, mittleren und rechten Adapter des optischen Schaltgeräts an. Um mit der Kalibrierung für das Experiment zu beginnen, schließen Sie alle USB-Peripheriegeräte an den Computer an. Schalten Sie alle Instrumente ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss der Wolfram-Halogenlampe geöffnet ist.

Schalten Sie dann die Raumbeleuchtung aus und schließen Sie andere Umgebungslichtquellen. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware. Lassen Sie das Gerät 30 Minuten lang laufen, bevor Sie mit der Kalibrierung fortfahren.

Setzen Sie einen diffusen Reflexionsstandard von 20 % in den unteren Bereich des Kalibriergeräts ein. Stecken Sie die faseroptische Sonde in den linken Schlitz des Geräts und stellen Sie den motorisierten optischen Schalter nach links, um das Mikrometer 374 als DS-Einstellung auszuwählen. Stellen Sie in der Software die Integrationszeit auf 500 Millisekunden ein.

Klicken Sie dann auf Spektrum erfassen, um mit der Erfassung von RMAX für dieses SDS zu beginnen. Wenn die Erfassung von RMAX abgeschlossen ist, speichern Sie das Spektrum in einem dafür vorgesehenen Ordner. Schließen Sie den Verschluss der Wolfram-Halogenlampe und erfassen Sie das R-Dunkelspektrum für dieses SDS.

Öffnen Sie den Verschluss, schieben Sie die Sonde in den richtigen Schlitz in der Kalibriervorrichtung und stellen Sie den motorisierten optischen Schalter auf die mittlere Position für die SDS-Einstellung von 730 Mikrometern. Erwerben Sie RMAX und RDARK für dieses SDS, um die Kalibrierung abzuschließen. Bestimmen Sie zunächst den geeigneten Hautbereich für die Datenerfassung.

Verwenden Sie einen gelben Highlighter als Pyraninquelle und färben Sie die ausgewählte Stelle leicht an. Um die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie zu starten, schalten Sie die 455-Nanometer-LED ein und schließen Sie den Verschluss der Wolfram-Halogenlampe. Platzieren Sie die faseroptische Sonde in sanftem Kontakt mit der Haut.

Bewegen Sie die Sonde über das Pyranin-gefärbte Gewebe, um die apikale Stromeinblicksarchitektur anzuzeigen. Stellen Sie in der Software eine geeignete Belichtungszeit und Verstärkung ein, um eine Bildsättigung zu vermeiden. Klicken Sie dann auf Bild erfassen, um ein statisches Bild zu erhalten.

Halten Sie die Sonde für die subdiffuse Reflexionsspektroskopie an Ort und Stelle. Schalten Sie die 455-Nanometer-LED aus und öffnen Sie den Verschluss der Wolfram-Halogenlampe. Wechseln Sie dann zur 374-Mikrometer-SDS-Einstellung auf der linken Seite.

Klicken Sie auf Spektren erfassen, um das R-Gewebespektrum für dieses SDB zu erfassen. Wechseln Sie dann in die mittlere Position und erfassen Sie das 730 Mikrometer große SDS R-Gewebespektrum. Öffnen Sie die Nachbearbeitungssoftware und klicken Sie auf Ausführen.

Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie die Kalibrierungsspektren, die In-vivo-Spektren und das hochauflösende Fluoreszenzbild aus, um das Gewebebild zu erhalten. Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie liefert ein scharfes, hochauflösendes Bild der Gewebestelle. Die Pyraninfärbung zeigt einzelne Keratinozytenumrisse.

Die Nachbearbeitungssoftware verwendet die Daten der subdiffusen Reflexionsspektroskopie, um die Hämoglobinkonzentration, die Melaninkonzentration und die Sauerstoffsättigung des Gewebes zu berechnen. Ein gutartiger melanozytärer Nävus wurde mit diesem multimodalen Mikroendoskop mit benachbartem normalem Hautgewebe verglichen. Der melanozytäre Nävus wies im Vergleich zu normalem Gewebe eine etwas niedrigere Hämoglobinkonzentration und eine leicht erhöhte Melaninkonzentration auf.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Wolfram-Halogenlampe 15 Minuten lang erwärmen zu lassen und die Instrumentierung vor der Datenerfassung mit einem Reflexionsnormal zu kalibrieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie die konfokale Mikroskopie oder die Multiphotonenmikroskopie verwendet werden, um subzelluläre Veränderungen in der Proteinstruktur oder im Stoffwechsel zu untersuchen.

Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher geebnet, die Beziehung zwischen Gewebedurchblutung und Mikrostruktur als Reaktion auf eine Chemotherapie zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein hybrides mikroendoskopisches Bildgebungs- und Spektroskopiegerät konstruiert und verwendet.