Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive,
17. Oktober 2016
Der Aufbau und die Verwendung eines multimodalen Mikroendoskops wird beschrieben, das oberflächliche Gewebebilddaten mit gewebephysiologischen Parametern wie Hämoglobinkonzentration, Melaninkonzentration und Sauerstoffsättigung koregistrieren kann. Diese Technik kann für die Beurteilung der Gewebestruktur und -perfusion nützlich sein und für die individuellen Bedürfnisse des Untersuchers optimiert werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht in der funktionellen Charakterisierung von lebendem Gewebe durch die Kombination hochauflösender struktureller Informationen mit quantitativen spektralen Daten. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Quantifizierung der Auswirkungen einer Therapie auf die Gewebemikrostruktur und Perfusion. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass mit einer einzigen Sonde sowohl Bild- als auch Spektroskopiedaten von derselben Stelle erfasst werden können.
Die Implikationen dieser Technik reichen bis in die Therapie von gastrointestinalen Krebserkrankungen, da die Sonde mit herkömmlichen endoskopischen Verfahren kompatibel ist. In der Regel werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da bereits geringe Unregelmäßigkeiten bei der Platzierung der Sonde die Datenaccuracy erheblich beeinträchtigen können. Die Idee zu dieser Methode kam uns erstmals, als uns die Bedeutung bewusst wurde, eine hochauflösende Bildgebungstechnik mit einer quantitativen Spektroskopiemethode zu kombinieren.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Vorbereitungsschritte aufgrund der Komplexität sowohl des Aufbaus als auch der Kalibrierung schwer zu erlernen sind. Um mit dem Zusammenbau der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie-Modalität des multimodalen Mikroendoskops zu beginnen, montieren Sie einen 470 Nanometer-Dichroischen Spiegel in einen 30 Millimeter Käfigwürfel. Befestigen Sie Käfigmontagerodern an der Vorderseite, rechten und linken Seite des Käfigwürfels.
Befestigen Sie einen spannungsfreien Haltering an einer Gewindefassungsplatte und schrauben Sie ein Objektivrohr in den Haltering. Befestigen Sie eine weitere Fassungsplatte am Objektivrohr, ausgerichtet mit der ersten Fassungsplatte. Befestigen Sie anschließend einen UV-verbesserten Aluminiumspiegel in einer rechtwinkligen Spiegelhalterung.
Befestigen Sie vier Stäbe an der Vorderseite der Spiegelhalterung und zwei Stäbe diagonal an der rechten Seite der Halterung. Stecken Sie die Linsenrohrbaugruppe auf die linke Seite des Käfigwürfels. Verbinden Sie die rechte Seite der Spiegelhalterungsbaugruppe mit der Linsenrohrbaugruppe.
Schieben Sie eine Z-Achsen-Translationshalterung auf die rechte Seite der Baugruppe. Befestigen Sie eine 10x-Achromat-Objektivlinse an der Translationshalterung. Befestigen Sie anschließend eine Faseradapterplatte an einer XY-Achsen-Translationslinse.
Schieben Sie die Halterung vor die Objektivlinse in die Montageeinheit. Befestigen Sie mithilfe von Sicherungsringen einen geeigneten Anregungsfilter und Emissionsfilter in den Linsenrohren. Schrauben Sie das Linsenrohr mit dem Anregungsfilter an die Vorderseite des Cages.
Und die Emissionsfilter-Linsenröhre in die Vorderseite der rechten Spiegelhalterung einsetzen. Mithilfe von Epoxidharz eine 455 Nanometer LED an der Käfigplatte vor dem Anregungsfilter befestigen. Eine Käfigplatte vor jede Filterlinsenröhre schieben.
Befestigen Sie mit einem Sicherungsring eine achromatische Doppelinlett-Objektivlinse in einem weiteren Objektivrohr, sodass der Pfeil auf der Außenseite der Linse zur außen gewindeten Seite des Objektivrohrs zeigt. Bringen Sie die Tubuslinse an der linken Käfigplatte an und platzieren Sie eine weitere Käfigplatte vor der Tubuslinse. Befestigen Sie mit einem spannungsfreien Sicherungsring eine USB-Monochromkamera an der Käfigplatte.
Um mit dem Zusammenbau der Sub-Diffusreflexionsspektroskopie-Modalität zu beginnen, befestigen Sie eine gewindete Käfigplatte mit Epoxidharz an der Vorderseite einer Wolfram-Halogen-Lichtquelle. Stecken Sie vier Käfigsystemstangen in die Käfigplatte und schieben Sie eine Z-Achsen-Translationshalterung auf die Stangen. Schrauben Sie eine 20x-Achromat-Objektivlinse in die Z-Achsen-Translationshalterung ein.
Verbinden Sie eine Faseradapterplatte mit einer XY-Verschiebemontage und schieben Sie die Montage vor die Objektivlinse. Befestigen Sie abschließend beide Baugruppen mithilfe geeigneter Halterungen dicht beieinander auf einem optischen Tisch. Um mit dem Aufbau der Vorrichtung zur Umschaltung der Quell-Detektor-Trennung zu beginnen, schrauben Sie eine außen gewindete SMA-Faseradapterplatte in einen Aluminium-Motorarm.
Befestigen Sie einen Motorarm-Adapter an der Rückseite des Motorarms. Schrauben Sie dann einen Schrittmotor in ein Aluminium-Motorgehäuse ein. Schrauben Sie die Motorarmbaugruppe auf die Motorstange und ziehen Sie die Verriegelungsschraube fest.
Schrauben Sie als Nächstes drei Faseradapterplatten in einen optischen Schalter und befestigen Sie dann die Frontplatte am optischen Schalter. Führen Sie die Stange des Schrittmotors durch das mittlere Loch des optischen Schalters. Platziere einen Schrittmotortreiber über die Mittellinie einer steckbaren roten Platine.
Verbinden Sie den Treiber mit einer geeigneten Stromversorgung und dem Schrittmotor. Befestigen Sie den optischen Schalter am optischen Tisch. Bringen Sie ein 550-Mikrometer-0,22-NA-Patchkabel am Motorarm an.
Verbinden Sie das andere Ende mit einem USB-Spektrometer. Um die faseroptische Sonde anzuschließen, befestigen Sie das zentrale 1-Millimeter-Bildfaserkabel an der Baugruppe für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie. Befestigen Sie das linke 200-Mikrometer-Multimode-Kabel an der Baugruppe für die subdiffuse Reflexionsspektroskopie.
Fahren Sie fort, indem Sie von links beginnend die verbleibenden Multimode-Kabel der Reihe nach mit dem linken, mittleren und rechten Adapter der optischen Schaltvorrichtung verbinden. Um die Kalibrierung für das Experiment zu starten, schließen Sie alle USB-Peripheriegeräte an den Computer an. Schalten Sie alle Geräte ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss der Wolfram-Halogen-Lampe geöffnet ist.
Danach schalten Sie das Raumlicht aus und schließen Sie andere Quellen für Umgebungslicht. Öffnen Sie die Software zur Datenerfassung. Lassen Sie die Ausrüstung vor der Kalibrierung 30 Minuten lang laufen.
Platzieren Sie einen 20 % streuenden Reflexionsstandard in den unteren Bereich der Kalibriervorrichtung. Führen Sie die faseroptische Sonde in den linken Schlitz der Vorrichtung ein und stellen Sie den motorisierten optischen Schalter nach links, um die 374 Mikrometer als DS-Einstellung auszuwählen. Stellen Sie in der Software die Integrationszeit auf 500 Millisekunden ein.
Klicken Sie anschließend auf „Spektrum erfassen“, um die Erfassung von RMAX für diesen SDS zu starten. Sobald die Erfassung von RMAX abgeschlossen ist, speichern Sie das Spektrum in einem dafür vorgesehenen Ordner. Schließen Sie den Verschluss der Wolfram-Halogen-Lampe und erfassen Sie das Dunkelspektrum (R dark) für diesen SDS.
Öffnen Sie den Verschluss, bewegen Sie die Sonde in die rechte Buchse des Kalibriergeräts und stellen Sie den motorisierten optischen Schalter auf die mittlere Position für die SDS-Einstellung von 730 Mikrometern. Erfassen Sie RMAX und RDARK für diese SDS, um die Kalibrierung abzuschließen. Bestimmen Sie zunächst die geeignete Hautstelle für die Datenerfassung.
Verwenden Sie einen gelben Textmarker als Pyranin-Quelle und färben Sie den gewählten Bereich leicht an. Schalten Sie zur Durchführung der Fluoreszenzmikroskopie mit hoher Auflösung die 455 Nanometer-LED ein und schließen Sie den Verschluss der Wolfram-Halogenlampe. Bringen Sie die faseroptische Sonde vorsichtig in Kontakt mit der Haut.
Bewegen Sie die Sonde über das mit Pyranin gefärbte Gewebe, um die apikale Stromarchitektur sichtbar zu machen. Stellen Sie in der Software eine geeignete Belichtungszeit und Verstärkung ein, um eine Bildübersteuerung zu vermeiden. Klicken Sie anschließend auf „Bild aufnehmen“, um ein Standbild zu erhalten.
Halten Sie die Sonde für die subdiffuse Reflexionsspektroskopie an Ort und Stelle. Schalten Sie die 455 Nanometer-LED aus und öffnen Sie den Verschluss der Wolfram-Halogenlampe. Wechseln Sie dann auf der linken Seite zur SDS-Einstellung mit 374 Mikrometer.
Klicken Sie auf „Spektren aufnehmen“, um das R-Gewebe-Spektrum für diesen SDS aufzunehmen. Wechseln Sie dann in die mittlere Position und nehmen Sie das R-Gewebe-Spektrum des 730-Mikrometer-SDS auf. Öffnen Sie die Nachbearbeitungssoftware und klicken Sie auf „Ausführen“.
Wenn dazu aufgefordert, wählen Sie die Kalibrierungsspektren, die In-vivo-Spektren und das hochauflösende Fluoreszenzbild aus, um das Gewebebild zu erhalten. Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie liefert ein scharfes, hochauflösendes Bild der Gewebestelle. Die Pyranin-Färbung zeigt die Umrisse einzelner Keratinozyten.
Die Nachbearbeitungssoftware nutzt die Sub-Diffusreflexions-Spektroskopiedaten, um die Hämoglobinkonzentration, Melaninkonzentration und die Gewebe-Sauerstoffsättigung zu berechnen. Ein benigner melanozytärer Nävus wurde mit angrenzendem normalem Hautgewebe mittels dieses multimodalen mikroskopischen Endoskops verglichen. Der melanozytäre Nävus wies im Vergleich zu normalem Gewebe eine leicht verminderte Hämoglobinkonzentration und eine leicht erhöhte Melaninkonzentration auf.
Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Während des Versuchs ist es wichtig, die Wolfram-Halogen-Lampe 15 Minuten lang aufwärmen zu lassen und die Instrumente vor der Datensammlung mit einem Reflexionsstandard zu kalibrieren. Nach diesem Verfahren können andere Techniken wie die konfokale Mikroskopie oder die Multiphotonen-Mikroskopie verwendet werden, um subzelluläre Veränderungen in der Proteinstruktur oder im Stoffwechsel zu untersuchen.
Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik Forschern den Weg geebnet, den Zusammenhang zwischen Gewebedurchblutung und Mikrostruktur als Reaktion auf eine Chemotherapie zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein hybrides mikroskopisches endoskopisches Bildgebungs- und Spektroskopiegerät aufbaut und verwendet.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
In diesem Artikel wird eine multimodale, faseroptische Mikroendoskopie-Technik vorgestellt, die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung mit diffuser Reflexionsspektroskopie zur in-vivo-Gewebeanalyse kombiniert. Der integrierte Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung der mikroskopischen Gewebearchitektur und eine quantitative Beurteilung physiologischer Parameter, demonstriert am menschlichen Hautgewebe. Das Protokoll beschreibt detailliert den Aufbau der Sonde, deren Kalibrierung sowie die Datenaufnahme und stellt damit ein umfassendes Werkzeug zur funktionellen Gewebecharakterisierung bereit.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biomedizinische Technik
- Optische Bildgebung
- Spektroskopie
- Krebisbiologie
Hintergrund
- Die traditionelle Mikroendoskopie mit Faserbündeln ermöglicht eine nichtinvasive in-vivo-Gewebeanalyse mittels Bildgebung oder Spektroskopie.
- Die hochauflösende Fluoreszenz-Mikroendoskopie visualisiert die mikroskopische Gewebearchitektur und kann Neoplasien von nicht-neoplastischem Gewebe in Echtzeit unterscheiden.
- Die diffuse Reflexions-Spektroskopie quantifiziert physiologische Parameter wie Hämoglobin, Melanin und Sauerstoffsättigung.
- Die Kombination dieser Modalitäten in einer einzigen Sonde ermöglicht eine umfassendere Beurteilung des Gewebeszustands.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Demonstration einer hybriden optischen Sonde, die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung und diffuse Reflexionsspektroskopie kombiniert.
- Ermöglichung der ko-registrierten strukturellen und funktionellen Analyse von lebendem Gewebe.
- Bereitstellung eines Protokolls zur Konstruktion, Kalibrierung und Anwendung der multimodalen Sonde.
Verwendete Methoden
- Konstruktion einer faseroptischen Sonde, die die Modalitäten der Fluoreszenz-Mikroendoskopie und der diffusen Reflexionsspektroskopie kombiniert.
- Montage der optischen Komponenten, einschließlich dichroischer Spiegel, Objektivlinsen, Filter, LEDs und Spektrometer.
- Kalibrierung mithilfe von Diffusreflexionsstandards und softwaregestützter Datenerfassung.
- In-vivo-Demonstration an menschlicher Haut mit Pyranin-Färbung zur Fluoreszenzbildgebung und spektraler Analyse physiologischer Parameter.
Hauptergebnisse
- Die Sonde gewann erfolgreich hochauflösende Bilder von apikalen Hautkeratinozyten und registrierte diese gleichzeitig mit quantitativen Spektraldaten.
- Aus derselben Gewebestelle wurden Hämoglobinkonzentration, Melaninkonzentration und Sauerstoffsättigung extrahiert.
- Der Vergleich zwischen einem benignen melanocytären Nävus und normaler Haut zeigte eine geringere Hämoglobin- und eine höhere Melaninkonzentration im Nävus.
- Die Technik kann nach Beherrschung in weniger als einer Stunde durchgeführt werden und ist mit endoskopischen Verfahren kompatibel.
Schlussfolgerungen
- Die multimodale Sonde ermöglicht eine umfassende, gemeinsam registrierte strukturelle und funktionelle Gewebeanalyse in vivo.
- Sie ist für den handgehaltenen Einsatz oder endoskopisch in verschiedenen Organsystemen anwendbar.
- Weitere klinische Forschung ist erforderlich, um ihre Nützlichkeit bei verschiedenen epithelialen Erkrankungszuständen zu validieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Kombination hochauflösender Fluoreszenzbildgebung mit diffuser Reflexionsspektroskopie in einer einzigen Mikroendoskopie-Plattform auf Basis eines Faserbündels ermöglicht eine nichtinvasive, in-vivo-Gewebeanalyse mit strukturellen sowie quantitativen physiologischen Erkenntnissen. Dieser multimodale Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Gewebecharakterisierung und unterstützt frühe Entdeckungen sowie Übergänge in der translationsmedizinischen Forschung. Die Kompatibilität der Plattform mit endoskopischen Arbeitsabläufen macht sie zu einer wiederverwendbaren Methode zur funktionellen Gewebewertung in unterschiedlichen Organsystemen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Untersuchung der Gewebemikrostruktur und -perfusion in vivo.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung durch die gleichzeitige Erfassung mikroarchitektonischer und physiologischer Daten.
- Erleichtert die verlässliche Unterscheidung von neoplastischem und nicht-neoplastischem Gewebe.
- Bietet eine Grundlage für mechanistische Studien der Wirkung von Therapien auf die Gewebebiologie.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Gewebemodelle für die nachgeschaltete Wirkstoffevaluation vor, indem Bildgebungs- und Spektroskopieergebnisse integriert werden.
- Standardisiert die Erfassung quantitativer physiologischer Parameter wie Hämoglobin- und Melaninkonzentration.
- Ermöglicht reproduzierbare, standortgenaue Datenerhebung für die Assay-Entwicklung und die Vorbereitung von Screening-Verfahren.
- Unterstützt die Skalierbarkeit der Plattform für die Analyse mehrerer Organe oder Untersuchungsstandorte.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt die Abbildung mikroarchitektonischer Strukturen mit der quantitativen Bestimmung physiologischer Biomarker für krankheitsrelevante Modelle.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem funktionelle Gewebeuntersuchungen in vivo unterstützt werden.
- Liefert risikoadjustierte Daten für Entscheidungen über die Weiterentwicklung in translationalen Forschungspipelines.
- Erleichtert die Untersuchung der Gewebereaktion auf therapeutische Interventionen in präklinischen Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese multimodale Plattform verbindet die frühe Entdeckung, die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und die präklinische Forschung, indem sie die gleichzeitige strukturelle und funktionelle Gewebeanalyse in vivo ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Quantifizierung der Therapiewirkungen auf die Gewebemikrostruktur und -durchblutung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Standardisierung von Assays und Beurteilung von Substanzen.
- Analytik: Bietet integrierte Bildgebungs- und spektrale Auswertungen für eine robuste Vergleichbarkeit von Gewebezuständen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Einbindung in biomarkerbasierte Studien und unterstützt die Validierung präklinischer Modelle.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine flexible, endoskopisch kompatible Plattform bereit, die an verschiedene Organsysteme und Forschungsanforderungen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Gewebeanalyse.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der in-vivo-Gewebekennzeichnung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz, indem umfassende Gewebedaten frühzeitig in der Pipeline bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Entdeckungs- und translationsorientierten Programmen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in optischer Bildgebung, Spektroskopie und Sondenkalibrierung.
- Benötigt Zugang zu spezialisierten Messgeräten und analytischer Infrastruktur.
- Setzt eine strenge, übergreifende Standardisierung zwischen Teams für Datenerfassung und -analyse voraus.
- Einsatz über verschiedene Gewebetypen und Organsysteme hinweg möglich, sofern geeignete Kalibrierung und Validierung erfolgen.
- Die Präzision der Sondenplatzierung und -kalibrierung ist entscheidend für die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Construction of the Fluorescence Microscopy and Reflectance Spectroscopy Modalities
4:16
Construction of the Multimodal Microendoscope
5:53
Sub-diffuse Reflectance Spectroscopy Modality Calibration
7:23
In Vivo Data Acquisition from Human Skin
8:52
Results: Co-registered Tissue Structural and Physiological Parameter Data
9:38
Conclusion
